Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Enterochromaffin (EC) клетки составляют небольшую часть желудочно-кишечного тракта эпителиальных клеток. EC клетки электрически возбудимых и освобождение серотонина, но трудности в культивировании и выявления EC клетки имеют ограниченный физиологические исследования. Представленные здесь метод устанавливает основной культуры модель для изучения единичных клеток EC по электрофизиологии.
Enterochromaffin (EC) клетки в эпителии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) составляют самая большая субпопуляция enteroendocrine клеток. Как специализированные Сензорные клетки клетки EC смысл Люминал стимулы и конвертировать их в серотонина (5-hyroxytryptamine, 5-HT) релиз события. Однако электрофизиологии эти клетки плохо понимают, потому что они трудны для культуры и определения. Метод, представленные в этой бумаги очертания первичной EC клеточных культур оптимизирован для одной ячейки электрофизиологии. Этот протокол использует репортером трансгенных голубой флуоресцентный белок (СЛП) для идентификации клеток мыши EC в смешанных первичных культур, развитии подход для получения высокого качества записи клеточных электрофизиологии в режимах напряжения и тока клещи.
Желудочно-кишечного эпителия (Ги) является разнообразное сообщество, состоящее из нескольких типов клеток. Enteroendocrine клетки составляют примерно 1% от всех эпителиальных клеток, и клетки enterochromaffin (EC) являются крупнейшим enteroendocrine клеток населения1. Недавние исследования показывают, что enteroendocrine2 и3,EC4 клетки электрически возбудимых. Мы заинтересованы в понимании основной EC клеток электрофизиологии. Таким образом целью данного исследования было установить первичных культур клеток EC, оптимизированный для клеточных электрофизиологии.
Существующие ячейки EC линии, которые производят и выделяют 5-HT (например, QGP-15, Бон6,7KRJ-1) и были использованы для изучения электрофизиологии5,8 обычно создаются из увековечен опухолевой тканей. В то время как информация, полученные от этих клеточных линий ценные5,8, исследования электрофизиологии главной ячейки необходимы для правильного понимания физиологии клетки ЕС. Электрофизиологии первичных клеток ЕС требует изоляции и культуры одного эпителиальных клеток, которая ограничивается низкой жизнеспособности эпителиальных культур.
Метод культуры, представленные в настоящем исследовании опирается на трансгенных мышей с дневно обозначенные EC клетки, как Tph1-CFP9, используемые в данном исследовании. Этот метод оптимизирует смешанных начальных эпителиальных культур разработаны ранее10 2,для одной ячейки электрофизиологии3. Предыдущие методы используемые комбинации трипсина/ЭДТА плюс коллагеназы A или ЭДТА и DTT для ферментативного пищеварения и используемые градиенты плотности специально изолировать и культуры свинка11 и крыса EC клетки12. Совсем недавно кишечные organoids были созданы и механически нарушается для электрофизиологических записи4. Культур, используя эти методы хорошо подходят серотонина релиз эксперименты, RT-ПЦР анализа и, хотя они могут быть использованы для электрофизиологии, зависят от успеха времени органоид поколения, градиенты плотности для выявления EC клетки и Сотовый деструктивные последствия трипсина и ЭДТА. Напротив протокол, описанные здесь повышает ферментативную и механических методов лечения, оптимизирует культивирования условий и упрощает процедуры для производства одного и здоровой клетки EC подходит для высоких сотовых стандартов, необходимых для электрофизиологии.
Этот метод будет полезным для ученых, которые хотят работать на основной EC клетки в смешанных культур, а не увековечен культур и хотят расследовать электрофизиологии одиночных клеток. Однако она может оказаться менее подходящим для изучения клеточных популяций, требующих сортировки или долгосрочный культур, которые требуют выживания прошлых 72 ч.
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) клиники Майо. Часть культуры главной ячейки этот протокол основан на опубликованных ранее методы, которые могут ссылаться для дальнейших деталей10. Все экспериментальные процедуры должны быть одобрены (IACUC), и все эксперименты должны выполняться в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил.
1. Культура подготовка
2. ткань изоляции
3. ферментативные и механические пищеварение
4. клеточная культура
5. Подготовка EC клеток для клеточных электрофизиологии
6. вся ячейка электрофизиологии EC клеток от основной культуры
Культуры:
Основная мышиных эпителиальных клеток, сделанные из трансгенные модели Tph1-CFP придают блюдам после 4 часов и готовы для физиологических опытов между 24-72 ч. Когда культура условия не оптимизированы, эпителиальных клеток культуры состоял из больших с?...
Полностью понимая EC клеточной функции требует высокого качества первичной культуре метод для создания клетки для клеточных электрофизиологии. Основных культур эпителия GI традиционно затруднен из-за низкой выживаемости. Облегчение этот смешанным фактором, нынешний метод дает культу?...
Нет
Авторы благодарят г-жа Линдсей Басби для административной помощи и г-н Роберт Хайет из Майо клиника отдел инженерного дизайна и 3D печати вставить блюдо культуры. Эта работа была поддержана NIH K08 AB (DK106456), пилот и осуществимости Грант АБ из клиники Майо центр для клеток сигнализации в гастроэнтерологии (низ P30DK084567) и 2015 американской гастроэнтерологической ассоциации исследования ученый премии (Ага RSA) AB и низ R01 GF (DK52766).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm x 15 mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
1,000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
R6101 | Dow Corning | ||
6 mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
3 mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
Electrophysiology Equipment | |||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены