Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.
Enterochromaffinen (EG) Zellen in der gastro-intestinale (GI) Epithel bilden die größte Subpopulation von Enteroendocrine Zellen. Als spezialisierte Sinneszellen EC-Zellen spüren luminalen Reize und wandeln sie in Serotonin (5-Hyroxytryptamine, 5-HT) Release Events. Allerdings ist die Elektrophysiologie dieser Zellen schlecht verstanden, weil sie schwer zu Kultur und zu identifizieren sind. In diesem Papier Umrisse primären EG Zellkulturen vorgestellte Methode optimiert für einzelne Zelle Elektrophysiologie. Dieses Protokoll nutzt einen transgene Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) Reporter um EG Mauszellen in primären Mischkulturen, Förderung des Ansatzes auf die Erlangung von qualitativ hochwertigen Aufnahmen der ganzen Zelle Elektrophysiologie in Spannung und Strom-Klemme Modi zu identifizieren.
Das gastro-intestinale (GI) Epithel ist eine vielfältige Gemeinschaft, bestehend aus mehreren Zelltypen. Enteroendocrine Zellen umfassen etwa 1 % aller epithelialen Zellen, und enterochromaffinen (EG) Zellen sind die größten Enteroendocrine Cell Bevölkerung1. Neuere Studien zeigen, dass Enteroendocrine2 und EG3,4 Zellen elektrisch erregbar sind. Wir interessieren uns für das Verständnis der primären EG Zelle Elektrophysiologie. Somit war der Zweck dieser Studie primären EG Zellkulturen für ganze Zelle Elektrophysiologie optimiert.
Bestehende EG-Zelle, die Linien, die produzieren und sezernieren 5-HT (z. B. QGP-15, BON6, KRJ-1-7) und wurden verwendet, um die Elektrophysiologie5,8 prüfen in der Regel aus generiert werden verewigt neoplastischen Gewebe. Zwar die Informationen von diesen Zelllinien wertvolle5,8, sind Studien der Primärzelle Elektrophysiologie notwendig, um richtig zu verstehen, EG Zellphysiologie. Die Elektrophysiologie des primären EG-Zellen erfordert die Isolierung und Kultur einzelner epithelialen Zellen, die durch geringe Tragfähigkeit des epithelialen Kulturen begrenzt wurde.
In dieser Studie vorgestellten Kultur-Methode stützt sich auf Transgene Mäuse mit Gewebekulturen beschrifteten EG-Zellen, wie Tph1-GFP9, in dieser Studie verwendet. Die Methode optimiert gemischte primäre epitheliale Kulturen entwickelte bereits2,10 für einzelne Zelle Elektrophysiologie3. Bisherige Methoden verwendet Kombinationen von Trypsin/EDTA plus Collagenase A oder EDTA und DVB-t für die enzymatische Verdauung und Dichtegradienten speziell isolieren und Kultur Meerschweinchen11 und Ratte EG Zellen12. Vor kurzem wurden Darm Organellen generiert und mechanisch für elektrophysiologische Aufnahmen4gestört. Kulturen, die mit diesen Methoden eignen sich gut für Serotonin lassen Sie Experimente, RT-qPCR Analyse und, während sie für Elektrophysiologie, verwendet werden können sind angewiesen auf den Erfolg der Zeit raubende organoide Generation, Dichtegradienten, EG-Zellen zu identifizieren und die zelluläre störende Wirkung von Trypsin und EDTA. Im Gegensatz dazu das hier beschriebene Protokoll verbessert die enzymatische und mechanische Behandlungen Kultivierung Bedingungen optimiert und rationalisiert Verfahren um Einzel- und gesunde EG-Zellen für die hohen zellulären Standards für Elektrophysiologie benötigt zu produzieren.
Diese Methode ist nützlich für Wissenschaftler, die primären EG-Zellen in Mischkulturen statt verewigt Kulturen arbeiten möchten und die Elektrophysiologie einzelner Zellen untersuchen möchten. Es könnte jedoch weniger geeignet für das Studium Zell-Populationen, die Sortier- oder langfristige Kulturen benötigen, die letzten 72 h Überleben benötigen.
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Mayo-Klinik genehmigt. Der Primärzelle Kultur Teil dieses Protokolls basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden, auf die verwiesen werden können für weitere Details10. Alle experimentelle Verfahren müssen von der (IACUC) genehmigt werden, und alle Experimente müssen im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden.
1. Kultur-Vorbereitung
(2) Gewebe isoliert
(3) enzymatische und mechanische Verdauung
4. die Zellkultur
5. Vorbereitung des EG-Zellen für die ganze Zelle Elektrophysiologie
6. ganze Zelle Elektrophysiologie der EC-Zellen aus Primärkultur
Kulturen:
Primären murine Epithelzellen gebildet aus einem transgenen Tph1-GFP-Modell beimessen Gerichte nach 4 Stunden und sind bereit für physiologische Experimente zwischen 24 bis 72 h. Wenn Kulturbedingungen nicht optimiert wurde, bestand die Epithelzelle Kultur große Horste, schwebenden zelltrümmer, beschädigte Membranen und GFP-schwach in den EG-Zellen (Abb. 1A). Kulturen, die für Elektrophysiologie optimiert w...
EG-Zell-Funktion vollständig zu verstehen erfordert eine qualitativ hochwertige Primärkultur Methode, Zellen für die ganze Zelle Elektrophysiologie zu generieren. Primärkulturen von GI Epithel hatte traditionell schwierig, da niedrige überleben. Linderung dieser verwirrende Faktor, ergibt das vorliegende Verfahren Kulturen der singulären EG Zellen entweder kleiner oder großer Darm, die für mehrere Tage überleben können.
Wir fanden, dass die folgenden kritischen zur Verbesserung der Q...
Keine
Die Autoren danken Frau Lyndsay Busby für Amtshilfe und Herr Robert Highet von Mayo Clinic Division of Engineering bei Design und 3D Druck des Kultur-Gericht-Einsatzes. Diese Arbeit wurde von NIH K08 AB (DK106456), Pilot und Machbarkeit Grant an AB von Mayo Clinic Center für Zelle signalisieren in Gastroenterologie (NIH P30DK084567) und 2015 amerikanischen gastroenterologischen Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB und NIH unterstützt. R01, GF (DK52766).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
R6101 | Dow Corning | ||
6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
Electrophysiology Equipment | |||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten