Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، أسلوب الذي تنتج الفخاخ الضخمة خارج الخلية العَدلات (شبكات) العَدلات منخفض الكثافة البشرية (LDN)، تعافي من سائل الغسل البريتوني بعد العملية الجراحية، وفخ كفاءة الخلايا السرطانية الحرة التي تنمو في وقت لاحق.

Abstract

تفعيل العَدلات الإصدار العَدلات خارج الخلية الفخاخ (شبكات)، الذي يمكن التقاط وتدمر الميكروبات. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن شبكات متورطة في عمليات الأمراض المختلفة، مثل الانبثاث المرض وتجلط الدم والأورام الذاتية. وهنا نعرض تقنية مفصلة في المختبر للكشف عن النشاط الصافي أثناء محاصرة الخلايا السرطانية الحرة، التي تنمو بعد الإلحاق لشبكات. أولاً، جمعنا العَدلات منخفض الكثافة (LDN) من سائل الغسل البريتوني بعد العملية الجراحية من المرضى الذين خضعوا لاباروتوميس. استزراع القصيرة الأجل من LDN أسفرت عن تشكيل صافي الضخمة التي كانت تصور مع الأخضر الفلوريسنت النووية وكروموسوم كونتيرستين. بعد الحضانة المشتركة لخطوط الخلايا البشرية سرطان المعدة MKN45 "و" أوكوم-1 "و" نوجك-4 مع الشباك، حوصر العديد من الخلايا السرطانية بالشباك. في وقت لاحق، المرفقات ألغى تماما بتدهور شبكات مع "الوقت الفاصل بين أولاً الدناز" الفيديو كشفت أن الخلايا السرطانية قد وقعت في شرك الشباك لم يمت ولكن بدلاً من ذلك نما بقوة في ثقافة مستمرة. يمكن تطبيق هذه الأساليب للكشف عن التفاعلات لاصقة بين الشباك وأنواع مختلفة من الخلايا والمواد.

Introduction

عادة يتم فصل polymorph العَدلات النووية في تعميم الدم من الخلايا وحيدات النوى من خلال أسلوب إعداد التدرج الكثافة. بيد أن بعض العَدلات المعروف العَدلات منخفض الكثافة (LDN)، مع تعمل CD11b(+)، CD15(+)، CD16(+)، و CD14(-)، المنقي يشترك مع الخلايا وحيدات النوى. العدد النسبي ل LDN زيادة كبيرة في مختلف الحالات المرضية بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية1،2، الانتان3و4،السرطان5. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن LDN فئة متميزة فينوتيبيكالي ووظيفيا من العَدلات6. تجدر الإشارة إلى أن LDN في تعميم الدم أكثر احتمالاً لإنتاج العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) من الكثافة الطبيعية العَدلات2،7. شبكات الهياكل الشبيهة بالويب تتألف من الأحماض النووية، هيستونيس، البروتياز، والبروتينات الحبيبية وسيتوسوليك، وأنهم يمكن أن كفاءة الأجهزة وتدمير8من مسببات الأمراض.

في الآونة الأخيرة، أظهرت شبكات لالتقاط ليس فقط الجراثيم، ولكن أيضا الصفائح الدموية وتعميم الخلايا السرطانية التي يمكن أن تساعد في خثرة تشكيل9 والورم الانبثاث10،11. ومع ذلك، أن الآليات الجزيئية وراء لاصقة التفاعلات بين شبكات والصفائح الدموية أو الخلايا السرطانية لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة، كشفت مقايسة التصاق في المختبر أن خلايا سرطان الدم النقوي (K56212) وخلايا سرطان الرئة (A54913) إرفاق إلى شبكات عبر integrins β1 و β3. الكتاب يستخدم صافي رصيد المعزولة من العَدلات وتنشيطه بواسطة phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ك الركيزة التصاق14. على الرغم من أن هذا الفحص يتيح الكشف عن التفاعل الحقيقي مع مكونات صافي في غياب العَدلات، والقول ما إذا كان "الخلية الحرة الأوراق المالية الصافية" معزول بواسطة الطرد المركزي عالية السرعة يحتفظ بنية الجزيئية متطابقة لشبكات إنتاج في فيفو. في الآونة الأخيرة، وجدنا أن السائل البريتوني الغسل بعد عملية جراحية في البطن الواردة LDN ناضجة كثيرة، وإنشاء شبكات واسعة النطاق، وتعلق على الخلايا السرطانية تسبب الانبثاث البريتوني15. في هذه الدراسة، درسنا بنجاح التصاق الخلايا السرطانية لشبكات سليمة دون أي تلاعب المادية. وهنا نعرض تفاصيل تقنية للكشف عن التفاعلات لاصقة بين شبكات وخلايا الورم مجاناً.

Protocol

أقرت "المؤسسية استعراض مجلس جيتشي الطبية جامعة" LDN وتم الحصول عليها من المرضى المسجلين في هذه الدراسة.

1-عزل LDN من لافاجيس التجويف البطني والكشف عن صافي

  1. الحصول على عينة
    1. ضخ 1,000 مل من المحلول الملحي معقمة طبيعية مباشرة في تجويف البطن قبل إغلاق الجرح في المرضى الذين خضعوا لعملية جراحية في البطن بسبب الأورام الخبيثة في الجهاز الهضمي.
      ملاحظة: تم الحصول على عينات من المرضى الذين خضعوا جاستريكتومي أو كوليكتومي، أو اسوفاجيكتومي دون تحيز على أساس السن أو الجنس. نقل في حاوية المحلول الملحي وسكب في البطن كله خلال دقيقة واحدة. هذا يتم بشكل روتيني كغسيل البريتوني بعد العمل الجراحي دون آثار كبيرة على المرضى.
    2. الغسل التجويف البطني على نطاق واسع على الأقل 1 دقيقة.
      ملاحظة: من المستحسن أن السوائل التي غرست ببطء آثار أيديهم الجراح حيث تكون العينات موحدة.
    3. استعادة 200 مل سائل الغسل مع أربعة 50 مل المحاقن.
      ملاحظة: في بعض الأحيان يستخدم موصل مطاط لتناول السوائل.
  2. إجراء تنقية البريتوني LDN استخدام المحببات ماب محددة، CD66b16.
    ملاحظة: نظراً لأن الطبقة المتوسطة بعد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي يحتوي على العديد من الخلايا وحيدات النوى، أنجز اختيار إيجابي من العَدلات polymorph استخدام ماب CD66b.
    1. نقل السوائل الغسل البريتوني لأنبوب 50 مل.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، تمرير السوائل من خلال مرشح نايلون 100 ميكرون لإزالة الشوائب.
    2. الطرد المركزي في السائل البريتوني في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت
    3. ريسوسبيند الكريات في 5 مل من برنامج تلفزيوني مع يدتا 0.02 في المائة.
    4. تراكب 5 مل تعليق خلية في حل متدرج كثافة 3 مل بعناية.
    5. الطرد المركزي في 1,700 س ز لمدة 15 دقيقة في RT دون أي فواصل.
    6. الحصاد في ~ 2-3 مل محلول يحتوي على الطبقات المتوسطة (الشكل 1A) باستخدام ماصة ومزجها مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مع يدتا 0.02 في المائة.
    7. الطرد المركزي في السائل البريتوني في 400 غرام x لمدة 7 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
    8. إضافة آخر 10 مل من برنامج تلفزيوني مع يدتا 0.02 في المائة، وأجهزة الطرد المركزي في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية.
    9. حل بيليه الخلية (1 × 107) في 60 ميليلتر من المخزن المؤقت لعدة فصل الخلية المغناطيسية.
    10. إضافة 20 ميليلتر من كتلة Fc للكريات واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    11. إضافة 20 ميليلتر لمكافحة--CD66b مترافق مع ميكروبيدس واحتضانها 10 دقائق إضافية عند 4 درجة مئوية.
    12. أغسل وإعادة تعليق الكريات في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.
    13. تطبيق تعليق خلية عمود مغناطيسية في المجال المغناطيسي لفاصل مغناطيسي مناسب وجمع من خلال تدفق المحتوية على CD66b(-) الخلايا عن طريق الغسيل العمود مع 15 مل من المخزن المؤقت.
    14. إزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وفورا طرد الخلايا CD66b(+) مغناطيسيا المسمى بشدة دفع المكبس إلى العمود.
      ملاحظة: السكان خلية CD66b(+) تتألف في معظمها من العَدلات كما يحدده تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية التي تشير إلى أن > 95% الكسر CD66(+) إيجابية بالنسبة CD11b و CD15 CD16، ولكن السلبية ل CD14.
  3. جيل شبكات
    1. بعد الطرد المركزي في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت، تعليق إعادة LDN معزولة (5 × 106) في 1 مل RPMI1640 مع 10 ٪ السفح.
    2. الثقافة LDN على لوحة 6-جيدا بولي-L-يسين مغلفة (6 سم في القطر) ح 2 في ˚C 37 في أول أكسيد الكربون 5%2.
    3. إضافة كونتيرستين الفلورية الخضراء (صبغة غشاء كتيمة وصمة عار في النواة والكروموسومات) بتركيز نهائي من 5 ميكرومتر.
    4. فورا مراقبة مورفولوجية شبكات (خارج الخلية DNA مكونات طردوا من LDN تحت مجهر الأسفار).

2-تلطيخ الخلايا السرطانية مع الصبغ الأحمر نيون خلية رابط

  1. إعداد السرطان البشرية خطوط الخلايا MKN45، نوجك، وأوكوم-1.
  2. أغسل 1 × 107 الخلايا مع برنامج تلفزيوني + يدتا 0.02% أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت
  3. أضف 1 مل من محلول لصبغ تلطيخ للكريات، و "الماصة؛" بلطف.
  4. حل 4 ميليلتر من الصبغ "الأحمر نيون خلية رابط" في 1 مل من محلول لتلطيخ وخلط مع تعليق خلية من الخطوة 2، 2.
  5. احتضان الكريات لمدة 4 دقائق في الرايت
  6. إضافة 4 مل دميم (10% FBS) التوقف عن رد فعل المصبوغة.
  7. الطرد المركزي 270 س ز لمدة 7 دقائق وتجاهل المادة طافية.
  8. كرر الخطوات من 2.6 و 2.7 ضعف.
  9. تحقق مع مجهر الأسفار (الإثارة = 551 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تنبعث منها = 567 nm) أن الخلايا السرطانية هي الملون الأحمر.

3-تحليل ورم الخلية الانضمام إلى شبكات

  1. إعادة تعليق الخلايا الحمراء الفلورسنت الورم الملون (1 × 106) في 1 مل من 1640 RPMI تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1%.
  2. إضافة خلايا السرطان لثقافة LDN التي أنتجت الشباك كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
  3. احتضان لمدة 5 دقائق في ˚C 37، الذي يتيح للخلايا السرطانية الاتصال الشبكات.
    ملاحظة: حضانة طويلة يدفع التصاق الخلايا الورم LDN أو اللوحات.
  4. إزالة المتوسطة وتغسل برفق الآبار بإضافة 2 مل من بريوارميد وسائل الإعلام (BSA 0.1% + RPMI 1640) ويحوم الطبق.
  5. كرر الإجراء الغسيل في الخطوة 3.4 مرتين.
    ملاحظة: منذ شبكات ضعيفة نعلق على اللوحة، وينبغي أن يتم الغسل بلطف قدر الإمكان لتجنب إزالة شبكات أنفسهم.
  6. إضافة صبغة الفلورسنت الخضراء لتلطيخ النواة والكروموسومات بتركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل لتصور الشباك.
  7. مراقبة الشباك وتعلق ورم الخلايا باستخدام عوامل التصفية المناسبة (الإثارة الخضراء، = 504 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تنبعث منها = 523 نانومتر؛ والأحمر، والإثارة = 551 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تنبعث منها = 567 شمال البحر الأبيض المتوسط).
  8. دمج الأرقام لإظهار الخلايا السرطانية التي محاصرون بالشباك.
    ملاحظة: في بعض التجارب، والحمض النووي تدهور إنزيم أضيفت إلى ثقافة LDN (تركيز النهائي من 100 يو/مليلتر) 5 دقائق قبل الحضانة المشتركة لمدة 5 دقائق.

4-الوقت الفاصل تحليل أشرطة الفيديو للخلايا السرطانية المحاصرين

  1. جولة الثقافة LDN البريتوني في 35 مم صحن مغطاة بطبقة بولي-L-يسين كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
  2. إضافة صبغة الفلورسنت الخضراء لتلطيخ النواة والكروموسومات لتصور الشباك كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
  3. بعد 1 دقيقة من الحضانة، قم بإزالة الوسائط وإضافة 2 مل من جيش صرب البوسنة 0.1% + 1640 ربمي.
  4. قم بإزالة الوسائط وإضافة الخلايا أونستينيد 1 × 106 MKN45 علقت في 0.1% جيش صرب البوسنة + 1640 ربمي. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
  5. إزالة أي خلايا الورم فاتحة بلطف الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3، 4 وإضافة دميم مع 10% FCS وتستكمل مع 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
  6. جبل الطبق الثقافة في نظام مراقبة لعرض كل خلية وحدد الحقل المناسب في أي ورم الخلايا محاصرون بالشباك.
  7. تواصل الثقافة شارك إضافية أيام 2 والتقاط صور مستمرة من الميدان كل دقيقة 6 تحت الضوء الطبيعي، والأسفار، الذي يكشف عن الخلايا MKN45 وشبكات، على التوالي.
  8. ركب الصور في كل تيميبوينت وبناء الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو باستخدام برنامج "عارض الصور".

النتائج

في ثقافة 2 ساعة، LDN CD66b(+) المستمدة من الغسل البريتوني السوائل أظهرت سلسلة هياكل ملطخة بصبغة الفلورسنت الأخضر للنووي وكروموسوم (الشكل 1B)، بينما CD66b(-) الخلايا وحيدات النوى لم (الشكل 1). بيد عند الثقافات LDN كانت pretreated مع 100 الدناز U/mL، بنية مميزة ق?...

Discussion

وأفادت الدراسات السابقة أن تعمم الخلايا السرطانية يمكن المحاصرين بركائز الصافية في فيفو10،11. أظهرت خلايا سرطان الثدي المنتشر لحفز العَدلات والحث على تشكيل شبكات، التي تساعد في نمو الخلايا السرطانية في الجهاز الهدف17. وبالإضافة إلى ذلك، وج...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

ونشكر السيدة ج. شينوهارا وندا أولاً للأعمال الفنية والكتابية. أيضا، ونحن نشكر الدكتور شيرو ماتسوموتو وهرتا هيدينوري كوراشينا كينتارو كازويا تاكاهاشي لتعاونها من أجل اكتساب عينة في غرفة العمليات. وأيد هذا العمل معونات "البحث العلمي" من وزارة التعليم والعلوم، الرياضة، والثقافة اليابانية والجمعية اليابانية "النهوض بالعلم" (10606 ك 17).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare, SWEDEN17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeadsMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-104-913
Fc blockMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-059-901
MACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-091-222
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-091-376
LS ColumnsMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-041-306
MACS Magnetic SeparatorMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSOThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAS7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9691
Diluent CSigma-Aldrich, St Louis, MO, USACGLDIL
RPMI1640 MediumSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAR8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAD5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAD8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)nacalai tesque, Japan06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regionsgibco by life technologies, Mexico10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAA2153
Penicillin StreptomycinLife Technologies Japan15140-122
Plasmocin ProphylacticInvivoGen, San Diego, CA-USAant-mpp
DNase IWorthington, Lakewood NJ)LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6WellIWAKI, Japan4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24WellIWAKI, Japan4820-040
fluorescein stereomicroscopeBX8000, Keyence, Osaka JapanBZ-X710
Whole view cell observation systemNikon, Kanagawa, JapanBioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell lineRiken, Tukuba JapanN/A
NUGC-4 human gastric cancer cell lineRiken, Tukuba JapanN/A
OCUM-1 human gastric cancer cell lineOsaka City University, JapanN/AGift from Dr. M.Yashiro

References

  1. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  2. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  3. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
  4. Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
  5. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
  6. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
  7. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  8. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  9. Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
  10. Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
  11. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  12. Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
  13. Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
  14. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  15. Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
  16. Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
  17. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 LDN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved