腹腔灌洗液中低密度中性粒细胞分泌的中性粒细胞胞外陷阱介导肿瘤细胞生长与附着

摘要

在这里, 我们提出一种方法, 其中人类低密度中性粒细胞 (LDN), 从术后腹腔灌洗液中恢复, 产生大量的中性粒细胞外圈闭 (网), 并有效地诱捕后生长的游离肿瘤细胞。

摘要

活化中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱 (网), 可以捕获和破坏微生物。最近的研究表明蚊帐参与了各种疾病过程, 如自身免疫性疾病、血栓形成和肿瘤转移。在这里, 我们展示了一个详细的体外技术, 以检测在游离肿瘤细胞的诱捕过程中的净活动, 它生长后, 附着在网。首先, 我们收集了 laparotomies 患者术后腹腔灌洗液中的低密度中性粒细胞 (LDN)。LDN 的短期培养导致了大量的网状形成, 可见绿色荧光核和染色体 counterstain。在人类胃癌细胞系 MKN45、OCUM-1 和 NUGC-4 与网的共同孵化后, 许多肿瘤细胞被网所困住。随后, 由于网 DNase 的降解, 附着物完全被取消了. 时间推移视频显示, 网陷的肿瘤细胞没有死亡, 而是在持续的文化中大力生长。这些方法可用于检测网与各种类型的细胞和材料之间的粘接作用。

引言

循环血中变形核中性粒细胞通常通过密度梯度制备方法与单个核干细胞分离。然而, 一些被称为低密度中性粒细胞的中性粒细胞 (LDN), CD11b (+), CD15 (+), CD16 (+) 和 CD14 (-) 表型, 与单个核细胞共纯化。LDN 的相对数量在各种病理条件下显著增加, 包括自身免疫性疾病^1、2、脓毒症³和癌症^4、5。以前的研究表明, LDN 是一种表型和功能上明显的中性粒细胞⁶。应注意的是, 循环血液中的 LDN 比正常密度的中性粒细胞^2,7更容易产生中性粒细胞胞外陷阱 (蚊帐)。网是由核酸、组蛋白、蛋白酶、颗粒和胞浆蛋白组成的网状结构, 可以有效地诱捕和破坏病原体⁸。

最近, 蚊帐已被证明不仅捕获微生物, 而且还有血小板和循环肿瘤细胞, 可以帮助血栓形成⁹和肿瘤转移^10,11。然而, 网络与血小板或肿瘤细胞之间的粘接作用背后的分子机制还不清楚。最近,体外黏附检测发现髓细胞白血病 (K562¹²) 和肺癌细胞 (A549¹³) 附着在网通过β1和β3整合。作者利用从中性粒细胞中分离的净存量, 用佛波 12-酯 13-醋酸酯 (PMA) 活化的网状物作为粘附基底¹⁴。虽然这种检测可以检测到在无中性粒细胞的情况下与净成分的实际相互作用, 但是, 高速离心分离的 "无细胞网" 是否保留了与所生产的网相同的分子结构体内。最近, 我们发现腹部手术后腹腔灌洗液含有许多成熟的 LDN, 产生大量的网状物, 附着于肿瘤细胞引起的腹膜转移¹⁵。在这项研究中, 我们成功地检查了肿瘤细胞对完整网的黏附力, 没有任何物理操作。在这里, 我们展示了一种检测网络与游离肿瘤细胞之间粘接作用的技术的细节。

研究方案

LDN 是由接受本研究的病人获得的, 并获 Jichi 医科大学机构评审委员会批准。

1. 腹腔 Lavages LDN 的分离和净检测

1. 样品采集
   1. 将1000毫升的正常无菌生理盐水直接注入腹腔内, 经胃肠道恶性肿瘤腹部手术的病人在伤口闭合前, 将其注射至腹腔内。
      注: 样本是从病人接受胃切除, 结肠切除, 或食管切除没有偏见的基础上的年龄或性别。盐水被转移到一个容器里, 一分钟内倒入整个腹部。这通常是作为术后腹膜冲洗没有明显的影响病人。
   2. 广泛冲洗腹腔, 至少1分钟。
      注: 建议将输液液慢慢地与外科医生的手搅拌, 以使样品均匀。
   3. 用四50毫升注射器恢复200毫升灌洗液。
      注: 有时用橡胶连接器来取流体。
2. 用粒细胞特异性单克隆 CD66b¹⁶对腹膜 LDN 进行纯化。
   注: 由于密度梯度离心后的中间层含有许多单个核细胞, CD66b 单克隆抗体进行了阳性变形。
   1. 将腹腔灌洗液转移至50毫升管。
      注: 在这一步, 通过100µm 尼龙过滤器的液体, 以消除杂质。
   2. 以 270 x g 为7分钟, 在 RT 上离心腹膜液。
   3. 并用重悬5毫升的 PBS 中的小球, 0.02% EDTA。
   4. 仔细覆盖5毫升的细胞悬浮在3毫升密度梯度解决方案。
   5. 离心机在 1700 x g 的15分钟, 在 RT 没有任何休息。
   6. 使用吸管将含有中间层的 2-3 毫升溶液 (图 1A) 收获, 并将其与10毫升的 PBS 混合使用 0.02% EDTA。
   7. 将腹膜液以 400 x g 为7分钟在 RT 上离心, 然后丢弃上清。
   8. 再添加10毫升的 PBS, 0.02% EDTA, 离心机在 270 x g 在 RT 的7分钟. 弃上清。
   9. 将细胞颗粒 (1 x 10⁷) 溶解在60µL 的缓冲器中, 用于磁性细胞分离试剂盒。
   10. 添加20µL 的 Fc 块到小球和孵化10分钟在4摄氏度。
   11. 添加20µL 的 anti-CD66b 共轭微球和孵化的额外10分钟4摄氏度。
   12. 在500µL 的 mac 缓冲器中清洗并重新悬浮小球。
   13. 将细胞悬浮物应用于合适的磁选机磁场中的磁柱上, 通过用15毫升的缓冲器洗涤柱, 收集含有 CD66b (-) 细胞的流动。
   14. 从磁选机中取出该列, 然后将柱塞牢固地推入柱形, 立即冲洗出磁标记的 CD66b (+) 单元格。
       注: CD66b (+) 细胞的数量主要由流化分析确定的中性粒细胞组成, 这表明 > 95% 的 CD66 (+) 分数对 CD11b、CD15 和 CD16 是阳性的, 但对 CD14 是阴性的。
3. 世代网
   1. 离心后在 270 x g 7 分钟的 RT, 重新暂停隔离 LDN (5 x 10⁶) 在1毫升的 RPMI1640 与10% 的 FCS。
   2. 在 5% CO₂的37˚C 中, 在6井聚 l-赖氨酸涂层板 (直径6厘米) 上培养 LDN 2 小时。
   3. 添加绿色荧光 counterstain (膜不透水染料染色的细胞核和染色体) 在最终浓度的5µM。
   4. 立即观察网的形态 (在荧光显微镜下从 LDN 中排出的胞外 DNA 成分)。

2. 用红荧光细胞链接染料染色肿瘤细胞

1. 准备人类癌细胞系 MKN45, NUGC 和 OCUM-1。
2. 1 x 10⁷细胞与 PBS + 0.02% EDTA 在15毫升管和离心机在 270 x g 为7分钟在 RT。
3. 添加1毫升的溶液染料染色的小球, 和吸管轻轻。
4. 将4µL 的红色荧光细胞链接剂染料溶于1毫升溶液中染色, 并与步骤2.2 中的细胞悬浮液混合。
5. 在 RT 中孵化4分钟的小球。
6. 添加4毫升的 DMEM (10% 的血清), 以阻止染色反应。
7. 离心机 270 x g 7 分钟, 并丢弃上清。
8. 重复步骤2.6 和2.7 两次。
9. 检查与荧光显微镜 (励磁 = 551 毫微米, 发射 = 567 毫微米) 那肿瘤细胞被染红。

3. 肿瘤细胞对蚊帐黏附力的分析

1. 再次暂停红色荧光染色肿瘤细胞 (1 x 10⁶) 在1毫升的 RPMI 1640 补充与 0.1% BSA。
2. 将肿瘤细胞添加到生成网的 LDN 培养中, 如步骤1.3 所述。
3. 孵育5分钟, 在37˚C, 使肿瘤细胞接触网。
   注: 长时间孵化诱导肿瘤细胞粘附到 LDN 或板上。
4. 通过添加2毫升的 prewarmed 介质 (0.1% BSA + RPMI 1640) 并旋转盘子, 去除介质并轻轻地冲洗水井。
5. 重复步骤3.4 中的洗涤过程。
   注: 由于网弱附着在板材上, 洗涤应尽可能轻柔地进行, 以避免网本身的去除。
6. 添加绿色荧光染料染色的细胞核和染色体的最终浓度为5µg/毫升, 以可视化的网。
7. 观察网和附上肿瘤细胞使用适当的过滤器 (绿色, 励磁 = 504 毫微米, 发射 = 523 毫微米; 红色, 励磁 = 551 毫微米, 发射 = 567 毫微米)。
8. 合并这些数字, 以显示被网困住的肿瘤细胞。
   注: 在一些实验中, DNA 降解酶添加到 LDN 培养 (100 U/毫升的最终浓度) 5 分钟前共孵化5分钟。

4. 被困肿瘤细胞的时间推移视频分析

1. 在35毫米的圆形盘子中培养腹膜 LDN, 如步骤1.3 所述。
2. 添加绿色荧光染料染色的细胞核和染色体, 以可视化网如步骤1.3 所述。
3. 孵化1分钟后, 取出培养基, 加入2毫升 0.1% BSA + RPMI 1640。
4. 删除介质并添加无瑕 1 x 10⁶ MKN45 细胞悬浮在 0.1% BSA + RPMI 1640。在 RT 孵化5分钟。
5. 如步骤3.4 中所述, 通过轻轻冲洗去除任何未连接的肿瘤细胞, 并添加 DMEM 与 10% FCS 补充100毫升青霉素和100µg/毫升链霉素。
6. 在全视图细胞观察系统中安装培养皿, 并选择适当的领域, 其中肿瘤细胞被网困。
7. 继续共培养2天, 并采取连续照片的领域每6分钟的正常光和荧光, 分别检测 MKN45 细胞和网。
8. 在每个 timepoint 上叠加图像, 并使用图像查看器软件构造延时视频。

结果

在2小时的文化中, 从腹膜灌洗液中提取的 CD66b (+) LDN 显示了用绿色荧光染料染色核和染色体的弦结构 (图 1B), 而 CD66b (-) 单个核细胞没有 (图 1C)。然而, 当 LDN 培养的 100 U/毫升 DNase I, 特征结构被破坏 (图 1D), 表明它们是由细胞外 DNA 排出的中性粒细胞。当 LDN 在没有涂层的塑料板上进行培养时, 大量的网状簇?...

讨论

以前的研究报告说, 循环肿瘤细胞可以被网络基质所困在体内^10,11。转移性乳腺癌细胞已被证明是刺激中性粒细胞和诱导形成的蚊帐, 这有助于肿瘤细胞生长的目标器官¹⁷。此外, 我们发现, 从术后灌洗液中 LDN 的短期培养可以有效地诱捕肿瘤细胞, 而无需进一步刺激¹⁵。这些观察表明, 在转移过程中, 网的机械参与?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro