Neutrophiles pièges extracellulaires générées par les neutrophiles faible densité obtient du liquide de Lavage péritonéal médiat attachement et la croissance des cellules tumorales

Résumé

Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.

Résumé

Activé des neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), qui peuvent capturer et détruire les microbes. Des études récentes suggèrent que les filets sont impliqués dans divers processus morbides, comme auto-immunes métastases maladie, thrombose et la tumeur. Ici, nous montrons une technique détaillée in vitro pour détecter les activités NET durant le piégeage des cellules tumorales libre, ce qui poussent après fixation de filets. Tout d’abord, nous avons recueilli des neutrophiles faible densité (LDN) du liquide de lavage péritonéal postopératoire des patients qui ont subi les laparotomies. Culture à court terme de la LDN a entraîné formation nette massive qui a été visualisée avec nucléaire vert fluorescent et contre-colorant chromosome. Après incubation Co de lignées cellulaires de cancer de l’estomac humain MKN45, IC-1 et NUGC-4 avec les filets, nombreuses cellules tumorales ont été piégés par les filets. Par la suite, la pièce jointe a été complètement abrogée par la dégradation des filets avec la DNase I. décomposée vidéo a révélé que les cellules tumorales, pris au piège par les NETs ne sont pas mort mais a grandi au contraire vigoureusement dans une culture continue. Ces méthodes peuvent être appliquées à la détection des interactions adhésives entre les filets et les différents types de cellules et de matériaux.

Introduction

Neutrophiles nucléaires polymorphe dans le sang circulant sont généralement séparés de cellules mononucléaires via la méthode de préparation de gradient de densité. Toutefois, certains neutrophiles appelés neutrophiles faible densités (LDN), avec des phénotypes CD11b(+), CD15(+), CD16(+) et CD14(-), sont conjointement purifiées avec des cellules mononucléaires. Le nombre relatif de LDN augmente de manière significative dans diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes^1,2, septicémie³et cancer^4,5. Des études antérieures ont montré que LDN constituent une classe phénotypiquement et fonctionnellement distincte de neutrophiles⁶. Il est à noter que LDN dans le sang circulant sont plus susceptibles de produire des pièges extracellulaires neutrophiles (filets) que la densité normale neutrophiles^2,7. Les filets sont des structures de toile d’araignée composés d’acides nucléiques, histones, protéases et protéines granulaires et cytosoliques, et ils peuvent efficacement piéger et détruire les agents pathogènes⁸.

Récemment, les filets ont démontré pour capturer non seulement les microbes, mais aussi les plaquettes et circulation de cellules tumorales qui peuvent aider à thrombus formation⁹ et tumeur métastases^10,11. Cependant, les mécanismes moléculaires interactions adhésives entre les filets et les plaquettes ou les cellules tumorales sont encore peu claires. Plus récemment, un essai d’adhérence in vitro ont révélé que les cellules de la leucémie myéloïde (K562¹²) et de cellules de carcinome du poumon (A549¹³) attachent à filets via les intégrines β1 et β3. Les auteurs ont utilisé le stock NET isolés des neutrophiles et activé par phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme l’adhérence substrat¹⁴. Bien que ce test permet de détecter des interactions réelles avec composantes nettes en l’absence des neutrophiles, on peut affirmer si la « acellulaire stock NET » isolé par centrifugation à haute vitesse est toujours la structure moléculaire identique à filets produits dans vivo. Récemment, nous avons trouvé ce liquide de lavage péritonéal après que chirurgie abdominale contenait de nombreux LDN mature, qui généré des filets massives et attachés aux cellules tumorales causant des métastases péritonéales,¹⁵. Dans cette étude, nous avons examiné avec succès l’adhérence des cellules tumorales aux filets intacts sans aucune manipulation physique. Ici, nous montrons les détails d’une technique pour détecter des interactions adhésives entre les filets et les cellules tumorales gratuit.

Protocole

LDN provenaient de patients recrutés pour cette étude et ont été approuvées par les institutionnels Review Board de Jichi Medical University.

1. isolement de la LDN de Lavages de la cavité abdominale et détection NET

1. Acquisition de l’échantillon
   1. Infuser 1 000 mL de sérum physiologique stérile directement dans la cavité abdominale avant de refermer les plaies chez les patients ayant subi une chirurgie abdominale due à une tumeur maligne gastro-intestinale.
      NOTE : Échantillons provenaient de patients qui ont subi une gastrectomie, une colectomie ou OESOPHAGECTOMIE sans préjugé fondé sur l’âge ou le sexe. Une solution saline a été transférée dans un récipient et versée dans l’abdomen entier dans la minute. Ceci est habituellement exécuté comme un lavage péritonéal postopératoire sans effets significatifs sur les patients.
   2. Lavage de la cavité abdominale durant au moins 1 minute.
      Remarque : Il est recommandé que le liquide perfusé est agité doucement avec les mains du chirurgien afin que les échantillons soient uniformes.
   3. Récupérer 200 mL de liquide de lavage avec quatre seringues de 50 mL.
      NOTE : Parfois un raccord en caoutchouc est utilisé pour absorber les liquides.
2. Accomplissent la purification du LDN péritonéale à l’aide de granulocytes spécifiques mAb, CD66b¹⁶.
   Remarque : Étant donné que la couche intermédiaire après centrifugation en gradient de densité contient beaucoup de cellules mononucléées, sélection positive des neutrophiles polymorphe à l’aide de CD66b mAb a été réalisée.
   1. Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de 50 mL.
      Remarque : Dans cette étape, passer les fluides par un filtre de nylon 100 µm pour éliminer les impuretés.
   2. Centrifuger le liquide péritonéal à 270 g pendant 7 min à température ambiante.
   3. Remettre en suspension les pellets dans 5 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.
   4. Soigneusement superposer les 5 mL de suspension cellulaire sur une solution de gradient de densité 3 mL.
   5. Centrifuger à 1 700 x g pendant 15 min à ta sans les pauses.
   6. Récolter le ~ 2-3 mL de solution contenant les couches intermédiaires (Figure 1 a) à l’aide d’une pipette et mélangez-le avec 10 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.
   7. Centrifuger le liquide péritonéal à 400 g pendant 7 min à ta et éliminer le surnageant.
   8. Ajouter un autre 10 mL de PBS avec 0,02 % EDTA et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à RT. jeter le surnageant.
   9. Dissoudre le culot cellulaire (1 × 10-⁷) en 60 µL de tampon pour le kit de séparation cellule magnétique.
   10. Ajouter 20 µL du bloc Fc dans les granules et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
   11. Ajouter 20 µL de l’anti-CD66b conjugué avec microbilles et incuber pendant une supplémentaire de 10 min à 4 ° C.
   12. Laver et remettre en suspension les pellets dans 500 µL de tampon de MACS.
   13. Appliquer la suspension cellulaire à une colonne magnétique du champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié et de recueillir les intermédiaires contenant CD66b(-) des cellules de la colonne avec 15 mL de tampon de lavage.
   14. Retirer la colonne du séparateur magnétique et rincer immédiatement les cellules CD66b(+) magnétiquement étiquetées en appuyant fermement sur le piston dans la colonne.
       Remarque : La population de cellules CD66b(+) se compose principalement des neutrophiles, tel que déterminé par analyse de FACS indiquant que > 95 % de la fraction CD66(+) sont positives pour CD11b CD15 et CD16, mais négatives pour CD14.
3. Génération des filets
   1. Après centrifugation à 270 g pendant 7 min à ta, remettre en suspension la LDN isolée (5 x 10⁶) dans 1 mL de RPMI1640 avec 10 % FCS.
   2. Culture de la LDN sur une plaque enduite de 6 puits poly-L-lysine (6 cm de diamètre) pendant 2 h à 37 ° c à 5 % de CO₂.
   3. Ajouter le contre-colorant fluorescent vert (un membrane imperméable au colorant pour colorer le noyau et les chromosomes) à la concentration finale de 5 µM.
   4. Immédiatement, observer la morphologie des filets (les composantes ADN extracellulaires expulsés de la LDN en microscopie de fluorescence).

2. la coloration des cellules tumorales avec cellule fluorescente rouge Linker Dye

1. Préparer le cancer chez l’humain des lignées de cellules MKN45, NUGC et IC-1.
2. Laver 1 x 10⁷ cellules avec PBS + 0,02 % et d’EDTA dans un tube de 15 mL et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à température ambiante.
3. Ajouter 1 mL de solution de colorant, coloration pour les pellets et Pipeter doucement.
4. Dissoudre 4 µL de colorant rouge Fluorescent cellule Linker dans 1 mL de solution de coloration et mélanger avec la suspension de cellules de l’étape 2.2.
5. Incuber les boulettes pendant 4 min à température ambiante.
6. Ajouter 4 mL de DMEM (10 % FBS) pour arrêter la réaction de coloration.
7. Centrifuger 270 x g pendant 7 min et éliminer le surnageant.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 deux fois.
9. Vérifier avec un microscope à fluorescence (excitation = 551 nm, émettant = 567 nm) que les cellules tumorales sont colorés de rouge.

3. analyse de l’adhésion cellulaire tumorale aux filets

1. Remettre en suspension les cellules de tumeur tachée fluorescent rouge (1 x 10-⁶) dans 1 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 0,1 % de BSA.
2. Ajouter les cellules tumorales à la culture de la LDN qui produit les filets tel que décrit à l’étape 1.3.
3. Incuber pendant 5 min à 37 ° c, ce qui permet aux cellules tumorales de contacter les filets.
   Remarque : D’incubation longue induit adhérence de cellules tumorales à LDN ou aux plaques.
4. Enlever le support et laver délicatement les puits en ajoutant 2 mL de médias préchauffée (0,1 % de BSA + RPMI 1640) et en agitant le plat.
5. Répéter la procédure de nettoyage à l’étape 3.4 deux fois.
   NOTE : Depuis les filets faiblement fixer sur la plaque, le lavage se fasse aussi doucement que possible pour éviter la suppression des filets eux-mêmes.
6. Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes à une concentration finale de 5 µg/mL pour la visualisation des filets.
7. Observer les filets et attaché en utilisant les filtres appropriés des cellules tumorales (verte, excitation = 504 nm, émettant = 523 nm ; rouge, excitation = 551 nm, émettant = 567 nm).
8. Fusionner les chiffres pour montrer les cellules tumorales qui sont piégés par les filets.
   NOTE : Dans certaines expériences, enzyme de dégradation de l’ADN a été ajoutée à la culture de la LDN (concentration finale de 100 U/mL) 5 min avant incubation co pendant 5 min.

4. time Lapse analyse vidéo des cellules tumorales piégés

1. Culture la LDN péritonéale dans un 35 mm rond plat recouvert de poly-L-lysine, tel que décrit à l’étape 1.3.
2. Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes de visualiser les filets tel que décrit à l’étape 1.3.
3. Après 1 min d’incubation, retirez le support et ajouter 2 mL de 0,1 % de BSA + RPMI 1640.
4. Retirez le support et ajouter sans coloration 1 x 10⁶ MKN45 cellules en suspension dans 0,1 % BSA + RPMI 1640. Incuber 5 min à température ambiante.
5. Supprimez toutes les cellules tumorales seules en lavant doucement comme indiqué au point 3.4 et DMEM avec 10 % de FCS additionné de 100 u/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine.
6. Monter la boîte de Petri dans un système d’observation de vue ensemble cellule, puis sélectionnez le champ approprié dans les tumeurs des cellules sont pris au piège par les filets.
7. Continuer de co-culture pendant encore 2 jours et prendre des photos continues du champ toutes les 6 minutes sous une lumière normale et la fluorescence, qui permet de détecter les cellules MKN45 et filets, respectivement.
8. Superposer les images à chaque validant et construire des vidéos time-lapse utilisant le logiciel Image Viewer.

Résultats

Dans la culture de 2 heures, LDN CD66b(+) dérivées de structures fluide chaîne montraient lavage péritonéal teinté avec un colorant fluorescent vert pour nucléaire et chromosome (Figure 1 b), tout en CD66b(-) les cellules mononucléaires n’ont pas (Figure 1). Toutefois, lorsque les cultures LDN prétraités avec 100 U/mL DNase I, la structure a été détruite (Figure 1), indiquant qu’ils ...

Discussion

Des études antérieures ont signalé que les cellules tumorales circulantes peut être piégé par des substrats NET en vivo^10,,¹¹. Les cellules de cancer du sein métastatique ont été démontrés pour stimuler des neutrophiles et induisent la formation des filets, qui contribue à la croissance des cellules tumorales dans les organes de cible¹⁷. En outre, nous avons constaté que les cultures à court terme de LDN de liquide d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro