호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

요약

여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

초록

호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), 캡처 및 미생물을 파괴할 수 있는 활성화. 최근 연구 제안 그물 자가 면역 질환, 혈전 증, 및 종양 전이 등 다양 한 질병 과정에서 포함 된다. 여기, 우리는 그물을 부착 후 성장 무료 종양 세포의 트래핑 동안 NET 활동을 감지 하 상세한 생체 외에서 기술을 보여줍니다. 첫째, 우리는 laparotomies 수술 환자에서 수술 후 복 막 게 액체에서 낮은 밀도 neutrophils (LDN)를 수집. LDN의 단기 경작 녹색 형광 핵과 염색체 counterstain 가시화 했다 거 대 한 그물 형성 결과. 인간의 위 암 세포 라인 MKN45, OCUM-1 및 NUGC-4 그물의 공동 화, 후 많은 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있었다. 그 후, 첨부 파일 DNase I. 계시 노출 인 비디오 공개 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 죽지 않 았와 그물의 저하에 의해 완전 하 게 폐지 했다 하지만 대신 적극적으로 지속적인 문화에서 성장 했다. 이러한 메서드는 그물과 다양 한 유형의 세포 및 물자 사이 접착 상호 작용의 탐지에 적용할 수 있습니다.

서문

혈액 순환에 다형 핵 호 중구 밀도 그라데이션 준비 방법을 통해 단 세포에서 일반적으로 분리 된다. 그러나, CD11b(+), CD15(+), CD16(+), 그리고 CD14(-) 고기와 저밀도 neutrophils (LDN)로 알려진 일부 호 중구는 공동 단 세포로 순화. LDN의 상대 수 면역 질환^1,2, 암^4,5, 패 혈 증³, 등 다양 한 병 적인 조건에서 크게 증가 합니다. 이전 연구는 LDN의 호 중구⁶phenotypically 및 기능적으로 뚜렷한 클래스 나타났습니다. 그것은 혈액 순환에 LDN 더 정상적인 밀도 호 중구^2,7보다 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산할 가능성이 있습니다 주목 해야한다. 그물 핵 산, 히스톤, 프로 테아 제, 그리고 세밀 하 고 cytosolic 단백질의 구성 하는 웹-같은 구조 이며, 그들은 효율적으로 모 함 하 고 병원 균⁸파괴.

최근, 그물 캡처 뿐만 아니라 미생물, 하지만 또한 혈소판 혈전 형성⁹ 및 종양 전이^10,11에 지원할 수 있는 종양 세포를 순환 표시 되었습니다. 그러나, 뒤에 그물과 혈소판 또는 종양 세포 사이 접착 상호 작용 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 더 최근에, 생체 외에서 접착 분석 결과 골수성 백혈병 세포 (K562¹²) 폐 암 세포 (A549¹³) 연결 및 그물을 β1와 β3 integrins를 통해 밝혔다. 저자 호 중구에서 고립 그리고 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 접착 기판¹⁴에 의해 활성화 인터넷 주식 사용. 이 분석 결과 호 중구의 부재에서 NET 구성 요소와 실제 상호 작용의 탐지를 허용, 그것은 arguable 여부 그물 생산 에서 동일한 분자 구조를 유지는 "셀-무료 인터넷 주식" 고속 원심 분리에 의해 분리 vivo. 최근에, 우리는 복 부 수술 포함 거 대 한 그물을 생성 하 고 복 막 전이¹⁵발생 하는 종양 세포에 연결 된 많은 성숙한 LDN 후 그 게 복 막 액체를 발견. 이 연구에서 우리는 성공적으로 어떤 물리적 조작 없이 그대로 그물에 종양 세포의 접착을 시험 했다. 여기, 우리는 그물과 무료 종양 세포 사이 접착 상호 작용을 검출 하는 기법의 세부 정보를 보여줍니다.

프로토콜

LDN는 환자가이 연구에 등록에서 가져온 하 고 기관 검토 위원회의: Jichi 의학 대학에 의해 승인 했다.

1. 복 부 구멍 Lavages 및 NET 검출에서 LDN의 격리

1. 샘플 수집
   1. 위장 암 복 부 수술을 받은 환자에 상처 폐쇄 하기 전에 복 부 구멍에 직접 일반적인 살 균 염 분의 1000 mL를 달 이다.
      참고: 샘플은 연령이 나 성별에 따라 바이어스 없이 위절제술, colectomy, 또는 esophagectomy를 수술 하는 환자에서 얻은 했다. 식 염 수는 컨테이너로 전송 되었고 1 분 이내 전체 복 부에 부 어. 이것은 환자에 중요 한 영향 없이 수술 후 복 막 세척으로 정기적으로 수행 됩니다.
   2. 게 1 분 이상 동안 광범위 하 게 복 부 구멍.
      참고: 예제는 균일 한 외과 의사의 손에 생긴된 액체 흔들 천천히 하는 것이 좋습니다.
   3. 4 50 mL 주사기와 게의 200 mL를 복구 합니다.
      참고: 때로는 고무 커넥터 체액을 데 사용 됩니다.
2. Granulocyte 특정 mAb, CD66b¹⁶를 사용 하 여 복 막 LDN의 정화를 수행 합니다.
   참고: 많은 단 세포 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후 중간 계층에 포함 된 때문에 긍정적인 선택의 변이 호 중구 CD66b mAb를 사용 하 여 수행 되었다.
   1. 50 mL 튜브에 복 막 게 유체를 전송.
      참고:이 단계에서 불순물을 제거 하는 100 µ m 나일론 필터를 통해 액체를 전달 합니다.
   2. 실시간에서 7 분 동안 270 x g에서 복 막 액체 원심
   3. 0.02 %EDTA PBS의 5 mL에 산 탄을 resuspend.
   4. 조심 스럽게 3 mL 밀도 그라데이션 솔루션에 세포 현 탁 액의 5 mL을 오버레이.
   5. 휴식 없이 RT에서 15 분 동안 1700 x g에서 원심.
   6. 피 펫을 사용 하 여 중간 레이어 (그림 1A)를 포함 하는 솔루션의 2 ~ 3 mL를 수확 하 고 0.02 %EDTA PBS의 10 mL와 함께 그것을 혼합.
   7. RT에 7 분에 대 한 400 x g에서 복 막 액체 원심 및 삭제는 상쾌한.
   8. 실시간 삭제는 상쾌한에 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리기와 0.02 %EDTA, PBS의 또 다른 10 mL를 추가 합니다.
   9. 마그네틱 셀 분리 키트에 대 한 버퍼의 60 µ L에 셀 펠 릿 (1 x 10⁷)를 용 해.
   10. 펠 릿을 Fc 블록의 20 µ L을 추가 하 고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어
   11. 20 µ L 안티-CD66b의 microbeads와 활용 및 4 ° c.에 추가 10 분 동안 품 어 추가
   12. 세척 하 고 다시 맥 버퍼의 500 µ L에서 알 약을 중단.
   13. 적당 한 자석 분리기의 자기장에서 자석 열에 세포 현 탁 액을 적용 하 고 버퍼의 15 mL과 열 세척 하 여 흐름을 통해 포함 된 CD66b(-) 세포를 수집 합니다.
   14. 마그네틱 구분 기호에서 열을 제거 하 고 즉시 단단히 열에 플런저를 밀어 여 자석으로 레이블이 지정 된 CD66b(+) 세포 밖으로 플러시.
       참고: CD66b(+) 세포 인구 구성 되어 주로 호 중구 나타내는 FACS 분석에 의해 결정으로 > CD66(+) 분수의 95%는 CD11b, CD15, 및 CD16, 긍정적인 CD14에 대 한 부정적인.
3. 그물의 세대
   1. RT에서 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리 후 다시 격리 LDN를 일시 중단 (5 x 10⁶) 10 %FCS RPMI1640의 1 ml에서.
   2. 5% CO₂37 ˚C에서 2 h 6-잘 폴 리-L-리 신 코팅된 접시 (직경에서 6 cm)에 LDN 문화.
   3. 5 µ M의 최종 농도에서 녹색 형광 counterstain (핵과 염색체 얼룩 막 스며들 지 않는 염료)를 추가 합니다.
   4. 즉시 그물 (extracellular DNA 구성 요소에서 형광 현미경 검사 법에서 LDN 추방)의 형태를 관찰 합니다.

2. 붉은 형광 셀 링커 염료와 종양 세포의 얼룩

1. 인간의 암 세포 라인 MKN45, NUGC, 및 OCUM-1 준비.
2. 1 x 10⁷ 셀 PBS + 0.02 %EDTA 15 mL와 실시간에 7 분 동안 270 x g에서 원심 분리기 세척
3. 펠 릿, 얼룩 염료에 대 한 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 부드럽게 플라스틱.
4. 얼룩에 대 한 솔루션의 1 mL에 빨간색 형광 셀 링커 염료의 4 µ L를 녹이 고 세포 현 탁 액 단계 2.2에서에서 혼합.
5. 실시간에서 4 분 동안 쥐 똥을 품 어
6. DMEM의 4 개 mL를 추가 (10 %FBS) 착 색 반응을 중지 하.
7. 270 x g 7 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.
8. 2.6-2.7 단계를 두 번 반복 합니다.
9. 형광 현미경으로 확인 (여기 551 = nm, 방출 = 567 nm) 종양 세포 붉은 얼룩이 있습니다.

3. 그물에 종양 세포 접착의 분석

1. 다시 0.1 %BSA 보충 RPMI 1640의 1 mL에 빨간색 형광 스테인드 종양 세포 (1 x 10⁶) 일시 중단.
2. 1.3 단계에서 설명한 대로 그물을 생산 LDN 문화에 종양 세포를 추가 합니다.
3. 종양 세포는 그물에 연결할 수 있는 37 ˚C에서 5 분 동안 품 어.
   참고: 긴 외피 종양 세포 접착 LDN 하거나 번호판을 유도합니다.
4. 매체를 제거 하 고 부드럽게 prewarmed 미디어 (0.1 %BSA + RPMI 1640)의 2 개 mL를 추가 하 고 접시를 소용돌이 여 우물을 씻어.
5. 3.4 단계에서 세척 절차를 두 번 반복 합니다.
   참고: 그물부터 약하게 플레이트에 부착, 세척 부드럽게 스스로 그물의 제거를 피하기 위해 가능한 이루어져야 합니다.
6. 핵 및 그물의 시각화를 위한 5 µ g/mL의 최종 농도에 염색체 얼룩이 지기에 대 한 녹색 형광 염료를 추가 합니다.
7. 그물을 관찰 하 고 적절 한 필터를 사용 하 여 종양 세포를 첨부 (녹색, 여기 = 504 nm, 방출 523 = nm; 레드, 여기 551 = nm, 방출 = 567 nm).
8. 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 보여 인물을 병합 합니다.
   참고: 일부 실험에서 DNA 분해 효소에 추가 되었습니다 LDN 문화 (최종 농도 100 U/ml) 5 분에 대 한 공동 부 화 하기 전에 5 분.

4. 시간 경과 비디오 분석 갇혀 종양 세포의

1. 문화 35 m m에서 복 LDN 라운드 접시 코팅 폴 리-L-리 신 1.3 단계에서 설명한 대로.
2. 핵 및 1.3 단계에서 설명한 대로 그물을 시각화 하는 염색체 얼룩이 지기에 대 한 녹색 형광 염료를 추가 합니다.
3. 외피의 1 분 후 미디어를 제거 하 고 0.1 %BSA + RPMI 1640의 2 개 mL를 추가 합니다.
4. 미디어를 제거 하 고 흠 없는 1 x 10⁶ MKN45 세포 정지 0.1 %BSA + RPMI 1640 추가. 실시간에서 5 분 동안 품 어
5. 3.4 단계에서 설명한 대로 부드럽게 세척 하 여 모든 첨부 되지 않은 종양 세포를 제거 하 고 10% fcs 100 u/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 보충 DMEM 추가.
6. 문화 요리 전체 보기 셀 관측 시스템에 탑재 하 고는 종양 세포는 그물에 의해 갇혀 있다. 적절 한 필드를 선택 합니다.
7. 계속 추가 대 한 공동 2 일 문화 하 고 정상적인 빛과 형광, MKN45 세포와 그물을 각각 감지에서 6 분 마다 필드의 연속 사진을 찍어.
8. 각 timepoint에 이미지를 첨가 하 고 시간 경과 비디오 이미지 뷰어 소프트웨어를 사용 하 여 구성.

결과

2 시간 문화에서 CD66b(+) LDN 복 막 게 유체 보였다 문자열 구조에서 파생 된에 대 한 녹색 형광 염료와 스테인드 핵 및 단 셀 하지 않았다 CD66b(-) 동안 염색체 (그림 1B), (그림 1C). 그러나 때 LDN 문화 했다 청소용으로 100 U/mL DNase 나, 특징적인 구조는 파괴 (그림 1D), 그들은 호 중구에서 추방 하는 extracellular DNA의...

토론

이전 연구는 종양 세포를 순환 수 있습니다 갇혀 있을 NET 기판^10, vivo에서¹¹보고 있다. 전이성 유방암 세포 자극 하는 호 중구 및 대상 기관¹⁷에서 종양 세포 성장에는 그물의 대형을 유도 표시 되었습니다. 또한, 우리는 수술 후 게 액체에서 LDN의 단기 문화 수 효율적으로 더 자극¹⁵없이 종양 세포를 모 함 하는 거...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro