Trappole extracellulari del neutrofilo generati dai neutrofili bassa densità ottenuta dal liquido di lavaggio peritoneale mediata allegato e crescita delle cellule tumorali

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.

Abstract

Attiva i neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), che possono catturare e distruggere i microbi. Studi recenti suggeriscono che le reti siano coinvolti nei vari processi di malattia, quali le metastasi del tumore, la trombosi e la malattia autoimmune. Qui, ci mostra una tecnica dettagliata in vitro per rilevare attività netto durante l'intrappolamento delle cellule del tumore libero, che si sviluppano dopo allegato ai NETs. In primo luogo, abbiamo raccolto i neutrofili a bassa densità (LDN) dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatorio da pazienti sottoposti a laparotomie. Coltura a breve termine di LDN provocato dalla massiccia formazione netta che è stato visualizzato con verde fluorescente nucleare e colorante di contrasto del cromosoma. Dopo co-incubazione di linee cellulari di cancro gastrico umano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 con le reti, molte cellule del tumore erano intrappolate dai NETs. Successivamente, l'allegato completamente è stata abrogata dal degrado delle reti con dnasi I. Time-lapse video ha rivelato che le cellule del tumore intrappolate dalle reti non è morto ma invece è cresciuta vigorosamente in una cultura di continua. Questi metodi possono essere applicati alla rilevazione di interazioni adesive tra reti e vari tipi di cellule e materiali.

Introduzione

Neutrofili nucleari polimorfo nel sangue circolante in genere sono separati dalle cellule mononucleari attraverso il metodo di preparazione gradienti di densità. Tuttavia, alcuni neutrofili conosciuti come i neutrofili a bassa densità (LDN), con i fenotipi di CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), sono co-purificati con cellule mononucleari. Il numero relativo di LDN aumenta significativamente in varie condizioni patologiche tra cui malattie autoimmuni^1,2, sepsi³e cancro^4,5. Gli studi precedenti hanno dimostrato che LDN sono una classe fenotipico e funzionalmente distinta di neutrofili⁶. Dovrebbe essere notato che LDN nel sangue circolante sono più probabilità di produrre trappole extracellulari del neutrofilo (reti) di densità normale neutrofili^2,7. Le reti sono web-come strutture composte di acidi nucleici, istoni, proteasi e proteine citosoliche e granulare, e in modo efficiente possono intrappolare e distruggere gli agenti patogeni⁸.

Recentemente, le reti hanno dimostrate di catturare non solo i microbi, ma anche le piastrine e cellule tumorali che possono assistere all'embolo formazione⁹ e tumore metastasi^10,11circolanti. Tuttavia, i meccanismi molecolari dietro le interazioni adesive tra reti e piastrine o le cellule del tumore sono ancora poco chiari. Più recentemente, un'analisi di adesione in vitro hanno rivelato che le cellule di leucemia mieloide (K562¹²) e cellule di carcinoma del polmone (A549¹³) alleghino alle reti tramite le integrine β1 e β3. Gli autori hanno usato stock netto isolato dai neutrofili e attivato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) come il substrato di adesione¹⁴. Anche se questo test permette di individuare i reali interazioni con componenti netti in assenza di neutrofili, è discutibile se il "cell-free stock netto" isolato mediante centrifugazione ad alta velocità mantiene la struttura molecolare identica ai NETs prodotto in vivo. Recentemente, abbiamo trovato quel liquido di lavaggio peritoneale dopo chirurgia addominale conteneva molti LDN maturo, che generò massicce reti e attaccato alle cellule del tumore che causano metastasi peritoneali¹⁵. In questo studio, abbiamo esaminato con successo l'adesione delle cellule del tumore ai NETs intatto senza alcuna manipolazione fisica. Qui, indichiamo i dettagli di una tecnica per rilevare interazioni adesive tra le reti e le cellule del tumore libero.

Protocollo

LDN sono stati ottenuti da pazienti arruolati in questo studio e sono stati approvati dalla istituzionale recensione Consiglio di Jichi Medical University.

1. isolamento di LDN dalla cavità addominale lavande e rilevamento netto

1. Acquisizione del campione
   1. Infondere 1.000 mL di normale soluzione salina sterile direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita in pazienti sottoposti a chirurgia addominale a causa di malignità gastrointestinale.
      Nota: I campioni sono stati ottenuti da pazienti che hanno subito una gastrectomia, colectomia o esofagectomia senza pregiudizi basati sull'età o sesso. Soluzione salina è stato trasferito in un contenitore e versato in tutto l'addome entro un minuto. Questo è effettuato ordinariamente come un lavaggio peritoneale postoperatorio senza significativi effetti sui pazienti.
   2. Lavaggio della cavità addominale estesamente per almeno 1 min.
      Nota: È consigliabile che il fluido infuso lentamente si agita con le mani del chirurgo affinché i campioni siano uniformi.
   3. Recuperare 200 mL di liquido di lavaggio con quattro siringhe da 50 mL.
      Nota: A volte un connettore di gomma è usato per prendere i fluidi.
2. Eseguire la purificazione di LDN peritoneale usando del granulocyte mAb specifici, CD66b¹⁶.
   Nota: Poiché lo strato intermedio dopo centrifugazione in gradiente di densità contiene molte cellule mononucleari, selezione positiva dei neutrofili polimorfo utilizzando CD66b mAb è stato effettuato.
   1. Trasferire il liquido di lavaggio peritoneale per un tubo da 50 mL.
      Nota: In questo passaggio, passare i fluidi attraverso un filtro di nylon 100 µm per rimuovere le impurità.
   2. Centrifugare il fluido peritoneale a 270 x g per 7 minuti a TA.
   3. Risospendere il pellet in 5 mL di PBS con EDTA 0.02%.
   4. Sovrapposizione con attenzione i 5 mL di sospensione cellulare su una soluzione di gradienti di densità 3 mL.
   5. Centrifugare a 1.700 x g per 15 min a RT senza pause.
   6. Raccogliere i ~ 2-3 mL di soluzione contenente gli strati intermedi (Figura 1A) usando una pipetta e mescolare con 10 mL di PBS con EDTA 0.02%.
   7. Centrifugare il liquido peritoneale a 400 x g per 7 min a RT e scartare il surnatante.
   8. Aggiungere un altro 10 mL di PBS con 0,02% EDTA e centrifugare a 270 x g per 7 min a RT. scartare il surnatante.
   9. Sciogliere il pellet cellulare (1 x 10⁷) in 60 µ l di tampone per il kit di separazione magnetica delle cellule.
   10. Aggiungere 20 µ l di blocco Fc per il pellet e incubare per 10 min a 4 ° C.
   11. Aggiungere 20 µ l di anti-CD66b coniugato con microsfere e incubare per altri 10 min a 4 ° C.
   12. Lavare e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di MACS.
   13. Applicare la sospensione cellulare a una colonna magnetica del campo magnetico di un separatore magnetico adatto e raccogliere il flusso continuo contenenti CD66b(-) celle di colonna con 15 mL di tampone di lavaggio.
   14. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e sciacquare immediatamente le cellule CD66b(+) magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna.
       Nota: La popolazione delle cellule di CD66b(+) consiste principalmente di neutrofili come determinato mediante analisi Citofluorimetrica indicando che > 95% della frazione CD66(+) sono positivi per CD11b, CD15 e CD16, ma la negazione per CD14.
3. Generazione di reti
   1. Dopo centrifugazione a 270 x g per 7 min a RT, Risospendere la LDN isolata (5 x 10⁶) in 1 mL di RPMI1640 con 10% FCS.
   2. Cultura la LDN su un piatto rivestito di poli-L-lisina 6-pozzetti (6 cm di diametro) per 2 ore a 37 ° c 5% CO₂.
   3. Aggiungere il colorante di contrasto fluorescente verde (un colorante membrana impermeabile per il nucleo e cromosomi) alla concentrazione finale di 5 µM.
   4. Immediatamente osservare la morfologia delle reti (i componenti del DNA extracellulare espulsi da LDN sotto microscopia a fluorescenza).

2. colorazione delle cellule del tumore con tintura di Linker cella fluorescente rosso

1. Preparare il cancro umano linee cellulari MKN45, NUGC e OCUM-1.
2. Lavare 1 x 10⁷ cellule con PBS + 0,02% EDTA in una provetta da 15 mL e centrifugare a 270 x g per 7 minuti a TA.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione per tintura di macchiatura per il pellet e pipettare delicatamente.
4. Sciogliere 4 µ l di colorante rosso fluorescente cella Linker in 1 mL di soluzione per la macchiatura e mescolare con la sospensione cellulare dal punto 2.2.
5. Incubare i pellet per 4 minuti a TA.
6. Aggiungere 4 mL di DMEM (10% FBS) per interrompere la reazione di macchiatura.
7. Centrifugare 270 x g per 7 min e scartare il surnatante.
8. Ripetere due volte i passaggi 2.6 e 2.7.
9. Controllare con un microscopio a fluorescenza (eccitazione = 551 nm, che emettono = 567 nm) che le cellule del tumore sono macchiate di rosso.

3. analisi di adesione delle cellule del tumore ai NETs

1. Risospendere le cellule di tumore macchiato fluorescente rosso (1 x 10⁶) in 1 mL di RPMI 1640 completati con 0.1% BSA.
2. Aggiungere le cellule del tumore per la cultura LDN che ha prodotto le reti come descritto al punto 1.3.
3. Incubare per 5 min a 37 ° c, che permette alle cellule del tumore di contattare le reti.
   Nota: Lunga incubazione induce adesione delle cellule del tumore per LDN o le piastre.
4. Rimuovere il supporto e lavare delicatamente i pozzetti aggiungendo 2 mL di media preriscaldata (0.1% BSA + RPMI 1640) e il piatto di turbine.
5. Ripetere due volte la procedura di lavaggio al punto 3.4.
   Nota: Poiché le reti debolmente collegare alla piastra, lavaggio dovrebbe essere fatto nel modo più delicato possibile per evitare la rimozione delle reti stesse.
6. Aggiungere il colorante fluorescente verde per la colorazione del nucleo e cromosomi ad una concentrazione finale di 5 µ g/mL per la visualizzazione delle reti.
7. Osservare le reti e attaccato le cellule del tumore usando i filtri appropriati (verde, eccitazione = 504 nm, che emettono = 523 nm; rosso, eccitazione = 551 nm, che emettono = 567 nm).
8. Unire le cifre per mostrare le cellule del tumore che sono intrappolate dai NETs.
   Nota: In alcuni esperimenti, enzima di degradazione del DNA è stato aggiunto alla cultura LDN (concentrazione finale di 100 U/mL) 5 min prima del co-incubazione per 5 min.

4. time Lapse Video analisi delle cellule del tumore intrappolati

1. Cultura la LDN peritoneale in un 35 mm tondo piatto rivestito con poli-L-lisina come descritto al punto 1.3.
2. Aggiungere il colorante fluorescente verde per la colorazione del nucleo e cromosomi per visualizzare le reti come descritto al punto 1.3.
3. Dopo 1 min di incubazione, rimuovere il supporto e aggiungere 2 mL di 0.1% BSA + RPMI 1640.
4. Rimuovere il supporto e aggiungere non colorati 1 x 10⁶ MKN45 cellule sospese in 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubare per 5 min a RT.
5. Rimuovere tutte le cellule del tumore non collegato lavando delicatamente come descritto al punto 3.4 e aggiungere DMEM con 10% FCS completati con 100 u/mL penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.
6. Montare la piastra di coltura in un sistema di osservazione di tutta la vista cellulare e selezionare il campo appropriato nel quale tumore le cellule sono intrappolate dai NETs.
7. Continuare a co-cultura per altri 2 giorni e scattare foto continue del campo ogni 6 min sotto luce normale e fluorescenza, che rileva le cellule MKN45 e reti, rispettivamente.
8. Sovrapporre le immagini a ogni timepoint e costruire time-lapse video utilizzando il software Image Viewer.

Risultati

Nella cultura 2 ore, LDN CD66b(+) derivata da lavaggio peritoneale fluido stringa ha mostrato strutture colorate con colorante verde fluorescente per nucleare e cromosoma (Figura 1B), mentre CD66b(-) cellule mononucleari non ha fatto (Figura 1). Tuttavia, quando le culture LDN sono state pretrattate con 100 U/mL dnasi I, la caratteristica struttura è stato distrutta (Figura 1), che indica che sono s...

Discussione

Gli studi precedenti hanno segnalato che cellule tumorali circolanti possono essere intrappolati dal netto substrati in vivo^10,11. Cellule di carcinoma mammario metastatico sono state indicate per stimolare i neutrofili e indurre la formazione di reti, che assiste nella crescita delle cellule del tumore nell' organo bersaglio¹⁷. Inoltre, abbiamo trovato che colture di breve durata di LDN dal fluido di lavaggio postoperatorio prodo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro