Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Resumo

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Resumo

Ativado os neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), que podem capturar e destruir micróbios. Estudos recentes sugerem que as redes estão envolvidas em vários processos de doença, tais como metástases de tumor, trombose e doenças auto-imunes. Aqui, nós mostramos uma técnica detalhada em vitro para detectar atividade NET durante a captura de células de tumor gratuito, que crescem após a ligação a redes. Primeiramente, coletamos neutrófilos de baixa densidade (LDN) de líquido de lavagem peritoneal no pós-operatório de pacientes que se submeteram a laparotomias. Cultivo a curto prazo da LDN resultou na maciça formação líquida que foi visualizada com verde fluorescente nuclear e corante de contraste do cromossomo. Após a incubação co de linhas de células de câncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 com as redes, muitas células de tumor foram aprisionadas por redes. Posteriormente, o acessório foi totalmente revogado pela degradação de redes com DNase I. tempo-lapso vídeo revelou que células tumorais capturadas pelas redes não morreu, mas em vez disso, cresceu vigorosamente em uma cultura contínua. Esses métodos podem ser aplicados para a detecção de adesivas interações entre redes e vários tipos de células e materiais.

Introdução

Os neutrófilos nucleares polimorfo, na circulação de sangue normalmente são separados de células mononucleares através do método de preparação de gradiente de densidade. No entanto, alguns neutrófilos conhecidos como neutrófilos baixa densidade (LDN), com fenótipos CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), são co purificados com células mononucleares. O número relativo de LDN aumenta significativamente em diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes,^1,2, sepse³e câncer^4,5. Estudos anteriores mostraram que LDN são uma classe fenotipicamente e funcionalmente distinta de neutrófilos⁶. Deve notar-se que LDN na circulação de sangue são mais propensos a produzir neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) do que a densidade normal neutrófilos^2,7. As redes são estruturas semelhantes a web compostas de ácidos nucleicos, histonas, proteases e proteínas cytosolic e granulares, e eficientemente podem enganar e destruir patógenos⁸.

Recentemente, as redes foram mostradas para capturar não só os micróbios, mas também plaquetas e circulantes de células de tumor que podem ajudar no trombo formação⁹ e tumor metástases^10,11. No entanto, os mecanismos moleculares por trás as interações adesivas entre redes e plaquetas ou células tumorais são ainda pouco claras. Mais recentemente, um ensaio de adesão em vitro revelou que células de leucemia mieloide (K562¹²) e células de carcinoma de pulmão (A549¹³) anexar a redes através de integrinas β1 e β3. Os autores utilizaram NET ações isoladas de neutrófilos e ativado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como o substrato de adesão¹⁴. Embora este ensaio permite a detecção de interações reais com componentes líquidos na ausência de neutrófilos, é discutível se a "célula livre circulante líquido" isolados por centrifugação de alta velocidade mantém a estrutura molecular idêntica à redes produzidas em vivo. Recentemente, encontramos o líquido de lavagem peritoneal após cirurgia abdominal continha muitos LDN maduro, que gerou enormes redes e anexado às células de tumor causando metástases peritoneais¹⁵. Neste estudo, analisámos com sucesso a adesão das células tumorais para redes intactas sem qualquer manipulação física. Aqui, nós mostramos detalhes de uma técnica para detectar interações adesivas entre redes e células tumorais livre.

Protocolo

LDN foram obtidos de pacientes matriculados neste estudo e foram aprovados pela institucional Review Board de Jichi médica Universidade.

1. isolamento de LDN de Lavages de cavidade Abdominal e deteção líquida

1. Aquisição de amostra
   1. Infundi 1.000 mL de solução salina estéril diretamente na cavidade abdominal antes do fechamento da ferida em pacientes que se submeteram à cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal.
      Nota: As amostras foram obtidas de pacientes que se submeteram a uma gastrectomia, colectomia ou Esofagectomia sem preconceito com base na idade ou sexo. Solução salina foi transferida para um recipiente e vertida em todo abdome dentro de um minuto. Esta é realizada de rotina como uma lavagem peritoneal pós-operatória sem efeitos significativos sobre os pacientes.
   2. Lavagem da cavidade abdominal extensivamente pelo menos 1 min.
      Nota: É recomendável que o fluido infundido lentamente agita-se com as mãos do cirurgião para que as amostras são uniformes.
   3. Recupere 200 mL de líquido de lavagem com 4 seringas de 50 mL.
      Nota: Às vezes, um conector de borracha é usado para pegar os fluidos.
2. Realize a purificação da LDN peritoneal usando mAb específico de granulócitos, CD66b¹⁶.
   Nota: Porque a camada intermediária após centrifugação gradiente de densidade contém muitas células mononucleares, selecção positiva de neutrófilos polimorfo usando CD66b mAb foi executada.
   1. Transferi o líquido de lavagem peritoneal para um tubo de 50 mL.
      Nota: Nesta etapa, passe os fluidos através de um filtro de nylon 100 µm para remover as impurezas.
   2. Centrifugue o fluido peritoneal a 270 x g, durante 7 min na RT
   3. Resuspenda as pelotas em 5 mL de PBS com EDTA 0,02%.
   4. Sobreposição com cuidado a 5 mL de suspensão de células em uma solução de gradiente de densidade de 3 mL.
   5. Centrifugar a 1.700 x g, durante 15 min em RT sem intervalos.
   6. Colher o ~ 2-3 mL de solução contendo as camadas intermediárias (figura 1A), usando uma pipeta e misturar com 10 mL de PBS com EDTA 0,02%.
   7. Centrifugue o fluido peritoneal em 400 x g, durante 7 min na RT e descartar o sobrenadante.
   8. Adicione outro 10 mL de PBS com EDTA 0,02% e centrifugar a 270 x g, durante 7 min na RT. descartar o sobrenadante.
   9. Dissolva o centrifugado (1 x 10⁷) em 60 µ l de tampão para o kit de separação magnética celular.
   10. Adicionar 20 µ l do bloco Fc nas pelotas e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
   11. Adicionar 20 µ l do anti-CD66b conjugados com microbeads e incube por um adicional 10 min a 4 ° C.
   12. Lave e ressuspender as pelotas em 500 µ l de tampão de MACS.
   13. Aplicar a suspensão de células de uma coluna magnética no campo magnético de um separador magnético adequado e recolher as células de passagem contendo CD66b(-) pela coluna com 15 mL de tampão de lavagem.
   14. Remover a coluna a partir do separador magnético e expulsar imediatamente as pilhas de CD66b(+) magneticamente etiquetadas empurrando firmemente o êmbolo na coluna.
       Nota: A população de células de CD66b(+) consiste principalmente de neutrófilos, conforme determinado pela análise de FACS indicando que > 95% da fração CD66(+) são positivas para CD15, CD11b e CD16, mas negativas para CD14.
3. Geração de redes
   1. Após a centrifugação a 270 x g, durante 7 min na RT, re-suspender a LDN isolado (5 x 10⁶) em 1 mL de RPMI1640 com FCS de 10%.
   2. Cultura da LDN em uma placa revestida 6-poços poli-L-lisina (6 cm de diâmetro) por 2 h em 37 ˚ c em 5% CO₂.
   3. Adicione o corante verde de contraste fluorescente (um corante membrana impermeável para manchar o núcleo e cromossomos) na concentração final de 5 µM.
   4. Imediatamente observe a morfologia das redes (os componentes DNA extracelulares expelidos da LDN sob microscopia de fluorescência).

2. coloração de células tumorais com tintura de vinculador de célula fluorescente vermelha

1. Prepare o câncer humano linhas celulares, MKN45, NUGC e OCUM-1.
2. Lavam-se 1 x 10⁷ células com PBS + EDTA 0,02% em um tubo de 15 mL e centrifugar 270 x g por 7 min em RT
3. Adicionar 1 mL de solução para tintura coloração nas pelotas e pipetar suavemente.
4. Dissolver 4 µ l de corante vermelho fluorescente célula vinculador em 1 mL de solução para coloração e misture com a suspensão de células da etapa 2.2.
5. Incubar as pelotas por 4 min na RT
6. Adicionar 4 mL de DMEM (10% FBS) para parar a reação de coloração.
7. Centrifugue a 270 x g, durante 7 min e descartar o sobrenadante.
8. Repita os passos de 2.6 e 2.7 duas vezes.
9. Verifique com um microscópio de fluorescência (excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm) que as células do tumor estão manchadas de vermelho.

3. análise da aderência de célula de Tumor nas redes

1. Ressuspender as células de tumor manchada fluorescente vermelha (1 x 10⁶) em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de BSA.
2. Adicione as células do tumor para a cultura LDN que produziu as redes conforme descrito na etapa 1.3.
3. Incube durante 5 min à 37 ˚ c, o que permite que as células do tumor entrar em contato com as redes.
   Nota: Incubação longa induz aderência de célula do tumor para LDN ou para as placas.
4. Remover o meio e delicadamente lavar os poços, adicionando 2 mL de mídia escaldadas (0,1% BSA + RPMI 1640) e girando o prato.
5. Repita o procedimento de lavagem no passo 3.4 duas vezes.
   Nota: Desde redes fracamente anexar a placa, a lavagem deve ser feita o mais suavemente possível para evitar a remoção das redes se.
6. Adicione o corante verde fluorescente para manchar o núcleo e cromossomos em uma concentração final de 5 µ g/mL para visualização das redes.
7. Observar as redes e anexado células tumorais usando os filtros apropriados (verde, excitação = 504 nm, emitindo = 523 nm; vermelho, excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm).
8. Mescle os números para mostrar as células do tumor que estão preso por redes.
   Nota: Em alguns experimentos, enzima de degradação do DNA foi adicionada à cultura LDN (concentração final de 100 U/mL) 5 min antes co incubação por 5 min.

4. análise de vídeo lapso tempo das células do Tumor preso

1. Cultura da LDN peritoneal em um 35 milímetros rodada prato revestido com poli-L-lisina, conforme descrito na etapa 1.3.
2. Adicione o corante verde fluorescente para manchar o núcleo e cromossomos Visualizar redes conforme descrito na etapa 1.3.
3. Após 1 minuto de incubação, remova a mídia e adicionar 2 mL de 0.1% BSA + RPMI 1640.
4. Remova a mídia e adicionar imaculado 1 x 10⁶ MKN45 células suspensas em 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubar durante 5 min à RT.
5. Remova quaisquer células de tumor desanexado lavando suavemente conforme descrito no passo 3.4 e adicione DMEM com 10% de FCS suplementado com 100 u/mL penicilina e 100 µ g/mL Estreptomicina.
6. Montar o prato de cultura em um sistema de observação do vista para toda a célula e selecione o campo apropriado no qual tumor, as células são presos por redes.
7. Continue a cultura co por mais 2 dias e tirar fotos contínuas do campo cada 6 min sob luz normal e fluorescência, que detecta células MKN45 e redes, respectivamente.
8. Sobrepor as imagens em cada commit e construir vídeos Time-Lapse utilizando software visualizador de imagens.

Resultados

Na cultura de 2 horas, LDN CD66b(+), derivado de estruturas de sequência mostrou fluido de lavagem peritoneal corados com corante verde-fluorescente para nuclear e cromossomo (figura 1B), enquanto CD66b(-) células mononucleares não fizeram (Figura 1). No entanto, quando as culturas LDN foram pré-tratados com 100 U/mL DNase, a estrutura característica era destruído (Figura 1), indicando que eles...

Discussão

Estudos anteriores relataram que circulam células tumorais pode ser presa por substratos NET na vivo^10,11. Células de câncer de mama metastático foram mostradas para estimular os neutrófilos e induzir a formação de redes, que auxilia no crescimento de células de tumor no órgão alvo¹⁷. Além disso, nós encontramos que a curto prazo culturas de LDN de fluido de lavagem pós-operatória produziam enormes redes que poderiam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro