Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode in der menschlichen Low-Density Neutrophilen (LDN), erholte sich von postoperativen peritoneal Lavage Fluid, produzieren massive Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) und effizient trap freie Tumorzellen, die anschließend wachsen.

Zusammenfassung

Aktiviert neutrophile Release Neutrophilen extrazelluläre fallen (Netze), die erfassen und Mikroben vernichten können. Neuere Studien legen nahe, dass verschiedene Krankheitsprozesse, wie z. B. Autoimmun-Krankheit, Thrombose und Tumor Metastasen Netze beteiligt sind. Hier zeigen wir eine detaillierte in-Vitro -Technik, um NET Aktivität während das Abfangen von freien Tumorzellen erkennen, die nach Bindung an Netze wachsen. Zunächst sammelten wir niedrige Dichte Neutrophilen (LDN) von postoperativen peritoneal Lavage Fluid von Patienten, die Laparatomien unterzogen. Kurzfristiger Kultivierung von LDN führte zu massiven NET Formation, die mit nuklearen grün fluoreszierende und Chromosom gegenfärbung visualisiert wurde. Nach der Co Inkubation des menschlichen Magen-Krebs-Zell-Linien MKN45, OCUM-1 und NUGC-4 mit den Netzen wurden viele Tumorzellen durch die Netze gefangen. Anschließend die Anlage wurde komplett aufgehoben durch den Abbau von Netzen mit DNase I. Time-lapse Video zeigte, dass Tumorzellen gefangen durch die Netze nicht sterben aber stattdessen wuchs kräftig in einer kontinuierlichen Kultur. Diese Methoden können für die Erkennung von Klebstoff Interaktionen zwischen Netzen und verschiedene Arten von Zellen und Materialien angewendet werden.

Einleitung

Polymorphen nuklearen Neutrophilen im Blut zirkulierenden sind in der Regel durch die Art der Dichte-Gradienten Zubereitung von mononukleären Zellen getrennt. Allerdings sind einige Neutrophilen bekannt als Low-Density Neutrophilen (LDN), mit CD11b(+), CD15(+), CD16(+) und CD14(-) Phänotypen, Co gereinigten mit mononukleären Zellen. Die relative Anzahl der LDN erhöht in verschiedenen pathologischen Bedingungen einschließlich Autoimmunerkrankungen^1,2, Sepsis³und Krebs^4,5. Frühere Studien haben gezeigt, dass LDN eine phänotypisch und funktionell eigene Klasse von Neutrophilen⁶. Es sei darauf hingewiesen, dass LDN im zirkulierenden Blut sind eher Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) als normale Dichte Neutrophilen^2,7zu produzieren. Netze sind netzartige Strukturen bestehend aus Nukleinsäuren, Histone, Proteasen und körnige und cytosolischen Proteine, und sie können effizient zu fangen und zerstören Krankheitserreger⁸.

Vor kurzem wurden Netze gezeigt, erfassen nicht nur Mikroben, sondern auch Blutplättchen und zirkulierenden Tumorzellen dem Thrombus Bildung⁹ und Tumor Metastasen^10,11helfen können. Die molekularen Mechanismen hinter der Klebstoffen Interaktionen zwischen Netzen und Blutplättchen oder Tumorzellen sind jedoch noch unklar. In jüngerer Zeit, ein in-Vitro Adhäsion Assay zufolge Netze über β1 und β3 Integrine myeloische Leukämie-Zellen (K562¹²) und Lunge Karzinomzellen (A549¹³) zuordnen. Die Autoren verwendeten Netto Lager von Neutrophilen isoliert und durch Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) als die Adhäsion Substrat¹⁴aktiviert. Obwohl dieser Assay Erkennung von realen Interaktionen mit NET-Komponenten in das Fehlen von Neutrophilen erlaubt, ist es fraglich ob die molekulare Struktur identisch mit Netzen produziert in behält die "zellfreie Netto Lager" durch High-Speed-Zentrifugation isoliert Vivo. Vor kurzem fanden wir, dass peritoneal Lavage-Flüssigkeit, nach Bauchoperationen viele Reife LDN, enthalten die massive Netze generiert und an Tumorzellen verursacht peritonealen Metastasen¹⁵. In dieser Studie untersuchten wir erfolgreich das Anhaften von Tumorzellen intakt Netze ohne physische Manipulation. Hier zeigen wir Details eine Technik, selbstklebende Wechselwirkungen zwischen Netzen und freie Tumorzellen zu erkennen.

Protokoll

LDN wurden Patienten in dieser Studie entnommen und durch die institutionelle Review Board der Jichi Medizinische Universität angenommen wurden.

1. Isolierung von LDN aus Bauchhöhle Lavages und NET Detection

1. Probe-Übernahme
   1. Die Infusion 1.000 mL normale sterile Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle vor Wundverschluss bei Patienten, die aufgrund von Magen-Darm-Malignität Bauch operiert wurden.
      Hinweis: Proben stammen von Patienten, die eine Gastrektomie, Colectomy oder Ösophagektomie ohne Vorurteile basierend auf Alter oder Geschlecht unterzogen. Kochsalzlösung wurde in einen Behälter überführt und innerhalb einer Minute in den ganzen Unterleib gegossen. Dies wird als eine postoperative peritonealen waschen ohne erhebliche Auswirkungen auf Patienten routinemäßig durchgeführt.
   2. Lavage der Bauchhöhle ausgiebig für mindestens 1 Minute.
      Hinweis: Es wird empfohlen, dass die infundierte Flüssigkeit langsam mit der Chirurg Hände gerührt wird, damit die Proben einheitlich sind.
   3. 200 mL Lavage-Flüssigkeit mit vier 50 mL Spritzen zu erholen.
      Hinweis: Manchmal wird ein Kaltgerätestecker verwendet, um die Flüssigkeiten aufnehmen.
2. Durchführen Sie Reinigung des peritonealen LDN mit Granulozyten spezifische mAb, CD66b¹⁶.
   Hinweis: Da die Zwischenschicht nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung viele MONONUKLEÄRE Zellen enthält, wurde positiver Selektion der polymorphen Neutrophilen mit CD66b mAb durchgeführt.
   1. Übertragen Sie die peritoneale Lavage-Flüssigkeit auf eine 50 mL-Tube.
      Hinweis: In diesem Schritt durchlaufen Sie die Flüssigkeiten einen 100 µm Nylon-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.
   2. Zentrifugieren der peritonealen Flüssigkeit bei 270 X g für 7 min bei RT
   3. Die Pellets in 5 mL PBS mit 0,02 % EDTA aufzuwirbeln.
   4. Überlagern Sie sorgfältig die 5 mL Zellsuspension auf eine 3 mL Dichte-Gradienten-Lösung.
   5. Zentrifugieren Sie bei 1.700 x g für 15 min bei RT ohne Pausen.
   6. Ernten Sie ~ 2-3 mL Lösung enthält die Zwischenschichten (Abbildung 1A) mit einer Pipette zu und mischen Sie es mit 10 mL PBS mit 0,02 % EDTA.
   7. Zentrifugieren der peritonealen Flüssigkeit bei 400 X g für 7 min bei RT und den überstand verwerfen.
   8. Fügen Sie ein weiteres 10 mL PBS mit 0,02 % EDTA und Zentrifuge bei 270 X g für 7 min bei RT. verwerfen der Überstand.
   9. Die Zelle-Pellet (1 x 10⁷) in 60 µL Puffer für das magnetische Zelle Trennung Kit auflösen.
   10. Die Pellets 20 µL des Fc Block hinzufügen und 10 min bei 4 ° c inkubieren
   11. Fügen Sie 20 µL des Anti-CD66b mit Microbeads konjugierten und eine zusätzliche 10 min bei 4 ° c inkubieren
   12. Waschen Sie und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 500 µL Puffer MACS.
   13. Anwenden der Zellsuspension auf eine magnetische Spalte in das Magnetfeld des einen geeigneten Magnetabscheider und durchströmten enthaltenden CD66b(-) Zellen durch Waschen der Spalte mit 15 mL des Puffers zu sammeln.
   14. Entfernen Sie die Spalte aus der Magnetabscheider und sofort die magnetisch beschrifteten CD66b(+) Zellen fest drücken Sie den Kolben in die Spalte durchspülen.
       Hinweis: Die CD66b(+)-Zell-Population besteht zum Großteil aus Neutrophilen durch FACS Analyse darauf hinweist, dass > 95 % der CD66(+)-Fraktion sind für CD11b, CD15 und CD16 positiv, sondern negativ für CD14.
3. Erzeugung von Netzen
   1. Nach Zentrifugation bei 270 X g für 7 min bei RT, erneut aussetzen der isolierten LDN (5 x 10⁶) in 1 mL RPMI1640 mit 10 % FCS.
   2. Kultur der LDN auf einer 6-Brunnen Poly-L-Lysin beschichtete Platte (6 cm Durchmesser) für 2 h bei 37 ° c in 5 % CO₂.
   3. Fügen Sie das grün fluoreszierende gegenfärbung (eine Membran undurchlässig Farbstoff, der Kern und die Chromosomen Beflecken) am die Endkonzentration von 5 µM.
   4. Die Morphologie der Netze (die extrazelluläre DNA-Bausteine aus der LDN unter Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewiesen) sofort zu beobachten.

(2) Färbung der Tumorzellen mit rot fluoreszierende Zelle Linker Farbstoff

1. Bereiten Sie menschlichen Krebs Zell-Linien MKN45, NUGC und OCUM-1.
2. Waschen Sie 1 x 10⁷ Zellen mit PBS + 0,02 % EDTA in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 270 X g für 7 min bei RT
3. Fügen Sie 1 mL der Lösung für Farbstoff Färbung, die Pellets und pipette vorsichtig.
4. Lösen Sie 4 µL rot fluoreszierende Zelle Linker Farbstoff in 1 mL der Lösung zum Färben und mischen mit der Zellsuspension aus Schritt 2.2.
5. Die Pellets für 4 min bei RT inkubieren
6. Fügen Sie 4 mL DMEM (10 % FBS), die Färbung Reaktion zu stoppen.
7. 270 X g für 7 min zentrifugieren und den überstand verwerfen.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 zweimal.
9. Erkundigen Sie sich bei einem Fluoreszenzmikroskop (Erregung = 551 nm emittieren = 567 nm), dass die Tumorzellen rot gefärbt sind.

3. Analyse der Tumor Zelladhäsion, Netze

1. Wieder aussetzen Sie rot fluoreszierende gefärbten Tumorzellen (1 x 10⁶) in 1 mL RPMI 1640 mit 0,1 % BSA ergänzt.
2. Fügen Sie die Tumorzellen, die LDN-Kultur, die die Netze hergestellt, wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
3. Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° c, wodurch die Tumorzellen, die Netze zu kontaktieren.
   Hinweis: Lange Inkubationszeit induziert Tumor Zelladhäsion LDN oder an den Platten.
4. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie vorsichtig die Brunnen durch Hinzufügen von 2 mL vorgewärmte Medien (0,1 % BSA + RPMI-1640) und Schwenken die Schüssel.
5. Wiederholen Sie der Waschvorgang in Schritt 3.4 zweimal.
   Hinweis: Seit Netze schwach bis auf den Teller legen, Waschen sollte so schonend wie möglich zu entfernen die Netze selbst erfolgen.
6. Fügen Sie die grünen fluoreszierenden Farbstoff zum Färben der Kern und die Chromosomen in eine Endkonzentration von 5 µg/mL für die Visualisierung der Netze.
7. Die Netze zu beobachten und an Tumorzellen mit den entsprechenden Filtern (grün, Erregung = 504 nm, emittierende = 523 nm; rot, Erregung = 551 nm, emittierende = 567 nm).
8. Zusammengeführt werden die Zahlen, um die Tumorzellen zeigen, die von den Netzen gefangen sind.
   Hinweis: In einigen Experimenten wurde DNA-Abbau-Enzym die LDN-Kultur (Endkonzentration von 100 U/mL) 5 min vor der Co Inkubation für 5 min hinzugefügt.

4. Zeit Zeitraffer Video-Analyse der eingeschlossenen Tumorzellen

1. Kultur der peritonealen LDN in einem 35 mm Runde Schüssel beschichtet mit Poly-L-Lysin wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
2. Fügen Sie die grünen fluoreszierenden Farbstoff zum Färben der Kern und die Chromosomen, Netze, wie unter Punkt 1.3 beschrieben zu visualisieren.
3. Entfernen Sie nach 1 min Inkubation das Medium und 2 mL 0,1 % BSA + RPMI 1640.
4. Entfernen Sie den Datenträger, und fügen Sie ungefärbt 1 x 10⁶ MKN45 Zellen in 0,1 % suspendiert, BSA + RPMI 1640. 5 min bei RT inkubieren
5. Entfernen Sie alle ungebunden Tumorzellen durch sanft Waschen wie unter Punkt 3.4 beschrieben und fügen Sie DMEM mit 10 % FCS mit 100 u/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt.
6. Montieren Sie der Kulturschale in ein Beobachtungssystem Blick auf ganze Zelle und wählen Sie das entsprechende Feld in welchem, das Tumor Zellen durch die Netze gefangen sind.
7. Weiterhin gemeinsam für weitere 2 Tage Kultur und kontinuierliche Fotografieren des Feldes alle 6 min. unter normalem Licht und Fluoreszenz, die MKN45 Zellen und Netze, bzw. erkennt.
8. Überlagern Sie die Bilder bei jedem Timepoint und konstruieren Sie Zeitraffer-Videos mit Bild-Viewer-Software.

Ergebnisse

In der 2-Stunden-Kultur CD66b(+) LDN peritoneal Lavage Fluid angezeigte Zeichenfolge Strukturen abgeleitet gebeizt mit grün fluoreszierenden Farbstoff für nukleare und Chromosom (Abbildung 1 b), während CD66b(-) MONONUKLEÄRE Zellen nicht (Abbildung 1). Jedoch wenn die LDN-Kulturen mit vorbehandelt wurden 100 U/mL DNase I, die charakteristische Architektur wurde zerstört (Abbildung 1), darauf hin...

Diskussion

Frühere Studien haben berichtet, dass die zirkulierenden Tumorzellen durch NET Substrate in Vivo^10,11gefangen werden kann. Metastasierendem Brustkrebs-Zellen nachweislich zu stimulieren Neutrophilen und induzieren die Bildung von Netzen, die Zelle Tumorwachstum in die Ziel-Organ-¹⁷unterstützt. Darüber hinaus fanden wir, dass kurzfristige Kulturen von LDN aus postoperative Lavage Fluid massive Netze hergestellt, die effizient Tu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro