تنقية مثقبيات خارج الخلية، بما في ذلك البلدان الأفريقية، من الدم بشاردة-مبادلات (ديثيلامينوثيل-السليلوز أعمدة)

Summary

هذا الأسلوب من المثقبيات انفصال الدم يعتمد على تهمة السطحية يجري أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم. وضع الدم الملوث ويعامل على عمود مبادل شاردة. يوفر هذا الأسلوب، الأكثر ملائمة في التشخيص لداء المثقبيات الأفريقي، الطفيليات المنقي للتحقيقات المناعية، والبيولوجية، والكيميائية الحيوية، الصيدلة والبيولوجيا الجزيئية.

Abstract

هذا الأسلوب يتيح فصل مثقبيات، الطفيليات المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (قبعة)، من الدم الملوث. وهذا هو أفضل طريقة لتشخيص المرحلة الأولى قبعة وعلاوة على ذلك هذا الأسلوب تنقية الطفيلي تصاريح المصلية والبحوث التحقيقات.

قبعة بسبب ذبابة التسي تسي أحال المثقبيات البروسية الغامبية و رهوديسينسي ت.. مثقبيات ذات الصلة هي العوامل المسببة لداء المثقبيات الحيواني. الكشف عن المثقبيات ضروري للقبعة التشخيص والعلاج والمتابعة. الأسلوب الموصوفة هنا هو أسلوب الكشف عن الطفيليات الأكثر حساسية، تتكيف مع الظروف الميدانية لتشخيص الغامبية ت. قبعة ويمكن أن تنجز في غضون ساعة واحدة. الطبقات الدم على عمود مبادل شاردة (دي السليلوز) سبق تعديلها لدرجة الحموضة 8، وتتم إضافة شطف المخزن المؤقت. مشحونة سلبا على درجة عالية من خلايا الدم هي تمتز فوق العمود بينما يمر مثقبيات مشحونة بأقل تأثيراً سلبيا. مثقبيات جمعها القريبون من الطرد المركزي والتقيد بالفحص المجهري. وعلاوة على ذلك، تعد الطفيليات دون الأضرار الخلوية مع الحفاظ على هذه العدوى.

مثقبيات المنقي مطلوبة لاختبار المناعية؛ وتستخدم في الفحص تريبانوليسيس، معيار الذهب في الأمصال قبعة. الطفيليات الملون تستخدم في اختبار تراص بطاقة (كات) لحقل علم الأمصال. مولدات المضادات من مثقبيات المنقي، مثل بروتين سكري السطحي البديل، اكسوانتيجينس، تستخدم أيضا في تحديدكم المختلفة. ويهدف الإجراء الموضح هنا المثقبيات الأفريقي؛ ونتيجة لذلك، يضطر شروط الفصل اللوني لتكييفها لكل سلالة المثقبيات، وبشكل أعم، للدم من كل الأنواع من الثدييات المضيفة.

هذه رائعة مسببات الأمراض سهولة المنقي ومتاحة للاستخدام في الجزيئي، والكيمياء الحيوية وخلية دراسات علم الأحياء بما في ذلك ثقافة المشارك مع الخلايا المضيفة للتحقيق في علاقات الطفيلي المضيف على مستوى مستقبلات الغشاء، والإشارات، والجينات التعبير؛ المخدرات في المختبرمن الاختبار؛ التحقيق حذف الجينات أو طفرة أو overexpression على العمليات الأيضية ونشوء حيوي سيتوسكيليتال وبقاء الطفيلي.

Introduction

طريقة عرض وصف هنا يسمح فصل مثقبيات، الطفيليات المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري والحيواني (قبعة) من الدم. وهذا هو أفضل طريقة لتشخيص المرحلة الأولى قبعة وعلاوة على ذلك يسمح هذا الأسلوب تنقية الطفيلي التحقيق المصلية وبحوث قوية.

قبعة بسبب ذبابة التسي تسي أحال المثقبيات البروسية الغامبية و rhodesiense ت¹. تتكاثر هذه الطفيليات الأوالي اكستراسيلولارلي في مجرى الدم والليمفاوية، وسوائل الخلالي خلال المرحلة الأولى من المرض (المرحلة هيموليمفاتيك). تبدأ المرحلة الثانية (مرحلة مينينجونسيفاليتيك) عند الطفيليات عبور حاجز الدم في الدماغ؛ علامات عصبية، بما في ذلك اضطراب نوم، التي أعطت لهذا المرض باسم "مرض النوم"، نموذجية لهذه المرحلة الثانية². مثقبيات ذات الصلة (افانسي ت.، النشيطة ت. ت. ب-البروسية، كونجولينسي ت.) هي العوامل المسببة للحيوان المثقبيات الأفريقي (محكمة الاستئناف الإدارية)³.

وتهدف منظمة الصحة العالمية (WHO) للقضاء على قبعة كمشكلة من مشاكل صحة العامة بحلول عام 2020، والتوقف عن الإرسال بحلول عام 2030⁴. وقد الأخذ في الآونة الأخيرة من اختبارات التشخيص السريع تحسين التشخيص المصلية^1،،من⁴⁵. وضعت العديد من الاختبارات التشخيصية الجزيئية ولكن دورها في مجال التشخيص لم المنشأة⁵. يتم استخدامها لتحديد الأنواع الفرعية للمجموعة البروسية وداء المثقبيات شاذة الناجمة عن الطفيليات المسؤولة عن المثقبيات الحيواني⁶.

الكشف عن الطفيليات ضروري للتشخيص والعلاج والمتابعة، كما علم الأمصال يمكن أن تعطي نتائج سلبية كاذبة إيجابية وكاذبة للأسف¹. الملاحظة المباشرة تقنيين من الاولانيات هيموفلاجيلاتي هذه يصعب في حالات القبعة التي تسببها الغامبية. ت.، (أكثر من 95% حالات) كما باراسيتيمياس المنخفضة هي القاعدة، بينما للقبعة الناجمة عن ت. رهوديسينسي، كبير عدد الطفيليات موجودة غالباً في الدم. وقد استخدمت تقنيات تركيز مختلفة، مثل إسقاط سميكة والأنبوبة الشعرية الطرد المركزي (مكافحة الإرهاب)، ولكن فصل الطفيليات من الدم بعمود شاردة-مبادل (دي السليلوز) متبوعاً بالطرد المركزي والمراقبة المجهرية بيليه، وهو الأسلوب الأكثر حساسية (ويمكن الكشف عن الطفيليات حوالي 50 مليلتر من الدم)^1،7. ونتيجة لذلك، هو تنقية مثقبيات بهذا الأسلوب شاردة-مبادلات (السليلوز دي) الأفضل، وحتى هذا التاريخ، أسلوب المرجع لتصور وعزل الطفيليات من الدم لتشخيص القبعة. في الظروف الميدانية، عمود صغير من السليولوز دي قد استخدمت بنجاح وسهلت العديد من التحسينات الملاحظة تقنيين^7،8.

يعتمد الأسلوب الفصل المثقبيات من الدم، المبينة أدناه، في مقابل سطح الطفيلي، الذي أقل سلبية من الثدييات خلايا الدم⁹. من المثير للاهتمام، هذا الأسلوب قد وضعت قبل 50 عاماً، في عام 1968 بالدكتورة شيلا لنهام، ويظل معيار الذهب للكشف وإعداد مثقبيات مجرى الدم. فسريع واستنساخه مثقبيات ساليفاريان من مجموعة واسعة من الثدييات، وتسمح بتشخيص داء المثقبيات الحيوانية والبشرية على حد سواء¹⁰.

للحصول على الطفيليات الحية، وتنقية، تتم إضافة الدم المصاب على عمود مبادل شاردة. الظروف اللوني (أساسا درجة الحموضة، القوة الأيونية للمخازن المؤقتة/وسائل الإعلام) لها لكي تلائم كل الأنواع المثقبيات، وبصورة أعم، كل مزيج من الثدييات خلايا الدم ومثقبيات¹⁰. يتم ضبط العازلة شطف تحديداً على درجة الحموضة 8 لمعظم الأفارقة مثقبيات¹⁰. هذا الأسلوب يفضل تركيز الطفيليات في الدم للمرضى، ونظرا لأن باراسيتيمياس يمكن أن تكون منخفضة للغاية للكشف عنها بواسطة المراقبة المجهرية وحدها، وكما أنها تمكن الفحوص المختبرية. العمل مع مثقبيات طازجة المعزولة وفي الدم من الحيوانات المصابة باستخدام هذا الأسلوب، أكثر صلة بالموضوع للتحقيقات المختلفة من الدراسات مع الطفيليات التي قد تم مثقف في ظروف أكسينيك في المختبر لأجل غير مسمى.

علاقات الطفيلي المضيف يتم دراسة أفضل مع طفيلي إصابة المضيف الطبيعي، ولذلك، ت. موسكولي، طفيلي مورين طبيعية، وهو ممثل مثقبيات خارج الخلية، مزايا عديدة تنطوي الإصابة مورين في الحيوانات المختبرية الصغيرة ولا تتطلب واقية شروط السلامة المستوى (BSL). موسكولي ت. لا تقتل الفئران الأشخاص، خلافا لكثير من الأنواع مثقبيه الأخرى، بما فيها مسببات الأمراض البشرية. لا يتم القضاء موسكولي ت. في الفئران المحرومين من خلية تي ويمكن زيادة باراسيتيمياس في الفئران المصابة بتعديل كمية الغذاء والمغذيات¹¹. ينظم هذا الطفيلي الاستجابة المناعية في التهابات المشارك مع مسببات الأمراض الأخرى¹². هو التعبير عن مستقبلات Fc غشاء موسكولي ت من الفئران المصابة معرض الاختلافات من مثقف ت. موسكولي، على سبيل المثال، فقدت في الثقافات موسكولي ت. أكسينيك، مقارنة بالطفيليات تنقيته من الفئران المصابة^{13 , 14}-العوامل التي تفرز اكسكريتيد (كلية العلوم التربوية) هي أيضا نوعيا وكمياً أقل المعرب عنه في الثقافات المثقبيات أكسينيك وتختلف بين السلالات المعزولة في¹⁵من المناطق الموبوءة. كلية العلوم التربوية هي المستضدات الأولى عرض لاستضافة الجهاز المناعي وذلك تلعب دوراً هاما في المضيف الأولى الاستجابة المناعية¹⁶.

ويسهل هذا البروتوكول في الحيوانات المصابة تجريبيا للفحوص المختبرية، التجريب على عدد أكبر من الطفيليات، والتقليل من عدد الفئران المطلوبة لا سيما عند استخدام الحيوانات إيمونوسوبريسيد. لا يزال يتم تنقيته glycoproteins السطحي البديل (فسجس) التي يتم استخدامها في "اختبار تراص بطاقة" "داء المثقبيات" (كات) في الفحص الشامل من المثقبيات التي تم نشرها في الفئران. هما الاختبارات التشخيصية السريعة (شرائط ملفوفة على حدة) التي أصبحت الآن متاحة للاستخدام في الميدان، تزال تستخدم مصدر معدية نموذج أصلي فسجس ولا في المختبر مثقف مثقبيات^{1،4، 5}. وقد تيسر النهوض بالدراسة من المثقبيات علم المناعة وعلم الأحياء منذ هذه الطفيليات السليلوز تنقية دي يمكن بسهولة الحصول على كميات كبيرة من المضيفين المصابة طبيعيا أو تجريبيا، وفي القوارض خاصة،.

Protocol

التحقيقات مطابقة للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (المعاهد الوطنية للصحة المنشور رقم 85±23، تنقيح عام 1996). بروتوكولات وافق لجنتنا الأخلاقيات المحلية.

1-الحيوانات

1. تبقى الإناث الفئران السويسرية (من-1) الذين تتراوح أعمارهم بين ثمانية إلى عشرة أسابيع من العمر، 20-25 غ، في حيوان الإسكان مرفق خمسة عشر يوما قبل كل تجربة. بيت لهم في خانات مهواة التي يحتفظ بها في المحمية، درجة الحرارة (22 درجة مئوية) والرطوبة (50%) التحكم في الغرفة، مع 12 ساعة تشغيل/إيقاف تشغيل دائرة الضوء.
2. تعطي الحيوانات حرية الوصول إلى الغذاء والماء. التقليل من الألم والمعاناة والشدة وتوفر الإثراء للبيئة.
3. للإسكان، واستخدام الجدران واضحة أقفاص، الإثراء بالعصي الخشبية والورق المقوى الإنفاق. رسم حيوان برفق في نفق بنقلها من القفص إلى كف اليد.
4. القيام بالمراقبة اليومية لتقييم علامات السجود، والعزلة الاجتماعية، وإصابة الجسم، تكدرت الشعر، أو الافتقار إلى الاستمالة.
5. تزن كل الحيوانات مرة واحدة في الأسبوع. إجراء عمليات تفتيش منتظمة من قبل طبيب بيطري.
6. للطفيليات الطبيعية، جمع الدم في ذروة تطفلن والطفيليات التي تسبب وفاة الحيوان، وجمع الدم في اليوم قبل الوفاة المفترضة.
   ملاحظة: يتم تنفيذ جميع التجارب مع العوامل المعدية في غرف مخصصة، وفقا للمبادئ التوجيهية جامعة وافق.

2-المخازن المؤقتة، وسائل الإعلام الأعمال التحضيرية

1. تزن من كل مادة وإضافة الماء المقطر للمخازن المؤقتة التالية:
   1. إعداد تركيز المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (2x):
      غ₂هبو₄ (لا مائي) (MW 141.96 ز) ز 10.14
      نة₂بو₄∙2H₂س (MW 156.01 ز) ز 0.62
      كلوريد الصوديوم (MW 58.44 ز) ز 2.55
      المقطر ح₂س إلى 1 لتر
   2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة-الجلوكوز:
      غ₂هبو₄ (لا مائي) (MW 141.96 ز) ز 5.39
      نة₂بو₄∙2H₂س (MW 156.01 ز) ز 0.31
      كلوريد الصوديوم (MW 58.44 ز) ز 1.70
      الجلوكوز (ز 180 ميغاواط) 10 جرام
      المقطر ح₂س إلى 1 لتر
   3. تحضير 1 م خ₂ص₄.
   4. إعداد المخزن المؤقت شطف: تكملة مخزنة الفوسفات المالحة-الجلوكوز مع
      البنسلين (100 U/mL)، ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل)، والفينول الأحمر (5 ميكروغرام/مل).

3-إعداد دي-السليلوز

1. خطة حوالي 5 ساعات لإعداد دي-السليلوز.
2. أغسل 100 غ دي-السليلوز مع الماء المقطر في قارورة مع رقبة ضيقة والسماح لتسوية، ثم تجاهل الجسيمات الدقيقة. كرر يغسل حتى المادة طافية الواضح.
3. إضافة ل 3 من مركزة 2 × "فوسفاتيبوفيريد المالحة" وآثاره.
4. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.0 مع 1 م خ₂ص₄ ، وتجاهل المادة طافية.
5. تغسل مرتين بالماء المقطر ويترك لتسوية.
6. أغسل والسماح لتسوية مرتين مع 3 لتر فوسفاتيبوفيريد المالحة-الجلوكوز وتجاهل في supernatants.
7. قياس حجم السليلوز وإضافة وحدة تخزين متساوية من المحلول الملحي-الجلوكوز فوسفاتيبوفيريد وتوزيعها في زجاجات بلاستيكية وتخزينها في-20 درجة مئوية.

4-الطفيليات

1. جمع السلالات المثقبيات في المناطق الموبوءة لداء المثقبيات البشري والحيواني. الاحتفاظ بالطفيليات تجميدها في نيتروجين سائل.
   ملاحظة: موسكولي مثقبيه غير ممرضة للبشر وهو المثقبيات خارج الخلية المستخدمة لاستبدال بأمان مثقبيات المسببة للأمراض في مختلف التجارب المختبرية.
2. في حالة التحاليل المختبرية التي تتطلب مسببات الأمراض البشرية، التعامل مع تجارب مع العناية في واقية مناسبة مخصصة سلامة المستوى (BSL) شروط وإجراءات وقائية؛ BSL2 ت. الغامبية و BSL3 ل rhodesiense ت.. في الظروف الميدانية، يتم تأسيس معيار الممارسة الميكروبيولوجية: تأمين أخذ العينات، بيبيتينج الميكانيكية، متكررة إزالة تلوث الأسطح، وتعقيم النفايات.

5-الماوس العدوى

1. سرعة ذوبان الجليد الطفيليات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. نلاحظ قطره دم المصابين المذابة مجهر. تقييم جدوى الطفيلي بقياس النسبة المئوية لأشكال متحركة¹⁷.
3. حقن الطفيليات إينترابيريتونيلي في الفئران (0.5 مل في الماوس). كل يوم، ما بعد الإصابة، جمع 20 ميليلتر من الدم ذيل بثقب الإبرة، ومراقبة تحت مجهر. تقييم تطفلن وفقا هربرت ولومسدين¹⁸ عد الطفيليات في العديد من المجالات المجهر، أو باستخدام هايموسيتوميتير.
4. عندما يصل تطفلن عتبة المحددة لكل سلالة، جمع الدم (1 مل/الماوس) في المخزن المؤقت شطف (5 مل/الماوس) التي تحتوي على الهيبارين (10 U/mL).
   ملاحظة: عن العمل الأصلي ورواية لنهام وغودفري الأمثل قوة الأيونية للفوسفات مخزنة المالحة الجلوكوز للعديد من الأنواع المضيفة/الطفيلي من حل أسهم pH 8.0.

6-الفصل الطفيلي

ملاحظة: يجب القيام بتجارب كل من هذه النقطة فصاعدا في غطاء زراعة الأنسجة ارتداء القفازات. درجة حرارة الغرفة والرطوبة في المختبرات المستخدمة كانت 22 درجة مئوية و 45 في المائة على التوالي. في الظروف الميدانية، تم فصل الطفيلي يؤديها بنجاح في 34 درجة مئوية.

1. ضع حقنه 10 مل في دعم عمودي وإضافة تعميما سابقا قطع قطعة من ورق الترشيح أو الصوف الزجاجي أو الأسفنج السليلوز.
2. صب السليلوز دي في المحاقن حتى يتم التوصل إلى مستوى 8 مل، ثم يغسل مع 25 مل من المخزن المؤقت شطف.
3. إضافة 2 مل دم المخفف بعناية في أعلى العمود ثم قم بإضافة شطف المتوسطة. إضافة شطف المخزن المؤقت وفقا لعبور المثقبيات بانتظام.
4. جمع قطرات النفايات السائلة من الأعمدة في أنبوب الطرد مركزي والتحقق بشكل منتظم لوجود الطفيليات مع مجهر.
5. عندما لم يعد يتم الكشف عن الطفيليات في النفايات السائلة العمود، الطرد المركزي الأنبوب (1,800 س ز، 10 دقائق، في 4 درجات مئوية في المختبر وفي درجة الحرارة المحيطة في ظروف ميدانية).
6. إزالة المادة طافية وتعليق الطفيليات في 1 مل المتوسطة ذات الصلة المطلوبة للخطوة التالية في التحقيق.
7. عد الطفيليات مع هيموسيتوميتير وتمييع لهم في المتوسط المناسبة إذا لزم الأمر.

النتائج

وقد استخدمت مثقبيات المنقاة في الاختبارات الصيدلانية. يتم نقل الطفيليات في آبار الثقافة التي تتضمن تخفيف المسلسل محددة المخدرات، أما وحدها أو مختلطة¹⁹. الملاحظات المجهرية، تقييم حركية هو علامة على استمرارية، يمكن أن يؤديها عندما يجري اختبار دوجس قليلة فقط،...

Discussion

مثقبيات المنقي تمثل وسيلة قوية لدراسة علم المناعة، والكيمياء الحيوية، والخلوية والبيولوجيا الجزيئية. وحصلت مساحات كبيرة من البيانات والنتائج من المثقبيات، ثم مما ساعد على الحصول على المعلومات من خلايا حقيقية النواة الأخرى³⁰. مثقبيات هي أيضا موضوع بحوث هامة ومثيرة للاهتمام ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Pipettes	Falcon	357,551
2 mL Pipettes	Falcon	352,507
Centrifugation tube 50 mL	Falcon	352,070
Centrifuge	Sigma Aldrich	4K15
DEAE cellulose	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
filter paper	Whatman	1,001,125
Flat bottom flask narrow neck	Duran	21 711 76	6000 mL
Glucose	VWR	101174Y	500 G
Heparin	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
Microscope	Olympus	CH-20
Microscope coverslips	Thermofisher scientific	CB00100RA020MNT0
Microscope slides	Thermofisher scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
NaCl	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL	Thermofisher scientific	342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL	Thermofisher scientific	342024-0500
Pasteur Pipette	VWR	BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
Phenol red	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
Syringue	Dutscher	SS+10S21381
Tissue culture hood	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)		Partinico II