Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

Resumo

Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.

Resumo

Este método permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue infectado. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação do parasita permite serológico e investigações de pesquisa.

CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense. Tripanosomas relacionadas são os agentes causadores da tripanossomíase animal. Detecção de tripanossoma é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de chapéu. A técnica descrita aqui é a técnica de deteção de parasita mais sensível, adaptada às condições de campo para o diagnóstico de T. b. gambiense chapéu e pode ser concluída no prazo de uma hora. Sangue é mergulhado em uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) previamente ajustada ao pH 8 e tampão de eluição é adicionado. Altamente negativamente carregados de glóbulos são adsorvidos na coluna Considerando que atravessam as tripanosomas menos negativamente carregadas. Tripanosomas coletadas peletizadas por centrifugação e observadas por microscopia. Além disso, parasitas preparam-se, sem dano celular, embora mantendo sua infecciosidade.

Tripanosomas purificadas são necessárias para testes imunológicos; Eles são usados no ensaio de trypanolysis, o padrão-ouro na serologia de chapéu. Manchado de parasitas são utilizadas no teste de aglutinação de cartão (CATT) para sorologia de campo. Antígenos de tripanosomas purificadas, como a glicoproteína de superfície variante, exoantigens, também são utilizados em diversos imunoensaios. O procedimento descrito aqui é projetado para tripanosomas africanas; por conseguinte, condições cromatográficas tem que ser adaptado para cada estirpe tripanossoma e mais geralmente, para o sangue de cada espécie de hospedeiro mamífero.

Estas fascinantes patógenos são facilmente purificada e disponíveis para uso em bioquímicos, moleculares e estudos de biologia, incluindo co-cultura com células hospedeiras para investigar relações hospedeiro-parasita a nível dos receptores de membrana, sinalização e gene da pilha expressão; drogas testes em vitro; investigação de exclusão genética, mutação ou superexpressão em processos metabólicos, a biogênese do citoesqueleto e a sobrevivência do parasita.

Introdução

O método apresentado descrito aqui, permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação de parasita permite robusto inquérito sorológico e pesquisa.

CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense¹. Estes protozoários parasitas multiplicam extracelularmente no sangue, linfa e líquidos intersticiais durante a primeira fase da doença (estágio hemolinfático). O segundo estágio (meningoencephalitic) começa quando parasitas atravessam a barreira hemato-encefálica; sinais neurológicos, incluindo um distúrbio do sono, que deu o seu nome "doença do sono" para esta doença, são típicos deste segundo estágio². Tripanosomas relacionadas (T. evansi, T. congolensee, T. vivax, T. b. brucei) são os agentes causadores de animal tripanossomose Africana (AAT)³.

A Organização Mundial de saúde (OMS) tem como objetivo eliminar o chapéu como um problema de saúde pública até 2020 e para parar a transmissão por 2030⁴. A recente introdução de testes de diagnóstico rápido tem melhorado diagnóstico sorológico^1,4,5. Foram desenvolvido vários testes de diagnóstico molecular, mas seu papel no diagnóstico de campo ainda não foi estabelecido⁵. Eles são usados para identificar as sub-espécies do grupo brucei e tripanossomíase atípica causada por parasitas responsáveis pela tripanossomose animal⁶.

A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento, como serologia pode dar resultados falsos positivos e infelizmente falso negativo¹. A observação microscópica direta destes protistas hemoflagelado é difícil nos casos de chapéu que são causados por T. b. gambiense, (mais de 95% dos casos) como parasitemias baixas são a regra, Considerando que para chapéu causada por T. b. rhodesiense, um grande número de parasitas está frequentemente presente no sangue. Várias técnicas de concentração têm sido utilizadas, tais como a gota espessa e centrifugação do tubo capilar (CTC), mas a separação de parasitas do sangue por uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) seguido de centrifugação e observação microscópica do pellet, é o método mais sensível (cerca de 50 parasitas/mL de sangue pode ser detectado)^1,7. Consequentemente, a purificação de tripanosomas por esse método de ânion-trocadores (celulose DEAE) é o melhor e, até à data, o método de referência para visualização e isolando os parasitas do sangue para o diagnóstico de chapéu. Em condições de campo, uma mini coluna de celulose DEAE tem sido utilizada com sucesso e várias melhorias facilitaram a observação microscópica^7,8.

O método de separação de tripanossoma do sangue, descrito abaixo, depende a carga superficial do parasita, que é menos negativa do que células de sangue de mamíferos⁹. Curiosamente, este método foi desenvolvido há 50 anos atrás, em 1968 pelo Dr. Sheila Lanham e continua a ser o padrão ouro para detecção e preparação de tripanosomas da corrente sanguínea. É rápido e reprodutível para salivarian tripanosomas de uma grande variedade de mamíferos, permitindo o diagnóstico de ambos tripanossomíase humana e animal,¹⁰.

Para obter vida, purificadas de parasitas, sangue infectado é adicionado em uma coluna de permutador de aniões. Condições cromatográficas (principalmente pH, força iônica de amortecedores/mídia) têm de ser adaptadas a cada espécie de tripanossoma e mais geralmente, para cada combinação de células de sangue de mamíferos e tripanosomas¹⁰. Tampão de eluição é precisamente ajustada ao pH de 8 para mais africano tripanosomas¹⁰. Esse método favorece a concentração de parasitas no sangue dos pacientes, porque parasitemias pode ser muito baixa para ser detectada por observação microscópica sozinha, e também permite a exames laboratoriais. Trabalhar com tripanosomas recém isoladas e no sangue de animais infectados, usando esta técnica, é mais pertinente para diversas investigações do que os estudos com parasitas que têm sido cultivadas em condições de axénica no laboratório por um período indeterminado.

Relações hospedeiro-parasita são mais bem estudadas com um parasita a infectar seu hospedeiro natural, portanto, T. disponibilizado, um parasita murino natural, que é representante de tripanosomas extracelulares, tem muitas vantagens como infecção murino envolve-se em um animal de laboratório pequeno e não requer condições de nível (BSL) de segurança de risco biológico. T. disponibilizado não mata camundongos imunocompetentes, ao contrário de muitas outras espécies de Trypanosoma , incluindo patógenos humanos. T. disponibilizado não são eliminadas em ratos privados de células T e parasitemias pode ser aumentada em ratos infectados, modificando a ingestão de alimentos e nutrientes¹¹. Este parasita modula a resposta imune em co-infecções com outros patógenos¹². T. disponibilizado de diferenças de exposição de ratos infectados de culta T. disponibilizado, por exemplo, a expressão de receptores de membrana Fc é perdida em culturas de axénica T. disponibilizado , em comparação com parasitas purificadas de ratos infectados^{13 , 14}. fatores secretados por Excreted (FSE) também são qualitativa e quantitativamente menos expressos em culturas de tripanossoma axénica e diferem entre as cepas isoladas em áreas endêmicas¹⁵. ESF são os antígenos primeiros a ser exibido para o sistema imunológico do hospedeiro e portanto desempenham um papel importante no acolhimento inicial da resposta imune¹⁶.

Em animais experimentalmente infectados para exames laboratoriais, este protocolo facilita a experimentação em um número maior de parasitas, minimizando o número de ratos necessárias especialmente ao utilizar animais imunossuprimidos. As glicoproteínas de superfície variantes (VSGs) que são usadas no teste de aglutinação de cartão para tripanossomíase (CATT) em triagem em massa ainda são purificadas de tripanosomas que são propagadas em ratos. Os dois testes diagnósticos rápidos (cassettes embrulhados individualmente) que agora estão disponíveis para uso no campo, ainda estão usando uma fonte infecciosa modelo de nativo VSGs e não em vitro cultivadas tripanosomas^{1,4, 5}. o avanço no estudo da imunologia tripanossoma e biologia tem sido facilitado, desde que estes DEAE celulose purificada parasitas podem ser facilmente obtidas em grandes quantidades de hospedeiros naturalmente ou experimentalmente infectados e em particulares, roedores.

Protocolo

Investigações em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicação n º 85±23, revista em 1996). Os protocolos foram aprovados pelo nosso Comitê de ética local.

1. os animais

1. Manter camundongos Swiss (de-1) fêmeas com idade de oito a dez semanas de idade, 20-25 g, em um animal habitação facilidade quinze dias antes de cada experimento. Colocá-los em caixas ventiladas que são mantidas em um protegido, temperatura (22 ° C) e umidade (50%) controlado por quarto, com 12 horas on/off ciclo de luz.
2. Dê animais livre acesso à comida e água. Minimizar a dor, sofrimento e angústia e proporcionar o enriquecimento do ambiente.
3. Para a carcaça, use clear-murado gaiolas, enriquecimento com varas de madeira e papelão túneis. Delicadamente, desenhe um animal dentro de um túnel para transferi-lo da gaiola para a palma da mão.
4. Realize monitoramento diário para avaliar sinais de prostração, isolamento social, lesão de corpo, cabelo babado ou falta de higiene.
5. Pese cada animal uma vez por semana. Realize inspecções periódicas por um veterinário.
6. Para parasitas naturais, coletar sangue no pico da parasitemia e parasitas causando a morte de animais, coletar sangue na véspera da morte presumida.
   Nota: Todas as experiências com agentes infecciosos são realizadas em salas dedicadas, de acordo com as diretrizes da Universidade aprovada.

2. buffers, preparações de mídia

1. Pesar cada substância e adicionar água destilada para os buffers de seguintes:
   1. Prepare-se concentrada tampão fosfato-salino (2x):
      Na₂HPO₄ (anidro) (MW 141,96 g) g 10,14
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,62 g
      NaCl (58,44 g de MW) 2,55 g
      Destilada, H₂O para 1 L
   2. Prepare o tampão fosfato salino-glicose:
      Na₂HPO₄ (anidro) (MW 141,96 g) 5,39 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,31 g
      NaCl (58,44 g de MW) 1,70 g
      Glicose (180g de MW) 10 g
      Destilada, H₂O para 1 L
   3. Prepare 1 M KH₂PO₄.
   4. Preparar o tampão de eluição: Suplemento tampão fosfato salino-glicose com
      Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e vermelho de fenol (5 µ g/mL).

3. preparação do DEAE-celulose

1. Plano de cerca de 5 horas para a preparação de DEAE-celulose.
2. Lave a 100 g de DEAE-celulose com água destilada em um balão com uma garganta estreita e deixe para resolver e, em seguida, descartar partículas finas. Repita lavagens até que o sobrenadante é claro.
3. Adicione 3 L de concentrado 2x Phosphate-Buffered salina e mexa.
4. Ajustar o pH para 8,0 com 1 M KH₂PO₄ e descartar o sobrenadante.
5. Lave duas vezes com água destilada e deixe repousar.
6. Lave e deixe de resolver duas vezes com 3 litros Phosphate-Buffered salina-glicose e descartar os sobrenadantes.
7. Medir o volume de celulose e adicionar um volume igual de solução salina Phosphate-Buffered-glicose, distribuir em garrafas de plástico e armazenar a-20 ° C.

4. parasitas

1. Recolha as estirpes tripanossoma em áreas endêmicas para tripanossomíase humana e animal. Manter parasitas congeladas em nitrogênio líquido.
   Nota: Trypanosoma disponibilizado é não-patogênicas para os seres humanos e é uma tripanossoma extracelular usada para substituir com segurança tripanosomas patogênicas em vários experimentos de laboratório.
2. No caso de exames laboratoriais que exigem agentes patogénicos humanos, lidar com experiências com cuidado em condições de nível (BSL) apropriadas de risco biológico dedicado segurança e precauções; BSL2 por T. b. gambiense e BSL3 por T. b. rhodesiense. Em condições de campo, prática padrão microbiológica é estabelecida: secure amostragem, pipetagem mecânica, frequente descontaminação de superfícies e esterilização de resíduos.

5. infecção do Mouse

1. Descongelar rapidamente parasitas em banho maria a 37 ° C.
2. Observa-se uma gota de sangue infectado descongelada com um microscópio. Avalie a viabilidade de parasita medindo a porcentagem de formas móveis¹⁷.
3. Injete parasitas intraperitonealmente em camundongos (0,5 mL por rato). Cada dia, pós infecção, coletar 20 µ l de sangue por punção com agulha e observar ao microscópio. Avalie a parasitemia de acordo com Herbert e Lumsden¹⁸ pela contagem de parasitas em vários campos, microscópio, ou usando um haemocytometer.
4. Quando a parasitemia atinge um limite definido para cada estirpe, colete o sangue (1 mL/mouse) no tampão de eluição (5 mL/mouse) contendo heparina (10 U/mL).
   Nota: O trabalho original e inovador de Lanham e Godfrey relatou que a força iônica ideal de fosfato tamponado salina glicose para diversas espécies de parasita/hospedeiro de uma solução de pH 8.0.

6. separação de parasita

Nota: Todas as experiências a partir deste momento devem ser feitas em uma capa de tecido cultura usando luvas. A temperatura e a umidade nos laboratórios utilizados foram a 22 ° C e 45% respectivamente. Em condições de campo, separação do parasita tem sido realizou com sucesso a 34 ° C.

1. Coloque uma seringa de 10 mL em um suporte vertical e adicionar uma circular previamente cortada, pedaço de papel de filtro, lã de vidro ou uma esponja de celulose.
2. Despeje a celulose DEAE a seringa até o nível 8 mL é alcançada e em seguida lavar com 25 mL de tampão de eluição.
3. Cuidadosamente, adicionar 2 mL de sangue diluído no topo da coluna e em seguida, adicionar meio de eluição. Regularmente adicione tampão de eluição de acordo com o trânsito dos tripanosomas.
4. Coletar efluentes gotas de colunas em um tubo de centrífuga e verificar regularmente a presença de parasitas com um microscópio.
5. Quando parasitas já não são detectadas no efluente da coluna, centrifugar o tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C no laboratório e à temperatura ambiente em condições de campo).
6. Remover o sobrenadante e suspender os parasitas em 1 mL de meio de relevantes necessário para o próximo passo da investigação.
7. Contagem de parasitas com um hemocytometer e diluí-los em meio apropriado, se necessário.

Resultados

Tripanosomas purificadas foram usadas em testes farmacêuticos. Parasitas são transferidas para poços de cultura contendo diluições em série de drogas específicas, sozinho ou misturado¹⁹. Observações microscópicas, avaliar a motilidade é um marcador da viabilidade, pode ser executada quando estão a ser testados apenas alguns dugs, Considerando que o ensaio da viabilidade de células AlamarBlue é um excelente método para ensaios de grande mobilidade dur...

Discussão

Tripanosomas purificadas representam um meio poderoso para estudar imunologia, bioquímica, celular e biologia molecular. Grandes extensões de dados e os resultados foram obtidos de tripanosomas, que então tem ajudado a obter informações de outras células eucarióticas³⁰. Tripanosomas são também objecto de investigação importante e interessante porque eles criaram numerosos mecanismos que lhes permitam sobreviver e crescer em dois ambientes muito diferentes: o vetor mosca tsé-tsé e o ho...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Pipettes	Falcon	357,551
2 mL Pipettes	Falcon	352,507
Centrifugation tube 50 mL	Falcon	352,070
Centrifuge	Sigma Aldrich	4K15
DEAE cellulose	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
filter paper	Whatman	1,001,125
Flat bottom flask narrow neck	Duran	21 711 76	6000 mL
Glucose	VWR	101174Y	500 G
Heparin	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
Microscope	Olympus	CH-20
Microscope coverslips	Thermofisher scientific	CB00100RA020MNT0
Microscope slides	Thermofisher scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
NaCl	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL	Thermofisher scientific	342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL	Thermofisher scientific	342024-0500
Pasteur Pipette	VWR	BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
Phenol red	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
Syringue	Dutscher	SS+10S21381
Tissue culture hood	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)		Partinico II