Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Riepilogo

Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.

Abstract

Questo metodo consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), da sangue infetto. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi sierologico e le indagini di ricerca.

CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.. Trypanosomes correlate sono gli agenti causali di tripanosomiasi animale. Rilevamento di Tripanosoma è essenziale per la diagnosi, trattamento e follow-up di cappello. La tecnica qui descritta è la tecnica più sensibile di rilevazione parassita, adattata alle condizioni del campo per la diagnosi del gambiense del t.b. cappello e può essere completata entro un'ora. Sangue è a strati su una colonna di scambiatore di anioni (DEAE cellulosa) precedentemente regolata a pH 8 e tampone di eluizione viene aggiunto. Caricate altamente negativa globuli sono adsorbiti sulla colonna mentre il meno negativamente trypanosomes passano attraverso. Trypanosomes raccolti sono pellettati mediante centrifugazione e osservata da microscopia. Inoltre, i parassiti sono preparati senza danno cellulare, pur mantenendo la loro infettività.

Purificata trypanosomes sono necessari per i test immunologici; sono utilizzati nell'analisi della trypanolysis, il gold standard nella sierologia di cappello. Macchiato parassiti sono utilizzati nel test di agglutinazione di carta (CATT) per sierologia di campo. Gli antigeni da trypanosomes purificata, come variante della glicoproteina di superficie, esoantigeni, sono utilizzati anche in vari test immunologici. La procedura qui descritta è progettata per tripanosomi africani; di conseguenza, devono essere adattati per ogni ceppo di Tripanosoma e più in generale, per il sangue di ogni specie di mammifero ospite cromatografia condizioni.

Queste affascinanti gli agenti patogeni sono facilmente purificato e disponibile per l'uso biochimici, molecolari e cellulari tra cui co-coltura con cellule dell'ospite per indagare le relazioni ospite-parassita a livello dei recettori di membrana, segnalazione e gene di studi di biologia espressione; droga test in vitro; indagine di omissione del gene, mutazione o sovraespressione sui processi metabolici, biogenesi del citoscheletro e sopravvivenza del parassita.

Introduzione

Il metodo presentato descritto qui consente la separazione dei tripanosomi, parassiti responsabili di tripanosomiasi africana umana e animale (HAT), dal sangue. Questo è il metodo migliore per la diagnosi della prima fase cappello e inoltre questo metodo di purificazione del parassita permessi robusto indagine sierologica e di ricerca.

CAPPELLO è causato da Mosca Tse-Tse trasmessi Trypanosoma brucei gambiense e rhodesiense del t.b.¹. Questi protozoi parassiti si moltiplicano extracellularly nella circolazione sanguigna, linfatica e fluidi interstiziali durante la prima fase della malattia (stadio emolinfatico). La seconda fase (fase meningoencephalitic) inizia quando i parassiti attraversano la barriera ematoencefalica; segni neurologici, tra cui un disturbo del sonno, che ha dato il suo nome "malattia del sonno" per questa malattia, sono tipici di questa seconda fase². Trypanosomes correlate (T. evansi, T. congolense, vivax T. brucei b. T.) sono gli agenti causali di animale africano Tripanosoma (AAT)³.

L'organizzazione mondiale della sanità (OMS) mira all'eliminazione cappello come un problema di salute pubblica entro il 2020 e di fermare la trasmissione di 2030⁴. La recente introduzione di test di diagnosi rapida ha una migliore diagnosi sierologica^1,4,5. Diversi test diagnostici molecolari sono stati sviluppati ma il loro ruolo nella diagnostica sul campo non è stato ancora stabilito⁵. Essi vengono utilizzati per identificare la sub-specie del gruppo brucei e tripanosomiasi atipica causata da parassiti responsabili di animale Tripanosoma⁶.

La rilevazione del parassita è essenziale per la diagnosi, trattamento e follow-up, come la sierologia può dare risultati falsi positivi e purtroppo falsi negativi¹. L'osservazione microscopica diretta di questi protisti emoflagellato è difficile nei casi di cappello che sono causati da gambiense del t.b., (più di 95% dei casi) come bassi parassitemie sono la regola, mentre per il cappello causato da rhodesiense del t.b., un grande numero di parassiti sono spesso presente nel sangue. Sono state utilizzate varie tecniche di concentrazione, come goccia spessa e centrifugazione tubo capillare (CTC), ma la separazione dei parassiti dal sangue di una colonna di scambiatore di anioni (DEAE cellulosa) seguita da centrifugazione e osservazione al microscopio della a pellet, è il metodo più sensibile (può essere rilevato circa 50 parassiti/mL di sangue)^1,7. Di conseguenza, la purificazione di trypanosomes da questo metodo di anione-scambiatori (DEAE cellulosa) è il migliore e, ad oggi, il metodo di riferimento per la visualizzazione e isolare i parassiti dal sangue per la diagnosi di cappello. In condizioni di campo, una mini-colonna di DEAE cellulosa è stata utilizzata con successo e diversi miglioramenti hanno facilitato l'osservazione microscopica^7,8.

Il metodo di separazione Tripanosoma dal sangue, descritto di seguito, dipende dalla carica superficiale del parassita, che è meno negativo di cellule del sangue dei mammiferi⁹. Interessante, questo metodo è stato sviluppato 50 anni fa, nel 1968 da Dr. Sheila Lanham e rimane il gold standard per il rilevamento e la preparazione dei tripanosomi flusso sanguigno. È veloce e riproducibile per salivarian trypanosomes da una vasta gamma di mammiferi, permettendo la diagnosi di entrambi di tripanosomiasi animale e umano¹⁰.

Per ottenere parassiti living, purificati, sangue infetto è aggiunto su una colonna di scambiatore di anioni. Condizioni di cromatografia (principalmente pH, forza ionica del buffer e media) devono essere adattati ad ogni specie di Tripanosoma e più in generale, ad ogni mix di cellule del sangue dei mammiferi e trypanosomes¹⁰. Tampone di eluizione è regolato precisamente a pH 8 per l'africano trypanosomes¹⁰. Questo metodo favorisce la concentrazione di parassiti trovati nel sangue dei pazienti, perché parassitemie può essere troppo bassa per essere rilevata da osservazione microscopica da solo, e permette anche le indagini del laboratorio. Lavorare con trypanosomes appena isolate e il sangue di animali infetti, utilizzando questa tecnica, è più pertinente per varie indagini rispetto agli studi con i parassiti che sono stati coltivati in condizioni axeniche in laboratorio per un periodo indefinito.

Rapporti ospite-parassita sono meglio studiati con un parassita che infetta il sua ospite naturale, pertanto, musculi T., un parassita murino naturale, che è rappresentante di trypanosomes extracellulare, ha molti vantaggi come infezione murina coinvolge un piccolo laboratorio animale e non necessita di condizioni di livello (BSL) di sicurezza biohazard. T. musculi non uccidere i topi immunocompetenti, a differenza di molte altre specie di Trypanosoma , tra cui agenti patogeni umani. T. musculi non vengono eliminate in topi privati del T cell e parassitemie può essere aumentato in topi infettati modificando l'assunzione degli elementi nutritivi e cibo¹¹. Questo parassita modula la risposta immunitaria in co-infezioni con altri agenti patogeni¹². T. musculi da topi infetti esibire differenze da coltivate musculi T., ad esempio, l'espressione di recettori di membrana Fc viene perso in T. musculi colture axeniche, rispetto ai parassiti purificati da topi infetti^{13 , 14}. fattori secreti Excreted (FSE) sono anche qualitativamente e quantitativamente meno espressa nelle colture axeniche Tripanosoma e differiscono tra i ceppi isolati in zone endemiche¹⁵. FSE sono gli antigeni primi da visualizzare per il sistema immunitario dell'ospite e quindi giocare un ruolo importante nell'host iniziale risposta immunitaria¹⁶.

Negli animali infettati sperimentalmente per le indagini del laboratorio, questo protocollo facilita la sperimentazione su un maggior numero di parassiti, riducendo al minimo il numero di topi necessaria soprattutto quando si utilizzano animali immunodepressi. Le glicoproteine di superficie variante (generatori di segnale vettoriale) che vengono utilizzate nel Test di agglutinazione di carta per tripanosomiasi (CATT) in screening di massa sono ancora purificate da trypanosomes che vengono propagati in ratti. I due test diagnostici rapidi (confezionati singolarmente cassette) che sono ora disponibili per l'uso in campo, ancora utilizza un'origine infettiva modello nativo generatori di segnale vettoriale e non in vitro coltivate trypanosomes^{1,4, 5}. l'avanzamento nello studio del Tripanosoma immunologia e biologia è stata facilitata dal momento che questi parassiti DEAE cellulosa purificata possono essere facilmente ottenuti in grandi quantità dai padroni di casa naturalmente o sperimentalmente infetti e in particolare, roditori.

Protocollo

Indagini conformano alle linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (NIH pubblicazione n. 85±23, riveduta 1996). Protocolli sono stati approvati dal nostro comitato etico locale.

1. gli animali

1. Tenere topi Swiss (OF-1) femmina invecchiati otto-dieci settimane vecchie, 20-25 g, in un animale alloggiamento impianto quindici giorni prima di ogni esperimento. Ospitarli in scatole ventilate che vengono tenuti in un protetto, temperatura (22 ° C) e umidità (50%) controllato la camera, con 12 ore ciclo di luce di accensione e spegnimento.
2. Dare animali libero accesso a cibo e acqua. Ridurre al minimo dolore, sofferenza e angoscia e fornire un arricchimento dell'ambiente.
3. Per l'alloggiamento, utilizzare gabbie con pareti chiare, arricchimento con bastoni di legno e cartone tunnel. Tirare delicatamente verso un animale in un tunnel per il trasferimento dalla gabbia al palmo della mano.
4. Esegue il monitoraggio giornaliero per valutare segni di prostrazione, isolamento sociale, lesioni corporali, capelli arruffati o mancanza di governare.
5. Pesare ogni animale una volta a settimana. Eseguire ispezioni regolari da parte di un veterinario.
6. Per i parassiti naturali, raccogliere il sangue al picco di parassitemia e per i parassiti che causano la morte degli animali, raccogliere il sangue il giorno prima della morte presunta.
   Nota: Tutti gli esperimenti con agenti infettivi sono eseguiti nelle sale dedicate, secondo linee guida Università approvato.

2. tamponi, preparazioni di media

1. Pesare ciascuna sostanza e aggiungere acqua distillata per i buffer seguenti:
   1. Preparare la soluzione tampone fosfato concentrato (2x):
      Na₂HPO₄ (anidro) (MW 141,96 g) 10,14 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,62 g
      NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g
      Acqua distillata di H₂O a 1 L
   2. Preparare il tampone fosfato salino-glucosio:
      Na₂HPO₄ (anidro) (MW 141,96 g) 5,39 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,31 g
      NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g
      Glucosio (MW 180g) 10 g
      Acqua distillata di H₂O a 1 L
   3. Preparare 1 M KH₂PO₄.
   4. Preparare il tampone di eluizione: Supplemento Phosphate-Buffered Saline-glucosio con
      Penicillina (100 U/mL), streptomicina (100 µ g/mL) e rosso fenolo (5 µ g/mL).

3. preparazione di DEAE-cellulosa

1. Piano circa 5 ore per la preparazione di DEAE-cellulosa.
2. 100 g di DEAE-cellulosa con acqua distillata in una boccetta con un collo stretto di lavare e far risolvere, poi scarta le particelle fini. Ripetere i lavaggi fino a quando il surnatante è chiaro.
3. Aggiungere 3 L di concentrato 2X Phosphate-Buffered Saline e mescolare.
4. Regolare il pH a 8.0 con 1m KH₂PO₄ ed eliminare il surnatante.
5. Lavare due volte con acqua distillata e lasciare a stabilirsi.
6. Lavare e far pagare due volte con 3 litri Phosphate-Buffered Saline-glucosio e scartare i surnatanti.
7. Misurare il volume di cellulosa e aggiungere un volume equivalente di Phosphate-Buffered Saline-glucosio, distribuire in bottiglie di plastica e conservare a-20 ° C.

4. parassiti

1. Raccogliere ceppi Tripanosoma nelle aree endemiche per la tripanosomiasi umana e animale. Mantenere i parassiti congelati in azoto liquido.
   Nota: Trypanosoma musculi è non patogeni per l'uomo ed è un extracellulare Tripanosoma utilizzato per sostituire tranquillamente trypanosomes patogeni in vari esperimenti di laboratorio.
2. Nel caso di indagini di laboratorio che richiedono agenti patogeni umani, gestire esperimenti con cura in condizioni di livello (BSL) di sicurezza biohazard appropriato dedicato e precauzioni; BSL2 per gambiense del t.b. e BSL3 per rhodesiense del t.b.. In condizioni di campo, viene stabilita la pratica standard microbiologico: sicuro campionamento, meccanico di pipettaggio, frequenti decontaminazione delle superfici e la sterilizzazione dei rifiuti.

5. infezione di Mouse

1. Scongelare rapidamente i parassiti in un bagno di acqua a 37 ° C.
2. Osservare una goccia di sangue infetto scongelati con un microscopio. Valutare parassita vitalità misurando la percentuale di forme mobili¹⁷.
3. Iniettare parassiti per via intraperitoneale nei topi (0,5 mL per topo). Ogni giorno, dopo l'infezione, raccogliere 20 µ l di sangue di coda dalla puntura dell'ago e osservare al microscopio. Valutare la parassitemia secondo Herbert e Lumsden¹⁸ contando i parassiti in diversi campi di microscopio, o utilizzando un emocitometro.
4. Quando la parassitemia raggiunge una soglia definita per ogni ceppo, raccogliere il sangue (1 mL/mouse) nel buffer di eluizione (5 mL/topo) contenente eparina (10 U/mL).
   Nota: Il lavoro originale e romanzo di Lanham e Godfrey segnalato che la forza ionica ottima di fosfato tampone salino glucosio per diverse specie di ospite/parassita da una soluzione madre di pH 8.0.

6. separazione di parassita

Nota: Tutti gli esperimenti da questo punto in poi devono avvenire in una cappa di coltura del tessuto con i guanti. La temperatura e l'umidità nei laboratori utilizzati erano 22 ° C e 45% rispettivamente. In condizioni di campo, separazione del parassita è stata eseguita con successo a 34 ° C.

1. Inserire una siringa da 10 mL in un supporto verticale e aggiungere una circolare tagliata precedentemente, pezzo di carta da filtro, lana di vetro o spugna di cellulosa.
2. Versare il DEAE cellulosa nella siringa finché non viene raggiunto il livello 8 mL, poi lavare con 25 mL di tampone di eluizione.
3. Attentamente aggiungere 2 mL di sangue diluito nella parte superiore della colonna e quindi aggiungere mezzo di eluizione. Regolarmente aggiungere tampone di eluizione secondo il transito dei tripanosomi.
4. Raccogliere gocce degli effluenti dalle colonne in una provetta da centrifuga e verificare regolarmente la presenza di parassiti con un microscopio.
5. Quando i parassiti non vengono rilevati nell'effluente colonna, centrifugare la provetta (1.800 x g, 10 minuti, a 4 ° C in laboratorio e a temperatura ambiente in condizioni di campo).
6. Rimuovere il supernatante e sospendere i parassiti in 1 mL di terreno pertinente richiesto per il prossimo passo investigativo.
7. Contare i parassiti con un emocitometro e diluirli in mezzo appropriato se necessario.

Risultati

Trypanosomes purificati sono stati utilizzati in prove farmaceutiche. I parassiti vengono trasferiti nei pozzetti di coltura contenenti diluizioni seriali di droghe specifiche, da solo o misto¹⁹. Osservazioni al microscopio, valutazione della motilità è un indicatore della redditività, possono essere eseguite quando solo pochi Dug sono in fase di test, mentre AlamarBlue cella analisi di attuabilità è un metodo eccellente per saggi di grande motilità durante l...

Discussione

Purificata trypanosomes rappresentano un potente mezzo per studiare immunologia, biochimica, biologia molecolare e cellulare. Grandi distese di dati e risultati sono state ottenute da trypanosomes, che ha poi contribuito a ottenere informazioni dalle altre cellule eucariotiche³⁰. Trypanosomes sono anche oggetto di ricerca importante e interessante, perché essi hanno messo a punto numerosi meccanismi che consentono loro di sopravvivere e crescere in due ambienti molto diversi: il vettore di Mosca ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Pipettes	Falcon	357,551
2 mL Pipettes	Falcon	352,507
Centrifugation tube 50 mL	Falcon	352,070
Centrifuge	Sigma Aldrich	4K15
DEAE cellulose	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
filter paper	Whatman	1,001,125
Flat bottom flask narrow neck	Duran	21 711 76	6000 mL
Glucose	VWR	101174Y	500 G
Heparin	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
Microscope	Olympus	CH-20
Microscope coverslips	Thermofisher scientific	CB00100RA020MNT0
Microscope slides	Thermofisher scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
NaCl	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL	Thermofisher scientific	342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL	Thermofisher scientific	342024-0500
Pasteur Pipette	VWR	BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
Phenol red	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
Syringue	Dutscher	SS+10S21381
Tissue culture hood	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)		Partinico II