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摘要

这种从血液中分离锥虫的方法取决于它们的表面电荷比哺乳动物的血细胞更少阴性。受感染的血液被放置在阴离子交换器柱上并进行治疗。这种方法是非洲锥虫病最适合的诊断方法, 为免疫、生物、生化、药物和分子生物学研究提供纯化寄生虫。

摘要

这种方法允许分离锥虫体, 寄生虫负责动物和人类非洲锥虫病 (HAT), 从受感染的血液。这是诊断第一阶段 HAT 的最佳方法, 而且这种寄生虫纯化方法允许血清学和研究调查。

HAT 是由采采蝇传播的冈比亚锥虫和罗得西亚 t. b.引起的。相关的锥虫体是动物锥虫病的病原体。锥虫体检测对于 HAT 的诊断、治疗和随访至关重要。这里描述的技术是最敏感的寄生虫检测技术, 适用于现场条件的诊断冈比亚 hat , 可以在一个小时内完成。血液被分层到以前调整为 pH 值8的阴离子交换器柱 (DEAE 纤维素) 上, 并添加洗脱缓冲液。高负电荷的血细胞被吸附在色谱柱上, 而负电荷的锥虫体通过的程度较低。采集的色氨酸体是通过离心造粒和显微镜观察的。此外, 寄生虫的制备没有细胞损伤, 同时保持其传染性。

免疫检测需要纯化的色氨酸体;它们被用于色氨酸溶解试验, 这是 HAT 血清学中的金标准。染色寄生虫用于卡片凝集试验 (CATT) 的现场血清学。纯化的锥细胞的抗原, 如不同的表面糖蛋白, 外抗原, 也用于各种免疫检测。这里描述的程序是为非洲锥虫设计的;因此, 色谱条件必须适应每一个锥虫株, 更广泛地说, 适应每种寄主哺乳动物的血液。

这些迷人的病原体很容易被纯化, 可用于生化、分子和细胞生物学研究, 包括与宿主细胞共培养, 以调查在膜受体、信号和基因水平上的宿主-寄生虫关系表达;体外药物检测;研究代谢过程、细胞骨架生物发生和寄生虫存活的基因缺失、突变或过度表达。

引言

这里介绍的方法允许从血液中分离锥虫体、负责动物和人类非洲锥虫病 (HAT) 的寄生虫。这是诊断第一阶段 HAT 的最佳方法, 而且这种寄生虫纯化方法可以进行可靠的血清学和研究研究。

HAT 是由采采蝇传播的冈比亚锥虫和罗得西亚酮 1.引起的。这些原生动物寄生虫在疾病的第一阶段 (血液淋巴阶段) 在血液、淋巴和间质液体中外源性繁殖。第二阶段 (脑膜-脑期) 从寄生虫越过血脑屏障开始;神经体征, 包括睡眠障碍, 将其命名为 "昏睡病", 是第二阶段2的典型。相关的锥虫体 (t. evansi, t. congolense, t. vivax, t. b. brucei) 是非洲动物锥虫病 (aat) 3 的致病因子.

世界卫生组织 (世卫组织) 的目标是到2020年消除 HAT 这一公共卫生问题, 到2030年停止传播.最近引入的快速诊断测试改善了血清学诊断 1,4,5。已经开发了一些分子诊断测试, 但它们在现场诊断中的作用尚未确立5。它们被用来鉴定布鲁谢群和非典型锥虫病引起的由负责动物锥虫病的寄生虫6引起的亚种。

寄生虫的检测对诊断、治疗和随访至关重要, 因为血清学可以给出假阳性, 不幸的是假阴性结果1。在由冈比亚 t. b. b.引起的 hat 情况下, (95% 以上的病例) 通常是低寄生虫, 而对于导致引起的 hat, 则很困难。血液中经常存在的寄生虫数量。采用了各种浓缩技术, 如厚滴和毛细管离心 (CTC), 但通过一列阴离子交换器 (DEAE 纤维素) 从血液中分离寄生虫, 然后对其进行离心和微观观察。颗粒, 是最敏感的方法 (约50种血液寄生虫)1,7。因此, 采用这种阴离子交换器 (DEAE 纤维素) 方法纯化锥虫体是最好的, 到目前为止, 也是将血液中的寄生虫可视化和分离的参考方法, 用于 HAT 的诊断。在野外条件下, 成功地使用了 deae 纤维素的小型柱, 并通过了一些改进, 促进了显微镜观察 7,8。

从血液中分离锥虫的方法, 描述如下, 取决于寄生虫表面电荷, 这是较少阴性比哺乳动物血细胞9。有趣的是, 这种方法是50年前由希拉·兰姆博士在1968年开发的, 仍然是检测和制备血液锥虫的黄金标准。它是快速和可重复的唾液锥虫体从广泛的哺乳动物, 允许诊断动物和人类锥虫病10。

为了获得活的、纯化的寄生虫, 被感染的血液被添加到阴离子交换器柱上。色谱条件 (主要是 pH 值, 液比物介质的离子强度) 必须适应每一种锥虫属, 更普遍的是, 适合哺乳动物血细胞和色样体 10的每一混合物。对于大多数非洲色胺体 10, 洗脱缓冲液精确地调整到 ph 值8。这种方法有利于患者血液中发现的寄生虫浓度, 因为寄生虫可能太低, 仅通过显微镜观察就无法检测到, 而且还能进行实验室调查。使用这种技术处理新鲜分离的锥虫体和受感染动物的血液, 比在实验室内无限期培养的针对在无动条件下培养的寄生虫的研究更相关。

寄主寄生虫的关系最好与感染其自然寄主的寄生虫研究, 因此, 肌肉 t ,一种天然的小鼠寄生虫, 它是细胞外锥虫体的代表, 有许多优点, 因为小鼠感染涉及在小型实验动物, 不需要生物危害安全水平 (BSL) 条件。与其他许多锥虫类, 包括人类病原体不同, 肌肉 t 不会杀死具有免疫能力的小鼠。在 t 细胞缺乏的小鼠中没有消除肌肉 t ,在受感染的小鼠中, 通过改变食物和营养摄入量11, 可以增加寄生虫。这种寄生虫调节免疫反应, 共同感染与其他病原体12。受感染小鼠的肌肉 t 与培养的肌肉组织有差异 ,例如, 与从受感染小鼠身上纯化的寄生虫相比, 肌肉组织的膜 fc 受体在抗酸菌培养中失去了表达,14. 在轴突状培养物中, 分泌物分泌的因子 (esf) 在质量和数量上也较少表达, 在流行地区分离的菌株之间存在差异15。ESF 是第一个向宿主免疫系统显示的抗原, 因此在最初的宿主免疫反应 16中发挥着重要作用。

在用于实验室调查的实验感染动物中, 该协议有助于对更多的寄生虫进行实验, 最大限度地减少所需的小鼠数量, 特别是在使用免疫抑制动物时。在大规模筛选的锥虫病卡凝集试验中使用的可变表面糖蛋白 (Vsg) 仍然从在大鼠体内繁殖的锥虫体中纯化。目前可在现场使用的两项快速诊断测试 (单独包装的盒式磁带) 仍在使用本地 vsg 的感染模型源, 而不是体外培养的锥虫 1,4, 5. 由于这些 deae 纤维素纯化的寄生虫可以很容易地从自然或实验感染的宿主, 特别是啮齿类动物那里大量获得, 因此促进了锥虫学和生物学研究的进展。

研究方案

根据《实验室动物护理和使用准则》 (NIH 第85±23号出版物, 1996年修订本) 进行的调查。协议得到了我们当地道德委员会的批准。

1. 动物

  1. 在每次实验前 15天, 将8至10周大的瑞士雌性老鼠, 20-25g 的雌性瑞士老鼠放在动物住房设施中。将它们放在通风的盒子里, 存放在受保护的温度 (22°c) 和湿度 (50%) 中控制室, 12小时关闭光循环。
  2. 让动物免费获得食物和水。尽量减少痛苦、苦难和苦难, 丰富环境。
  3. 对于住房, 使用明确的围墙笼子, 用木棍和纸板隧道丰富。轻轻地把动物拉到隧道里, 把它从笼子转移到手掌上。
  4. 进行日常监测, 以评估腐败、社会隔离、身体受伤、头发发毛或缺乏仪容整洁的迹象。
  5. 每周对每只动物称重一次。由兽医进行定期检查。
  6. 对于天然寄生虫, 在寄生虫血症高峰期采集血液, 对于导致动物死亡的寄生虫, 在假定死亡的前一天采集血液。
    注: 所有使用传染性病原体的实验都是根据大学批准的指南在专门的房间里进行的。

2. 缓冲器、媒体准备

  1. 称量每种物质, 并为以下缓冲液添加蒸馏水:
    1. 准备浓缩磷酸盐缓冲盐水 (2倍):
      Na2hpo4 (无水) (mw 141.96 g) 10.14 g
      Nah2 po4* 2H2O (mw 156.01 g) 0.62 g
      氯化钠 (MW 58.44 g) 2.55 g
      蒸馏 h2o至 1 l
    2. 制备磷酸盐缓冲盐水-葡萄糖:
      Na2hpo4 (无水) (mw 141.96 g) 5.39 g
      Nah2 po4* 2H2O (mw 156.01 g) 0.31 g
      氯化钠 (MW 58.44 g) 1.70 g
      葡萄糖 (MW 180 g) 10 g
      蒸馏 h2o至 1 l
    3. 准备 1 M KH2po 4。
    4. 准备洗脱缓冲液: 补充磷酸盐缓冲盐水葡萄糖
      青霉素 (100 uml)、链霉素 (100μgml) 和苯酚红 (5μgml)。

3. 去纤维素的制备

  1. 计划约5小时的 deae 纤维素制剂。
  2. 用蒸馏水将100克的 deae 纤维素洗净, 用狭窄的脖子在烧瓶中进行, 然后沉淀, 然后丢弃细颗粒。重复清洗, 直到上清液清除。
  3. 加入3升浓缩的2x 磷酸盐缓冲盐水搅拌。
  4. 使用 1m KH 2 po 4 将 pH 值调整为 8.0, 并丢弃上清液。
  5. 用蒸馏水洗两次, 然后离开。
  6. 清洗并允许用3升磷酸盐缓冲的盐水中沉淀两次, 并丢弃上清液。
  7. 测量纤维素的体积, 加入相同体积的磷酸盐缓冲盐水葡萄糖, 分存在塑料瓶中, 并储存在-20°c。

4. 寄生虫

  1. 在人类和动物锥虫病流行地区收集锥虫株菌株。将寄生虫冷冻在液氮中。
    注:肌肉锥虫对人类来说是非致病性的, 是一种细胞外的锥细胞, 用于在各种实验室实验中安全地取代致病性锥虫体。
  2. 在需要人类病原体的实验室调查中, 在专门适当的生物危害安全水平和预防措施下谨慎处理实验;BSL2 用于冈比亚 t. b., BSL3 适用于罗得西亚 t. b.在现场条件下, 建立了标准的微生物实践: 安全取样、机械移液、频繁去污表面和对废物进行灭菌。

5. 小鼠感染

  1. 在37°c 的水浴中快速解冻寄生虫。
  2. 用显微镜观察一滴解冻后的受感染血液。通过测量17种运动体的百分比来评估寄生虫的生存能力。
  3. 腹腔内向小鼠注射寄生虫 (每只小鼠0.5 毫升)。每天, 感染后, 通过针头穿刺收集20μl 的尾血, 并在显微镜下观察。根据赫伯特和 Lumsden18评估寄生虫血症, 方法是在几个显微镜下计数寄生虫, 或使用血细胞计。
  4. 当寄生虫血症达到为每个菌株定义的阈值时, 在含有肝素的洗脱缓冲液 (5 Mlm/m鼠) 中收集血液 (1 ml 鼠)。
    注: Lanham 和 Godfrey 的原始和新颖的工作报告了从 pH 8.0 的库存溶液中对几种寄主/寄生虫物种的磷酸盐缓冲盐水葡萄糖的最佳离子强度。

6. 寄生虫分离

注: 从这一点开始的所有实验必须在组织培养罩戴手套。所使用的实验室室温和湿度分别为22°C 和45%。在野外条件下, 寄生虫分离已成功地在34°c 下进行。

  1. 将10毫升注射器放置在垂直支架上, 并添加先前切割的圆形、片滤纸、玻璃棉或纤维素海绵。
  2. 将 DEAE 纤维素放入注射器中, 直到达到8毫升的水平, 然后用25毫升的洗脱缓冲液进行清洗。
  3. 小心地在色谱柱顶部加入2毫升稀释的血液, 然后加入洗脱介质。根据锥虫体的传递, 定期添加洗脱缓冲液。
  4. 收集离心管中柱中的废水, 并定期用显微镜检查是否存在寄生虫。
  5. 当在柱状出水中不再检测到寄生虫时, 将管中的寄生虫离心 (1, 800 x克,10分钟, 在4°c 的温度下在实验室和现场条件下的环境温度下)。
  6. 去除上清液, 并在下一个调查步骤所需的相关介质的1毫升中悬浮寄生虫。
  7. 用血细胞计计数寄生虫, 必要时在适当的培养基中稀释。

结果

纯化的色氨酸体已被用于药物测试。寄生虫被转移到含有特定药物连续稀释的培养井, 单独或混合19。微观观察, 评估运动是一个标志的活力, 可以执行时, 只有少数的哑弹正在进行测试, 而 AlamarBlue 细胞活力检测是一个很好的方法, 大的动力检测在药物筛选20。在 hat 治疗中使用的参考药物----戊胺素的作用如图 1所示?...

讨论

纯化的色氨酸酶是研究免疫学、生物化学、细胞和分子生物学的有力手段。从锥虫体中获得了大量的数据和结果, 这有助于从其他真核细胞30 中获得信息。锥虫体也是重要和有趣的研究的主题, 因为它们设计了许多机制, 使它们能够在两种截然不同的环境中生存和生长: 采采蝇飞行载体和哺乳动物宿主 23, 31. 据报告, 分离锥虫的各种技术,...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

我们感谢 UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD 波尔多大学的所有成员。这项研究得到了波尔多大学内部资助的支持, 来自 ANR、LABEX ParaFrap ANR-11-LAB-0024 以及寄生虫和热带医学发展协会的支持。班吉 (Centrafrique)

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Pipettes Falcon357,551
2 mL Pipettes Falcon352,507
Centrifugation tube 50 mLFalcon352,070
CentrifugeSigma Aldrich4K15
DEAE celluloseSanta Cruzs/c- 211213100 G
filter paper Whatman1,001,125
Flat bottom flask narrow neckDuran21 711 766000 mL
Glucose VWR101174Y500 G
HeparinSigma AldrichH3149-50KU5 000 U
KH2PO4VWR120 26936.260500 G
MicroscopeOlympusCH-20
Microscope coverslipsThermofisher scientificCB00100RA020MNT0
Microscope slidesThermofisher scientificAGAA000001
Na2HPO4 VWR100 28026;260500 G
NaClVWR27800.2911 KG
NaH2PO4 VWR110 33616;262500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mLThermofisher scientific342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mLThermofisher scientific342024-0500
Pasteur PipetteVWRBRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µgEUROBIOCABPES01 OU100 mL
Phenol redSigma AldrichP0290100 mL
Syringue DutscherSS+10S21381
Tissue culture hoodThermoelectro CorporationMSC-12
Trypanosoma brucei bruceiInstitute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambienseInstitute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).ITMAP 1893
Trypanosoma musculiLondon School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)Partinico II

参考文献

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