Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

Résumé

Cette méthode de séparation des trypanosomes dans le sang dépend de leur charge de surface étant moins négatif que les cellules de sang de mammifères. Sang contaminé est placé et traité sur une colonne d’échangeur d’anions. Cette méthode, plus raccord diagnostique pour la trypanosomiase africaine, fournit parasites purifiées à des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques et de la biologie moléculaire.

Résumé

Cette méthode permet la séparation des trypanosomes, parasites responsables de la trypanosomiase africaine humaine et animale (tha), du sang infecté. Il s’agit de la meilleure méthode pour le diagnostic de la première étape de chapeau et de plus cette méthode de purification du parasite permet sérologique et enquêtes de recherche.

CHAPEAU est causée par la mouche tsé-tsé transmis Trypanosoma brucei gambiense et T. b. rhodesiense. Trypanosomes connexes sont les agents responsables de la trypanosomiase animale. Détection de trypanosome est essentielle pour chapeau diagnostic, traitement et suivi. La technique décrite ici est la technique de détection plus sensible parasite, adaptée aux conditions de terrain pour le diagnostic de T. b. gambiense HAT et peut être complétée en une heure. Sang est posée sur une colonne d’échangeur d’anions (DEAE cellulose) préalablement ajustée à pH 8 et tampon d’élution est ajouté. Très négativement chargés de globules sont adsorbés sur la colonne alors que les trypanosomes moins négativement chargés de passer à travers. Trypanosomes recueillies sont granulées par centrifugation et observés au microscope. En outre, parasites sont préparés sans dommages cellulaires tout en conservant leur infectiosité.

Trypanosomes purifiés sont nécessaires pour les tests immunologiques. Ils sont utilisés dans l’analyse de la demande, l’étalon-or en sérologie HAT. Parasites colorés sont utilisés dans le test d’agglutination de carte (CATT) sérologie de champ. Antigènes de trypanosomes purifiés, comme la glycoprotéine de surface variant, antigènes exogènes, sont également utilisés dans les Immunoessais divers. La procédure décrite ici est conçue pour les trypanosomes africains ; par conséquent, conditions chromatographiques doivent être adaptés à chaque souche trypanosome et plus généralement, dans le sang de chaque espèce de mammifère hôte.

Ces fascinants pathogènes sont facilement purifié et disponible pour une utilisation en biochimique, moléculaire et cellulaire des études de biologie y compris co-culture avec des cellules de l’hôte pour étudier les relations hôte-parasite au niveau des récepteurs membranaires, signalisation et gène expression ; drogue test in vitro; enquête de surexpression sur les processus métaboliques, la biogenèse du cytosquelette et de survie du parasite, mutation ou délétion du gène.

Introduction

La méthode présentée décrite ici permet la séparation des trypanosomes, parasites responsables de la trypanosomiase africaine humaine et animale (tha), du sang. Il s’agit de la meilleure méthode pour le diagnostic de la première étape de chapeau et de plus cette méthode de purification du parasite permet robuste enquête sérologique et de la recherche.

CHAPEAU est causée par la mouche tsé-tsé transmis Trypanosoma brucei gambiense et T. b. rhodesiense¹. Ces parasites protozoaires se multiplient extracellulaire dans la circulation sanguine, lymphatique et fluides interstitiels durant la première phase de la maladie (stade réalisée). La deuxième étape (étape méningo-encéphalitique) commence lorsque les parasites traversent la barrière hémato encéphalique ; des signes neurologiques, y compris un trouble du sommeil, qui a donné son nom « maladie du sommeil » à cette maladie, sont typiques de cette deuxième étape². Les trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) sont les agents causals de l’animal de la trypanosomose africaine (AAT)³.

L’organisation mondiale de la santé (OMS) a pour but d’éliminer le chapeau comme un problème de santé publique d’ici à 2020 et d’arrêter la transmission en 2030⁴. L’introduction récente de tests de diagnostic rapide a améliorer le diagnostic sérologique^1,4,5. Plusieurs tests diagnostiques moléculaires ont été développés, mais leur rôle dans le diagnostic de terrain n’a pas encore été établi⁵. Ils sont utilisés pour identifier les sous-espèces du groupe brucei et atypique trypanosomose causée par des parasites responsables de trypanosomose animale⁶.

La détection du parasite est essentielle pour le diagnostic, le traitement et le suivi, comme sérologie peut donner des résultats faussement positifs et de faux malheureusement négatifs¹. L’observation microscopique directe de ces protistes hemoflagellate est difficile dans les cas de chapeau qui sont causées par T. b. gambiense, (plus de 95 % des cas) comme faibles parasitémies sont la règle, tandis que pour le bonnet causée par T. b. rhodesiense, un grand nombre de parasites est fréquemment présent dans le sang. Différentes techniques de concentration ont été utilisées, telles que la goutte épaisse et centrifugation de tube capillaire (CTC), mais la séparation des parasites du sang par une colonne d’échangeur d’anions (DEAE cellulose) suivie par centrifugation et observation microscopique de la Pellet, est la méthode la plus sensible (environ 50 parasites/mL de sang peut être détectée)^1,7. Par conséquent, la purification des trypanosomes par cette méthode de l’échangeur d’anions (DEAE cellulose) est le meilleur et, à ce jour, la méthode de référence pour les visualiser et isoler les parasites du sang pour le diagnostic de la HAT. Sur le terrain, une mini colonne de DEAE cellulose a été utilisée avec succès et plusieurs améliorations ont facilité l’observation microscopique^7,8.

La méthode de séparation de trypanosomes dans le sang, décrit ci-dessous, dépend de la charge de surface parasite, qui est moins négatif que les cellules de sang de mammifères⁹. Fait intéressant, cette méthode a été développée en 1968 par le Dr Sheila Lanham il y a 50 ans et demeure l’étalon-or pour la détection et préparation des trypanosomes de circulation sanguine. C’est rapide et reproductible de trypanosomes salivarian parmi un large éventail de mammifères, permettant le diagnostic de tant de trypanosomiase humaine et animale¹⁰.

Pour obtenir des parasites vivants, purifiées, sang infecté est ajouté sur une colonne d’échangeur d’anions. Conditions chromatographiques (pH, force ionique de tampons/médias, principalement) doivent être adaptés à chaque espèce de trypanosomes et, plus généralement, à chaque mélange de cellules de sang de mammifères et trypanosomes¹⁰. Tampon d’élution est précisément ajusté à pH 8 pour plus de pays africains trypanosomes¹⁰. Cette méthode favorise la concentration des parasites dans le sang des patients, car parasitémies peut être trop faible pour être détectée par l’observation microscopique, et cela permet également aux examens de laboratoire. Travailler avec les trypanosomes fraîchement isolées et sur le sang des animaux infectés, en utilisant cette technique, est plus pertinent pour les diverses enquêtes que les études avec les parasites qui ont été cultivées dans des conditions axéniques en laboratoire pour une durée indéterminée.

Relations hôte-parasite sont mieux étudiées avec un parasite qui infecte son hôte naturel, par conséquent, T. musculi, un parasite murin naturel, qui est représentatif des trypanosomes extracellulaires, présente de nombreux avantages comme infection murine consiste en un animal de laboratoire petit et ne nécessite pas de conditions de niveau (BSL) de sécurité biologique. T. musculi ne tue pas les souris immunocompétentes, contrairement à beaucoup d’autres espèces de Trypanosoma , y compris les agents pathogènes humains. T. musculi ne sont pas éliminées chez les souris privés de lymphocytes T et parasitémies peut être augmentée chez les souris infectées par modification de l’apport alimentaire et nutriments¹¹. Ce parasite module la réponse immunitaire chez des co-infections avec d’autres agents pathogènes¹². T. musculi de souris infectées pièce différences de culture T. musculi, par exemple, l’expression des récepteurs Fc membrane se perd dans les cultures axéniques T. musculi , par rapport aux parasites purifiées à partir de souris infectées^{13 , 14}. Excreted-sécrétée facteurs (FSE) sont également qualitativement et quantitativement moins exprimées dans les cultures axéniques trypanosome et diffèrent entre les souches isolées dans les zones d’endémie¹⁵. FSE sont les antigènes premières affiche pour le système immunitaire et donc jouer un rôle important dans l’hôte initial réponse immunitaire¹⁶.

Chez les animaux infectés expérimentalement pour les examens de laboratoire, ce protocole facilite l’expérimentation sur un plus grand nombre de parasites, réduisant au minimum le nombre de souris nécessaire surtout lors de l’utilisation des animaux immunodéprimés. Les glycoprotéines de surface variant (GSV) qui sont utilisés dans le Test d’Agglutination de carte pour la trypanosomiase (CATT) dans le dépistage de masse sont toujours purifiés de trypanosomes reproduits chez les rats. Les deux tests de diagnostic rapide (cassettes emballées individuellement) qui sont maintenant disponibles pour une utilisation sur le terrain, toujours utilisez une source de modèle infectieux de native VSGs et pas in vitro culture trypanosomes^{1,4, 5}. les progrès dans l’étude du trypanosome immunologie et en biologie a été facilitée puisque ces DEAE cellulose purifiée parasites peuvent être facilement obtenus en grandes quantités d’hôtes naturellement ou expérimentalement infectés, en particuliers, rongeurs.

Protocole

Enquêtes étaient conformes aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publication n° 85±23, révisée en 1996). Des protocoles ont été approuvées par notre comité d’éthique local.

1. les animaux

1. Garder des souris femelles de Suisse (de-1), âgés de huit à dix semaines, 20-25 g, chez un animal logement facilité quinze jours avant chaque expérience. Les loger dans des boîtes aérées qui sont conservés dans un protégé, température (22 ° C) et humidité (50 %) contrôlé la salle, avec 12 heures de marche/arrêt cycle de lumière.
2. Donner animaux libre accès à la nourriture et l’eau. Minimiser la douleur, de souffrance et de détresse et de fournir l’enrichissement de l’environnement.
3. Pour le logement, utiliser les cages à parois clear, enrichissement avec des bâtons en bois et les tunnels en carton. Tirer doucement un animal dans un tunnel pour transférer de la cage dans la paume de la main.
4. Effectuer une surveillance quotidienne pour évaluer les signes de prostration, isolement social, blessure du corps, des cheveux ébouriffé ou manque de toilettage.
5. Peser chaque animal une fois par semaine. Inspectez régulièrement par un vétérinaire.
6. Pour les parasites naturels, recueillir le sang à l’apogée de la parasitémie et des parasites causant la mort animale, recueillir le sang la veille de la mort présumée.
   Remarque : Toutes les expériences avec les agents infectieux sont effectuées dans des salles dédiées, conformément aux lignes directrices de l’université a approuvé.

2. tampons, les préparatifs des médias

1. Peser chaque substance et ajouter de l’eau distillée pour les tampons suivants :
   1. Préparer une solution Saline tamponnée au Phosphate concentrée (x 2) :
      Na₂HPO₄ (anhydre) (MW g 141,96) 10,14 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW g 156,01) 0,62 g
      NaCl (MW g 58,44) 2,55 g
      Eau distillée H₂O à 1 L
   2. Préparer le tampon Phosphate salin-Glucose :
      Na₂HPO₄ (anhydre) (MW g 141,96) 5,39 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW g 156,01) 0,31 g
      NaCl (MW g 58,44) 1,70 g
      Glucose (MW 180 g) 10 g
      Eau distillée H₂O à 1 L
   3. Préparer 1 M KH₂PO₄.
   4. Préparer le tampon d’élution : Supplément de tampon Phosphate salin-Glucose avec
      La pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) et le rouge de phénol (5 µg/mL).

3. préparation de DEAE-cellulose

1. Plan d’environ 5 heures pour la préparation de DEAE-cellulose.
2. Lavez 100 g de DEAE-cellulose avec de l’eau distillée dans une fiole avec un col étroit et laisser s’installer, puis jeter les particules fines. Répétez les lavages jusqu'à ce que le liquide surnageant est clair.
3. Ajouter 3 L de concentré 2 x Phosphate-Buffered Saline et remuer.
4. Ajuster le pH à 8,0 avec 1 M KH₂PO₄ et jeter le surnageant.
5. Laver deux fois avec l’eau distillée et laisser pour reposer.
6. Laver et laisser reposer deux fois avec 3 litres Phosphate-Buffered Saline-Glucose et jeter le surnageant.
7. Mesurer le volume de la cellulose et ajouter un volume égal de solution Saline-Glucose Phosphate-Buffered, répartir dans des bouteilles en plastique et conserver à-20 ° C.

4. les parasites

1. Recueillir des souches de trypanosomes dans les zones endémiques pour la trypanosomiase humaine et animale. Garder les parasites congelés dans l’azote liquide.
   NOTE : Trypanosoma musculi est non pathogènes pour l’être humain et un trypanosome extracellulaire permet de remplacer en toute sécurité des trypanosomes pathogènes dans diverses expériences de laboratoire.
2. Dans le cas des examens de laboratoire nécessitant des pathogènes humains, gérer des expériences avec soin dans des conditions de niveau (BSL) de sécurité dédié biohazard approprié et précautions ; BSL2 pour T. b. gambiense et BSL3 pour T. b. rhodesiense. Dans des conditions opérationnelles, les pratiques microbiologiques standard sont établie : sécuriser l’échantillonnage, pipetage mécaniques, fréquente décontamination des surfaces et la stérilisation des déchets.

5. infection des souris

1. Décongeler rapidement les parasites dans un bain-marie à 37 ° C.
2. Observer une goutte de sang infecté dégelé avec un microscope. Évaluer la viabilité de parasite en mesurant le pourcentage de formes mobiles¹⁷.
3. Injecter des parasites par voie intrapéritonéale à des souris (0,5 mL / souris). Chaque jour, après l’infection, recueillir 20 µL de sang de queue par piqûre d’aiguille et observer au microscope. Évaluer la parasitémie selon Herbert et Lumsden¹⁸ en comptant les parasites dans plusieurs champs microscopiques, ou en utilisant un hémocytomètre.
4. Lorsque la parasitémie atteint un seuil défini pour chaque souche, recueillir le sang (1 mL/souris) dans la mémoire tampon d’élution (5 mL/souris) contenant de l’héparine (10 U/mL).
   NOTE : Le œuvre originale et novatrice de Lanham et Godfrey faisait que la force ionique optimale du phosphate buffered glucose salin pour plusieurs espèces d’hôte/parasite d’une solution mère de pH 8.0.

6. séparation de parasite

NOTE : Toutes les expériences à partir de là doivent se faire sous une hotte de vitroplants avec des gants. La température ambiante et l’humidité dans les laboratoires utilisés étaient de 22 ° C et 45 % respectivement. Sur le terrain, séparation du parasite a été exécutée avec succès à 34 ° C.

1. Introduire une seringue de 10 mL dans un support vertical et ajouter une circulaire découpée, morceau de papier filtre, laine de verre ou éponge en cellulose.
2. Versez la DEAE cellulose dans la seringue jusqu'à ce que le niveau de 8 mL est atteint et laver ensuite avec 25 mL de tampon d’élution.
3. Ajouter 2 mL de sang dilué avec précaution en haut de la colonne, puis ajoutez moyen d’élution. Ajoutons régulièrement la mémoire tampon d’élution selon le transit des trypanosomes.
4. Collecter les effluents gouttes les colonnes dans un tube à centrifuger et vérifier régulièrement la présence de parasites au microscope.
5. Lorsque les parasites sont ne sont plus détectés dans l’effluent de la colonne, centrifuger le tube (1 800 x g, 10 minutes, à 4 ° C en laboratoire et à la température ambiante sur le terrain).
6. Retirez le surnageant et suspendre les parasites dans 1 mL de milieu pertinent requis pour la prochaine étape d’enquête.
7. Compter les parasites avec un hémocytomètre et diluez-les dans un milieu approprié si nécessaire.

Résultats

Trypanosomes purifiés ont été utilisés dans des essais pharmaceutiques. Les parasites sont transférés dans des puits de culture contenant les dilutions en série de médicaments spécifiques, soit seules ou mélangées,¹⁹. Observations microscopiques, évaluation de la motilité est un marqueur de viabilité, peut être réalisée lorsque seulement quelques mamelons sont mis à l’essai, tandis que AlamarBlue analyse de viabilité de cellules est une excelle...

Discussion

Trypanosomes purifiés représentent un moyen puissant pour étudier, immunologie, biochimie, biologie cellulaire et moléculaire. Grandes étendues de données et les résultats ont été obtenus de trypanosomes, qui a ensuite aidé à obtenir des informations auprès des autres cellules eucaryotes³⁰. Trypanosomes font également l’objet de recherches importantes et intéressantes, parce qu’ils ont conçu de nombreux mécanismes qui leur permettent de survivre et se développer dans deux mili...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Pipettes	Falcon	357,551
2 mL Pipettes	Falcon	352,507
Centrifugation tube 50 mL	Falcon	352,070
Centrifuge	Sigma Aldrich	4K15
DEAE cellulose	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
filter paper	Whatman	1,001,125
Flat bottom flask narrow neck	Duran	21 711 76	6000 mL
Glucose	VWR	101174Y	500 G
Heparin	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
Microscope	Olympus	CH-20
Microscope coverslips	Thermofisher scientific	CB00100RA020MNT0
Microscope slides	Thermofisher scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
NaCl	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL	Thermofisher scientific	342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL	Thermofisher scientific	342024-0500
Pasteur Pipette	VWR	BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
Phenol red	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
Syringue	Dutscher	SS+10S21381
Tissue culture hood	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)		Partinico II