Purificación de tripanosomas extracelulares, incluyendo a africano, de la sangre por intercambiadores de aniones (celulosa Diethylaminoethyl columnas)

Resumen

Este método de separación de tripanosoma de sangre depende de su carga superficial ser menos negativa que mamífero las células de la sangre. Sangre infectada es colocada y tratada en una columna de intercambiador de aniones. Este método, más apropiado diagnóstico de la tripanosomiasis africana, proporciona parásitos purificados para las investigaciones inmunológicas, biológicas, bioquímicas, farmacéutica y biología molecular.

Resumen

Este método permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (sombrero) de sangre infectada. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite serológica e investigación las investigaciones.

SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense. Relacionados con tripanosomas son los agentes causativos de tripanosomiasis animal. Detección de tripanosoma es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento de sombrero. La técnica descrita aquí es la técnica de detección de parásito más sensible, adaptada a condiciones de campo para el diagnóstico de T. b. gambiense sombrero y puede ser completada dentro de una hora. Es capas de sangre sobre una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) previamente ajustada a pH 8, y se añade tampón de elución. Cargadas altamente negativa de las células sanguíneas son adsorbidas en la columna mientras que los tripanosomas menos negativamente cargadas pasan a través. Tripanosomas recogidos son peleteados por centrifugación y observados por microscopia. Por otra parte, parásitos están preparados sin daño celular manteniendo su infectividad.

Tripanosomas purificadas se requiere para las pruebas inmunológicas; se utilizan en el análisis de trypanolysis, el estándar de oro para serología de sombrero. Tinción de parásitos se utilizan en la prueba de aglutinación de la tarjeta (CATT) para serología de campo. Antígenos de tripanosomas purificados, como la glicoproteína variante de superficie, exoantígenos, también se utilizan en diferentes inmunoensayos. El procedimiento descrito aquí está diseñado para tripanosomas africanos; en consecuencia, tienen condiciones de cromatografía para adaptarse a cada cepa de Tripanosoma y más generalmente, a la sangre de cada especie de mamífero anfitrión.

Estos fascinantes patógenos son fácilmente purificada y disponible para usar en Bioquímica, molecular y estudios de la biología incluyendo co-cultivo con células hospedadoras para investigar las relaciones huésped-parásito en el nivel de receptores de membrana, la señalización y el gen de la célula expresión; la droga de prueba in vitro; investigación de canceladura del gene, mutación o sobreexpresión de procesos metabólicos, biogénesis del citoesqueleto y supervivencia del parásito.

Introducción

El método se describe aquí permite la separación de tripanosomas, parásitos responsables de tripanosomiasis africana humana y animal (HAT), de la sangre. Este es el mejor método para el diagnóstico de la primera etapa sombrero y además este método de purificación del parásito permite sólida investigación serológica y la investigación.

SOMBRERO es causado por la mosca tsetsé transmitidos Trypanosoma brucei gambiense y T. b. rhodesiense¹. Estos parásitos protozoarios se multiplican extracelularmente en el torrente sanguíneo, linfa y líquidos intersticiales durante la primera etapa de la enfermedad (etapa hemolinfáticos). La segunda etapa (etapa meningoencephalitic) comienza cuando parásitos cruzan la barrera hematoencefálica; signos neurológicos, incluyendo un trastorno del sueño, que ha dado su nombre "enfermedad del sueño" a esta enfermedad, son típicas de esta segunda etapa². Relacionados con tripanosomas (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) son los agentes causativos de animal Tripanosomosis Africana (AAT)³.

La Organización Mundial de la salud (OMS) tiene como objetivo eliminar el sombrero como un problema de salud pública de aquí a 2020 y detener la transmisión por 2030⁴. La reciente introducción de pruebas de diagnóstico rápido tiene mejor diagnóstico serológico^1,4,5. Se han desarrollado varias pruebas diagnóstico moleculares, pero su papel en el diagnóstico de campo aún no ha sido establecido⁵. Se utilizan para identificar las sub-especies del grupo brucei y tripanosomiasis anormal causada por parásitos responsables de la Tripanosomosis animal⁶.

La detección del parásito es esencial para el diagnóstico, tratamiento y seguimiento, como la serología puede dar resultados falsos positivos y por desgracia falsos negativos¹. La observación microscópica directa de estos protistas hemoflagelados es difícil en los casos de sombrero que son causados por T. b. gambiense, (más de 95% de los casos) como bajas parasitemias son la regla, considerando que para sombrero causada por T. b. rhodesiense, una gran número de parásitos está con frecuencia presente en la sangre. Se han utilizado varias técnicas de concentración, como la gota gruesa y centrifugación del tubo capilar (CTC), pero la separación de los parásitos de la sangre por una columna de Intercambiador aniónico (DEAE celulosa) seguido por centrifugación y observación microscópica de la pellet, es el método más sensible (alrededor de 50 parásitos/mL de sangre puede detectarse)^1,7. En consecuencia, la purificación de tripanosomas por este método de intercambiadores de aniones (DEAE celulosa) es el mejor y hasta la fecha, el método de referencia para visualizar y aislar parásitos de la sangre para el diagnóstico de sombrero. En condiciones de campo, una pequeña columna de DEAE celulosa se ha utilizado con éxito y varias mejoras han facilitado la observación microscópica^7,8.

El método de separación de tripanosoma de sangre, que se describe a continuación, depende de la carga superficial del parásito, que es menos negativo que el mamífero células de sangre⁹. Curiosamente, este método fue desarrollado hace 50 años, en 1968 por el Dr. Sheila Lanham y sigue siendo el estándar de oro para la detección y preparación de tripanosomas de la sangre. Es rápido y reproducible para tripanosomas salivarian de una amplia gama de mamíferos, permitiendo el diagnóstico de ambos de tripanosomiasis animal y humana¹⁰.

Para obtener vida, purificados de parásitos, sangre infectada se agrega en una columna de intercambiador de aniones. Condiciones de cromatografía (principalmente pH, fuerza iónica de tampones y medios) tienen que adaptarse a cada especie de Tripanosoma y más generalmente, para cada mezcla de mamíferas células de sangre y tripanosomas¹⁰. Tampón de elución es precisamente ajustado a pH 8 por tripanosomas africanos más¹⁰. Este método favorece la concentración de parásitos que se encuentran en la sangre de los pacientes, porque parasitemias pueden ser demasiado bajos para ser detectados por observación microscópica solamente, y también permite que las investigaciones del laboratorio. Trabajar con tripanosomas recién aislados y en la sangre de animales infectados, usando esta técnica, es más pertinente para las diversas investigaciones que estudios con parásitos que han sido cultivadas en condiciones axénicos en el laboratorio durante un período indefinido.

Las relaciones huésped-parásito se estudian mejor con un parásito que infecta a su huésped natural, por lo tanto, T. musculi, un parásito murino natural, que es representante de tripanosomas extracelulares, tiene muchas ventajas como infección murine consiste en un animal de laboratorio pequeño y no requiere condiciones de nivel (BSL) de seguridad de sustancias biopeligrosas. T. musculi no mata a los ratones inmunocompetentes, a diferencia de muchas otras especies de Trypanosoma , incluyendo patógenos humanos. T. musculi no se eliminan en los ratones desprovistos de la célula de T y parasitemias puede ser aumentada en los ratones infectados mediante la modificación de la ingesta de alimentos y nutrientes¹¹. Este parásito modula la respuesta inmune en coinfección con otros patógenos¹². T. musculi de ratones infectados exhiben diferencias de cultivo T. musculi, por ejemplo, la expresión de receptores de Fc de la membrana se pierde en cultivos axénicos T. musculi , comparados con parásitos purificados de ratones infectados^{13 , 14}. factores Excreted secretada (FSE) son también cualitativamente y cuantitativamente menos expresada en cultivos axénicos Tripanosoma y difieren entre las cepas aisladas en áreas endémicas¹⁵. FSE son los antígenos primera muestra al sistema inmune anfitrión y así juegan un papel importante en la acogida inicial de la respuesta inmune¹⁶.

En animales infectados experimentalmente para las investigaciones del laboratorio, este protocolo facilita la experimentación con un mayor número de parásitos, reduciendo al mínimo el número de ratones requerida especialmente cuando se utilizan animales inmunosuprimidos. Las glicoproteínas de superficie variables (VSGs) que se utilizan en la prueba de aglutinación de tarjeta para tripanosomiasis (CATT) en la detección de masas todavía son purificadas de tripanosomas que se propagan en ratas. Las dos pruebas de diagnóstico rápido (cassettes individualmente) que ahora están disponibles para su uso en el campo, siguen utilizando una fuente infecciosa modelo nativa VSGs y no en vitro cultivados tripanosomas^{1,4, 5}. el avance en el estudio de tripanosoma Inmunología y la biología se ha facilitado ya que estos parásitos DEAE celulosa purificada pueden obtenerse fácilmente en grandes cantidades de hosts infectados natural o experimentalmente y en particulares, roedores.

Protocolo

Las investigaciones conforman a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publication no. 85±23, revisado 1996). Protocolos fueron aprobados por el Comité de ética local.

1. los animales

1. Mantener los ratones femeninos de Suiza (de-1) de edad de ocho a diez semanas, 20-25 g, en un animal vivienda instalaciones quince días antes de cada experimento. Casa en cajas ventiladas que se mantienen en una protegida, temperatura (22 ° C) y humedad (50%) control de habitación, con 12 horas ciclo de luz de encendido/apagado.
2. Dar animales libre acceso a alimentos y agua. Minimizar el dolor, el sufrimiento y el malestar y proporcionar enriquecimiento del medio ambiente.
3. Para la cubierta, use jaulas paredes claro, enriquecimiento con palillos de madera y cartón túneles. Suavemente dibuja un animal en un túnel para transferir de la jaula a la palma de la mano.
4. Realizar seguimiento diario para evaluar signos de postración, aislamiento social, lesión del cuerpo, cabello rizado o falta de aseo personal.
5. Pesar cada animal una vez por semana. Realizar inspecciones regulares por un veterinario.
6. Para los parásitos naturales, recoja la sangre en el pico de parasitemia y de parásitos, causando la muerte de animales, recolección de sangre el día antes de la muerte presunta.
   Nota: Todos los experimentos con agentes infecciosos se realizan en salas dedicadas, según las directrices de la Universidad aprobada.

2. tampones, preparación de medios de comunicación

1. Pesar cada sustancia y añadir agua destilada para los siguientes topes:
   1. Preparación concentrada solución salina tamponada con fosfato (2 x):
      Na₂HPO₄ (anhidro) (MW 141,96 g) 10,14 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,62 g
      NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g
      Agua destilada H₂O a 1 L
   2. Preparar el tampón fosfato salino-glucosa:
      Na₂HPO₄ (anhidro) (MW 141,96 g) g 5,39
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,31 g
      NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g
      Glucosa (MW 180 g) 10 g
      Agua destilada H₂O a 1 L
   3. Preparar 1 M KH₂PO₄.
   4. Preparar el tampón de elución: Suplemento con tampón fosfato salino-glucosa con
      Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y rojo de fenol (5 μg/mL).

3. preparación de la DEAE-celulosa

1. Plan de unas 5 horas para la preparación de DEAE-celulosa.
2. Lavar 100 g de DEAE-celulosa con agua destilada en un matraz con un cuello estrecho y dejar asentarse y partículas finas. Repita los lavados hasta que el sobrenadante esté claro.
3. Añada 3 L de concentrado 2 x Phosphate-Buffered salina y mezclar.
4. Ajustar el pH a 8.0 con 1 M de KH₂PO₄ y descartar el sobrenadante.
5. Lavar dos veces con agua destilada y dejar de instalarse.
6. Lave y deje que doble con 3 litros Phosphate-Buffered solución salina y glucosa y descartar el sobrenadante.
7. Medir el volumen de la celulosa y añadir un volumen igual de solución salina de Phosphate-Buffered-glucosa, distribuir en botellas de plástico y almacenar a-20 ° C.

4. parásitos

1. Recoger las cepas de Trypanosoma en áreas endémicas para la tripanosomiasis humana y animal. Mantener parásitos congelados en nitrógeno líquido.
   Nota: Trypanosoma musculi no patógeno a los seres humanos y es un Tripanosoma extracelular utilizado para reemplazar con seguridad tripanosomas patógenos en varios experimentos de laboratorio.
2. En el caso de las investigaciones del laboratorio que requieren los patógenos humanos, manejar experimentos con cuidado en las condiciones de riesgo biológico apropiado dedicado seguridad nivel (BSL) y precauciones; BSL2 para T. b. gambiense y BSL3 de T. b. rhodesiense. En condiciones de campo, prácticas microbiológicas estándar se establecieron: garantizar muestreo, pipeteado mecánico, frecuentes descontaminación de superficies y esterilización de los residuos.

5. infección de ratón

1. Descongelar rápidamente parásitos en un baño de agua a 37 ° C.
2. Observar una gota de sangre infectada descongelada con un microscopio. Midiendo el porcentaje de formas móviles¹⁷evaluar la viabilidad del parásito.
3. Inyectar parásitos por vía intraperitoneal en ratones (0,5 mL por ratón). Cada día post-infección, recoger 20 μl de sangre de la cola por punción de la aguja y observar bajo un microscopio. Evaluar parasitemia según Herbert y Lumsden¹⁸ conteo de parásitos en varios campos de microscopio, o usando un hemocitómetro.
4. Cuando la parasitemia alcanza un umbral que se define para cada cepa, recoger la sangre (1 mL/ratón) en el tampón de elución (5 mL/ratón) que contiene heparina (10 U/mL).
   Nota: El trabajo original y novedoso de Lanham y Godfrey divulgado que la fuerza óptima iónica de fosfato tampón salina glucosa para varias especies de huésped/parásito de una solución madre a pH 8.0.

6. separación parásito

Nota: Todos los experimentos de aquí en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejidos con guantes. La temperatura y la humedad en los laboratorios utilizados fueron de 22 ° C y 45% respectivamente. En condiciones de campo, separación del parásito se ha realizado con éxito en 34 ° C.

1. Colocar una jeringa de 10 mL en un soporte vertical y añadir una circular previamente cortada, pedazo de papel de filtro, lana de vidrio o esponja de celulosa.
2. Vierta el DEAE celulosa en la jeringa hasta que el nivel de 8 mL es alcanzado y luego lavar con 25 mL de tampón de elución.
3. Cuidadosamente añadir 2 mL de sangre diluida en la parte superior de la columna y añadir medio de elución. Regularmente añadir tampón de elución según el tránsito de los tripanosomas.
4. Recoge gotas de efluentes de las columnas en un tubo de centrífuga y comprobar regularmente la presencia de parásitos con un microscopio.
5. Cuando ya no se detectan parásitos en el efluente de la columna, centrifugar el tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C en el laboratorio y en la temperatura ambiente en condiciones de campo).
6. Quite el sobrenadante y suspender los parásitos en 1 mL del medio relevante necesario para el siguiente paso de la investigación.
7. Contar los parásitos con un hemocitómetro y les diluya en medio apropiado si es necesario.

Resultados

Purificada tripanosomas se han utilizado en pruebas farmacéuticas. Parásitos se transfieren en pocillos de cultivo que contiene diluciones seriadas de fármacos específicos, ya sea solo o mezclado¹⁹. Observaciones microscópicas, evaluar la motilidad es un marcador de viabilidad, puede realizarse con sólo unas pocas drogas están siendo analizadas, mientras que AlamarBlue análisis de viabilidad de la célula es un excelente método para ensayos de gran motilid...

Discusión

Tripanosomas purificadas representan un medio poderoso para estudiar Inmunología, bioquímica, biología celular y molecular. Grandes extensiones de datos y resultados se han obtenido de tripanosomas, que luego ha ayudado a obtener información de otras células eucariotas³⁰. Tripanosomas son también el tema de investigación importante e interesante porque han ideado numerosos mecanismos que les permiten sobrevivir y crecer en dos ambientes muy diferentes: el vector de la mosca tsetsé y el del...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Pipettes	Falcon	357,551
2 mL Pipettes	Falcon	352,507
Centrifugation tube 50 mL	Falcon	352,070
Centrifuge	Sigma Aldrich	4K15
DEAE cellulose	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
filter paper	Whatman	1,001,125
Flat bottom flask narrow neck	Duran	21 711 76	6000 mL
Glucose	VWR	101174Y	500 G
Heparin	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
Microscope	Olympus	CH-20
Microscope coverslips	Thermofisher scientific	CB00100RA020MNT0
Microscope slides	Thermofisher scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
NaCl	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL	Thermofisher scientific	342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL	Thermofisher scientific	342024-0500
Pasteur Pipette	VWR	BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
Phenol red	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
Syringue	Dutscher	SS+10S21381
Tissue culture hood	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)		Partinico II