Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

Zusammenfassung

Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.

Zusammenfassung

Diese Methode ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), von infiziertem Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem dieser Parasit Reinigungsverfahren ermöglicht serologische und Forschung Untersuchungen.

Hut wird durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense verursacht und T. B. Rhodesiense. Damit verbundenen Trypanosomen sind die Erreger der Tier Trypanosomiasis. Trypanosomen-Erkennung ist essentiell für Hut-Diagnose, Behandlung und Nachsorge. Die hier beschriebene Technik ist die empfindlichste Parasit Erkennung Technik, angepasst auf Freilandbedingungen für die Diagnose von T. B. rhodesiense Hut und kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Blut wird auf ein Anion-Exchanger Säule (DEAE Zellulose) vorher eingestellten pH-Wert 8 geschichtet und Elution Puffer hinzugefügt. Stark negativ geladenen Blutzellen werden auf die Säule adsorbiert, während die weniger negativ geladenen Trypanosomen durchlaufen. Gesammelten Trypanosomen sind pelleted durch Zentrifugation und beobachtet von Mikroskopie. Darüber hinaus sind Parasiten ohne Zellschädigung bereit, unter Beibehaltung ihrer Infektiosität.

Gereinigte Trypanosomen sind erforderlich für immunologische Tests; Sie sind in der Trypanolysis-Assay, der Goldstandard in der Hut Serologie eingesetzt. Gefärbte Parasiten sind in der Karte Agglutination Test (CATT) für Feld Serologie genutzt. Antigene von gereinigten Trypanosomen wie Variante Oberfläche Glykoprotein, Exoantigens, sind auch in verschiedenen Immunassays verwendet. Die hier beschriebene Vorgehensweise richtet sich an afrikanischen Trypanosomen; Infolgedessen haben Chromatographie Bedingungen zu jeder Trypanosomen-Stamm, und ganz allgemein an das Blut der einzelnen Arten der Host Säugetier angepasst werden.

Diese faszinierenden Krankheitserreger sind leicht gereinigt und zur Verfügung in biochemische, molekulare und Zelle Biologie Studien einschließlich Kokultur mit Wirtszellen zu untersuchen, Wirt-Parasit-Beziehungen auf der Ebene der Membranrezeptoren, Signal- und gen Ausdruck; Drogen Sie-Tests in Vitro; Untersuchung von gen-Löschung, Mutation oder Überexpression auf metabolische Prozesse, Zellskelett Biogenese und Parasiten überleben.

Einleitung

Die vorgestellte Methode beschrieben hier ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), aus Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem ermöglicht dieser Parasit Reinigungsverfahren robuste serologische und Forschung Untersuchung.

Hut, verursacht durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense und T. B. Rhodesiense¹. Diese Protozoen Parasiten vermehren extrazellulär in Blut, Lymphe und interstitiellen Flüssigkeiten in der ersten Phase der Erkrankung (hemolymphatic Stadium). Die zweite Stufe (meningoencephalitic Stadium) beginnt, wenn die Parasiten die Blut-Hirn-Schranke überqueren; neurologische Symptome, einschließlich einer Schlafstörung, die seinen Namen "Schlafkrankheit" dieser Krankheit gegeben hat, sind typisch für diese zweite Stufe². Damit verbundenen Trypanosomen (T. Evansi, T. Congolense, T. Vivax, T. B. Trypanosomen) sind die Erreger der afrikanischen Trypanosomosen (AAT)³Tier.

Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zielt darauf ab, Hut als Problem der öffentlichen Gesundheit bis zum Jahr 2020 zu beseitigen und Übertragung von 2030⁴zu stoppen. Die kürzlich erfolgten Einführung der raschen Diagnosetests hat verbesserte serologische Diagnostik^1,4,5. Wurden mehrere molekulare Diagnostik entwickelt, aber ihre Rolle im Bereich Diagnostik wurde noch nicht etablierten⁵. Sie werden verwendet, um die Unterarten der Trypanosomen -Gruppe und atypische Trypanosomiasis verursacht durch Parasiten verantwortlich für tierische Trypanosomosen⁶zu identifizieren.

Die Erkennung des Parasiten ist wichtig für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge, da Serologie falsch positive und leider falsch-negative Ergebnisse¹geben kann. Die direkte mikroskopische Beobachtung von diesen Hemoflagellate Protisten ist schwierig in Hut-Fällen, die von T. B. rhodesiense, (mehr als 95 % der Fälle) verursacht werden können, wie niedrige Parasitemias die Regel sind, während T. B. Rhodesiense, einen großen Hut durch Anzahl der Parasiten sind häufig im Blut vorhanden. Verschiedene Techniken der Konzentration verwendet worden sind, wie dicke Tropfen und Kapillarrohr Zentrifugation (CTC), aber die Trennung der Parasiten von Blut durch eine Spalte der Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) gefolgt von Zentrifugation und mikroskopische Beobachtung von der Pellet, ist die empfindlichste Methode (rund 50 Parasiten/mL Blut nachweisbar)^1,7. Folglich ist die Reinigung der Trypanosomen Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) dadurch das beste und bis heute ist die Referenzmethode zur Visualisierung und Parasiten aus Blut für Hut-Diagnose zu isolieren. Unter Feldbedingungen eine Mini-Spalte der DEAE Cellulose erfolgreich eingesetzt und mehrere Verbesserungen konnten mikroskopischen Beobachtung^7,8.

Die Methode der Trypanosomen Trennung von Blut, wie unten beschrieben, hängt Parasit Oberflächenladung, die weniger negativ als Blut Säugerzellen⁹ist. Interessanterweise ist diese Methode entwickelte sich vor 50 Jahren, im Jahr 1968 von Dr. Sheila Lanham, und bleibt der Goldstandard für Erkennung und Vorbereitung der Trypanosomen Blutbahn. Es ist schnell und reproduzierbar für Salivarian Trypanosomen aus einer Vielzahl von Säugetieren, erlaubt die Diagnose sowohl tierische und menschliche Trypanosomiasis¹⁰.

Um lebendige, gereinigten Parasiten zu erhalten, wird infiziertes Blut auf ein Anion-Exchanger-Spalte hinzugefügt. Chromatographie-Bedingungen (vor allem pH-Wert, Ionenstärke der Puffer/Medien) müssen für die einzelnen Trypanosomen-Arten, und ganz allgemein für jede Mischung von Säugerzellen Blut und Trypanosomen¹⁰angepasst werden. Elution Buffer ist genau auf pH 8 für die meisten afrikanischen Trypanosomen¹⁰eingestellt. Diese Methode begünstigt die Konzentration der Parasiten im Blut von Patienten gefunden, weil Parasitemias zu niedrig, um durch mikroskopische Beobachtung allein erkannt werden können, und es ermöglicht auch Laboruntersuchungen. Arbeiten mit frisch isolierte Trypanosomen und auf das Blut von infizierten Tieren, die mit dieser Technik ist mehr relevant für die verschiedenen Untersuchungen als Studien mit Parasiten, die in axenic Bedingungen im Labor auf unbestimmte Zeit kultiviert wurde.

Wirt-Parasit-Beziehungen sind am besten untersucht mit einem Parasiten infiziert seinen natürlichen Wirt, daher T. Musculi, einen natürlichen murinen Parasiten, die Vertreter der extrazellulären Trypanosomen, hat viele Vorteile, wie in murinen Infektion beinhaltet eine kleinen Versuchstier und erfordert keine Biohazard Sicherheitsbedingungen Niveau (BSL). T. Musculi tötet nicht immunkompetenten Mäusen, im Gegensatz zu vielen anderen Trypanosomen -Arten, einschließlich menschliche Krankheitserreger. T. Musculi entfallen nicht in T-Zell-beraubt Mäuse und Parasitemias kann bei infizierten Mäusen erhöht werden, indem Sie Nahrung und Nährstoff-Aufnahme¹¹ändern. Dieser Parasit moduliert die Immunantwort bei Co-Infektionen mit anderen Krankheitserregern¹². T. Musculi von infizierten Mäusen Ausstellung Unterschiede von kultivierten T. Musculi, z. B. der Ausdruck von Membranrezeptoren Fc T. Musculi axenic Kulturen, im Vergleich zu Parasiten gereinigt von infizierten Mäusen¹³ verliert ^{, 14}. Excreted abgesondert Faktoren (ESF) sind auch qualitativ und quantitativ weniger in axenic Trypanosomen Kulturen zum Ausdruck gebracht und unterscheiden sich zwischen den Stämmen in endemischen Gebieten¹⁵isoliert. ESF sind die ersten Antigene auf das Immunsystem des Wirts angezeigt werden und so eine wichtige Rolle in der ursprünglichen Host Immunantwort¹⁶.

Bei experimentell infizierten Tieren für Laboruntersuchungen erleichtert dieses Protokolls Experimente an einer größeren Anzahl von Parasiten, die Minimierung von Mäusen erforderlich, insbesondere bei Verwendung von immunsupprimierten Tieren. Die Variante Oberfläche Glykoproteine (VSGs), die in der Karte Agglutination Test für Trypanosomiasis (CATT) in Massen-Screening verwendet werden sind noch gereinigt von Trypanosomen, die bei Ratten übertragen werden. Die zwei diagnostische Schnelltests (einzeln verpackte Kassetten), die jetzt verfügbar sind für den Einsatz im Feld, sind immer noch mit einer infektiösen Modell Quelle der native VSGs und nicht in Vitro kultiviert Trypanosomen^{1,4, 5}. der Fortschritt in der Studie der Trypanosomen Immunologie und Biologie wurde erleichtert, da diese DEAE Zellulose gereinigt Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Hosts und in bestimmten, Nagetiere erzielt werden können.

Protokoll

Untersuchungen gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikation Nr. 85±23, revidiert 1996). Protokolle wurden von unseren lokalen Ethikkommission genehmigt.

(1) Tiere

1. Halten Sie weibliche Schweizer (von 1) Mäuse im Alter von acht bis zehn Wochen alt, 20-25 g, bei einem Tier Gehäuse Anlage 15 Tage vor jedem Experiment. Beherbergen sie in belüfteten Boxen, die in einem geschützten, Temperatur (22 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %) gehalten werden Zimmer mit 12 Stunden ein-/Licht-Zyklus gesteuert.
2. Den Tieren freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser. Minimieren Sie Schmerzen, leiden und Ängsten und bieten Sie Bereicherung der Umgebung.
3. Verwenden Sie für den Wohnungsbau, klar einwandig Käfige, Anreicherung mit Holzstäbchen und Karton Tunnel. Zeichnen Sie ein Tier sanft in einen Tunnel auf der Handfläche der Hand aus dem Käfig zu übertragen.
4. Überwachen Sie täglich um Anzeichen von Erschöpfung, soziale Isolation, Körper Verletzung, zerzauste Haare, oder Mangel an Pflege zu beurteilen.
5. Wiegen Sie jedes Tier einmal pro Woche. Führen Sie regelmäßige Inspektionen durch einen Tierarzt.
6. Für natürliche Parasiten sammeln Sie Blut auf dem Höhepunkt des Parasitemia und für Parasiten verursacht tierischen Tod, sammeln Sie Blut am Vortag vermuteten Tod.
   Hinweis: Alle Experimente mit Infektionserregern sind in speziellen Räumen nach Universität genehmigten Richtlinien durchgeführt.

2. Puffer, Medien-Vorbereitungen

1. Wiegen Sie jedes Stoffes und fügen Sie destilliertes Wasser für die folgenden Puffer:
   1. Konzentrierte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung vorbereiten (2 X):
      Na₂HPO₄ (wasserfrei) (MW 141,96 g) 10,14 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,62 g
      NaCl (MW 58,44 g) 2,55 g
      H₂O, 1 L destilliertem
   2. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Glukose vorbereiten:
      Na₂HPO₄ (wasserfrei) (MW 141,96 g) 5,39 g
      NaH₂PO₄∙2H₂O (MW 156,01 g) 0,31 g
      NaCl (MW 58,44 g) 1,70 g
      Glukose (MW 180 g) 10 g
      H₂O, 1 L destilliertem
   3. 1 M KH₂PO₄vorbereiten.
   4. Bereiten Sie Elution Buffer: Ergänzen Sie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Glucose mit
      Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (100 µg/mL) und Phenol-rot (5 µg/mL).

3. Vorbereitung der DEAE-cellulose

1. Planen Sie ca. 5 Stunden für die DEAE-Zellulose-Vorbereitung.
2. 100 g DEAE-Zellulose mit destilliertem Wasser in eine Flasche mit einem schmalen Hals waschen und lassen zu begleichen, dann Feinstaub zu verwerfen. Wiederholen Sie wäscht, bis der Überstand klar ist.
3. 3 L konzentrierter 2 x Phosphate-Buffered Kochsalzlösung und rühren hinzufügen.
4. PH bis 8.0 mit 1 M KH₂PO₄ anpassen und überstand verwerfen.
5. Zweimal mit destilliertem Wasser zu waschen und um zu begleichen lassen.
6. Waschen und zweimal mit 3 Liter Phosphate-Buffered Kochsalzlösung-Glukose zu begleichen und verwerfen die Überstände lassen.
7. Messen Sie das Volumen der Cellulose und fügen Sie ein gleiches Volumen des Phosphate-Buffered Kochsalzlösung-Glucose, in Kunststoff-Flaschen verteilen und Lagerung bei-20 ° C.

(4) Parasiten

1. Trypanosomen Stämme in Gebieten endemisch für Mensch und Tier Trypanosomiasis zu sammeln. Halten Sie Parasiten in flüssigem Stickstoff eingefroren.
   Hinweis: Trypanosomen Musculi ist für den Menschen apathogen und eine extrazelluläre Trypanosomen sicher Pathogene Trypanosomen in verschiedenen Laborversuchen ersetzt.
2. Bei Laboruntersuchungen erfordert menschliche Krankheitserreger Experimente mit Sorgfalt gewidmet entsprechende Biohazard Sicherheitsbedingungen Niveau (BSL) und Vorsichtsmaßnahmen zu behandeln; BSL2 für T. B. rhodesiense und BSL3 für T. B. Rhodesiense. Unter Feldbedingungen, mikrobiologische Standardpraxis etabliert: Sampling, mechanische pipettieren, häufige Dekontamination von Oberflächen und Sterilisation von Abfällen zu sichern.

(5) Maus-Infektion

1. Tauen Sie schnell Parasiten in einem Wasserbad bei 37 ° C auf.
2. Einen Tropfen von aufgetauten infiziertem Blut mit einem Mikroskop zu beobachten. Bewerten Sie Parasiten Lebensfähigkeit durch Messung der Anteil der bewegliche Formen¹⁷.
3. Injizieren Sie Parasiten intraperitoneal in Mäusen (0,5 mL pro Maus). Jeden Tag nach der Infektion, sammeln Sie 20 µL Blut Schweif durch Punktion und unter dem Mikroskop beobachten. Parasitemia nach Herbert und Lumsden¹⁸ durch Parasiten in mehreren Mikroskop zählen oder mithilfe einer Zählkammern zu bewerten.
4. Wenn die Parasitemia einen Schwellenwert, der für jede Belastung definiert ist überschreitet, sammeln Sie das Blut (1 mL/Maus) in der Elution Puffer (5 mL/Maus) mit Heparin (10 U/mL).
   Hinweis: Die originelle und neuartige Arbeit Lanham und Godfrey berichtet, dass die optimale Ionenstärke des Phosphats saline Glukose für mehrere Parasit/Arten von pH 8,0-Stammlösung gepuffert.

(6) Parasit Trennung

Hinweis: Alle Versuche ab diesem Zeitpunkt müssen in einer Gewebekultur Kapuze mit Handschuhen durchgeführt werden. Die Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit in den Labors verwendet wurden 22 ° C und 45 %. Unter Feldbedingungen hat Parasiten Trennung erfolgreich bei 34 ° c durchgeführt

1. Eine 10 mL Spritze in eine vertikale Unterstützung geben Sie und eine zuvor ausgeschnittene Rundschreiben, Stück Filterpapier, Glaswolle oder Zelluloseschwamm.
2. Gießen Sie die DEAE Cellulose in die Spritze, bis 8 mL Niveau erreicht ist, und dann waschen mit 25 mL Elution Puffer.
3. Vorsichtig 2 mL verdünnte Blut am oberen Rand der Spalte und anschließend fügen Sie Elution Medium hinzu. Fügen Sie regelmäßig Elution Puffer entsprechend den Transit von der Trypanosomen.
4. Sammeln Sie Abwasser Tropfen aus den Spalten in ein Zentrifugenröhrchen und prüfen Sie regelmäßig auf das Vorhandensein von Parasiten mit einem Mikroskop.
5. Wenn Parasiten in der Spalte Abwasser nicht mehr erkannt werden, Zentrifugieren Sie das Rohr (1.800 X g, 10 Minuten, bei 4 ° C im Labor und bei Raumtemperatur unter Feldbedingungen).
6. Entfernen des Überstands und die Parasiten in 1 mL des entsprechenden Mediums erforderlich für investigative als nächstes aussetzen.
7. Zählen Sie Parasiten mit einer Hemocytometer zu und verdünnen sie in geeigneter Form zu, wenn nötig.

Ergebnisse

Gereinigte Trypanosomen wurden in Arzneimitteltests verwendet. Parasiten sind in Kultur Brunnen mit Verdünnungsreihen von bestimmten Medikamenten, entweder allein oder gemischt¹⁹übertragen. Mikroskopische Beobachtungen auswerten Motilität ist ein Marker der Lebensfähigkeit, kann durchgeführt werden, wenn nur ein paar Enten getestet werden, während AlamarBlue Zelle Lebensfähigkeit Assay ist eine hervorragende Methode für große Beweglichkeit Assays während ...

Diskussion

Gereinigte Trypanosomen sind ein mächtiges Mittel, Immunologie, Biochemie, zelluläre und molekulare Biologie zu studieren. Große Flächen von Daten und Ergebnissen erhielten von Trypanosomen, die hat dann dazu beigetragen, andere eukaryotische Zellen³⁰Informationen einzuholen. Trypanosomen sind auch Gegenstand der Forschung wichtig und interessant, weil sie zahlreiche Mechanismen, die ihnen ermöglichen entwickelt haben, zu überleben und wachsen in zwei sehr unterschiedlichen Umgebungen: die T...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Pipettes	Falcon	357,551
2 mL Pipettes	Falcon	352,507
Centrifugation tube 50 mL	Falcon	352,070
Centrifuge	Sigma Aldrich	4K15
DEAE cellulose	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
filter paper	Whatman	1,001,125
Flat bottom flask narrow neck	Duran	21 711 76	6000 mL
Glucose	VWR	101174Y	500 G
Heparin	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
Microscope	Olympus	CH-20
Microscope coverslips	Thermofisher scientific	CB00100RA020MNT0
Microscope slides	Thermofisher scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
NaCl	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL	Thermofisher scientific	342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL	Thermofisher scientific	342024-0500
Pasteur Pipette	VWR	BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
Phenol red	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
Syringue	Dutscher	SS+10S21381
Tissue culture hood	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)		Partinico II