JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن تصف الخطوات الأساسية لتسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) في شريحة الحبل الشوكي في المختبر . يسمح هذا الأسلوب خصائص الغشاء الجوهرية وانتقال متشابك وتوصيف الخصائص المورفولوجية سان جرمان الخلايا العصبية دراستها.

Abstract

وقدمت دراسات أجريت مؤخرا المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ جيلاتينوسا (سان جرمان) مجموعة كبيرة من المعلومات عن آليات العمود الفقري الكامنة وراء انتقال الحسية والتنظيم nociceptive، وتنمية ألم أو حكة مزمنة. كذلك تحسنت تطبيقات التسجيلات الكهربية إلى جانب الدراسات المورفولوجية استناداً إلى الأداة المساعدة لشرائح الحبل الشوكي الحاد لفهمنا لخصائص الخلايا العصبية وتكوين الدوائر المحلية في سان جرمان. وهنا، نقدم دليل المفصل وعملية لإعداد شرائح الحبل الشوكي وإظهار الممثل كامل الخلية التسجيل والنتائج المورفولوجية. هذا البروتوكول يسمح بالمحافظة على الخلايا العصبية مثالية، ويمكن أن تحاكي في فيفو الظروف إلى حد ما. وباختصار، القدرة على الحصول على التحضير في المختبر لشرائح الحبل الشوكي تمكن تسجيلات المشبك الحالية والجهد مستقرة ويمكن وبالتالي تسهيل تحقيقات مفصلة في خصائص الغشاء الجوهرية، الدوائر المحلية و هيكل الخلايا العصبية باستخدام مختلف النهج التجريبي.

Introduction

جيلاتينوسا المادة (سان جرمان، الصفيحة الثاني من القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري) مركز ترحيل هام بلا منازع ليحيل بها وتنظيم المعلومات الحسية. وهو يتألف من إينتيرنيورونس عليه والمثبطة، التي تتلقى مدخلات من الألياف الزبائ الأولية، إينتيرنيورونس المحلية، و نظام المثبطة تنازلي الذاتية1. في العقود الأخيرة، ومكنت تطوير إعداد شريحة الحبل الشوكي الحاد وظهور تسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك دراسات مختلفة عن الخصائص الجوهرية الكهربية والمورفولوجية ل الخلايا العصبية SG2، 3 , 4 فضلا عن دراسات للدوائر المحلية في سان جرمان5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، باستخدام إعداد شريحة الحبل الشوكي في المختبر ، الباحثين ويمكن تفسير التغييرات في الخلايا العصبية اكسسيتابيليتيس7،8، وظيفة أيون القنوات10من9،، و أنشطة متشابك11،12 تحت مختلف الظروف المرضية. وقد تعمقت هذه الدراسات فهمنا للدور الذي تؤديه سان جرمان الخلايا العصبية في تطوير وصيانة الألم المزمن وحكة الأعصاب.

أساسا، الشرط الأساسي لتحقيق وضع تصور واضح سوما الخلايا العصبية والمثالي كامل الخلية التصحيح باستخدام شرائح الحبل الشوكي الحاد لضمان نوعية ممتازة من شرائح حتى يمكن الحصول على الخلايا العصبية سليمة وباتشابل. ومع ذلك، إعداد شرائح الحبل الشوكي ينطوي على عدة خطوات، مثل القيام الاستئصال البطني وإزالة غشاء العنكبوتية بيا، الذي قد تكون عقبات في الحصول على شرائح صحية. على الرغم من أنه ليس من السهل إعداد شرائح الحبل الشوكي، أداء التسجيلات في المختبر على شرائح الحبل الشوكي مزايا عدة. بالمقارنة مع خلية ثقافة الأعمال التحضيرية، شرائح الحبل الشوكي يمكن جزئيا الحفاظ على اتصالات متشابك المتأصلة التي في حالة فسيولوجيا ذات صلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين كامل الخلية التصحيح-المشبك تسجيل باستخدام شرائح الحبل الشوكي مع أساليب أخرى، مثل التصحيح مزدوجة المشبك13،14و15،الدراسات المورفولوجية16 وخليه واحدة RT-PCR 17-ولذلك، هذا الأسلوب يوفر المزيد من المعلومات في وصف الاختلافات التشريحية والوراثية داخل منطقة محددة ويسمح للتحقيق في تشكيل الدوائر المحلية.

هنا، نحن نقدم وصفاً الأساسية والتفصيلية لأسلوبنا لإعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد والحصول على تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية SG.

Protocol

ووافق جميع البروتوكولات التجريبية ووصف "الحيوان الأخلاقيات اللجنة من نانتشانغ الجامعة" (نانتشانغ، الصين للعلاقات العامة، والأخلاقية No.2017-010). قدمت جميع الجهود المبذولة للتقليل من الإجهاد والألم من الحيوانات التجريبية. وأجريت التسجيلات الكهربية تؤدي هنا في درجة حرارة الغرفة (RT، 22-25 درجة مئوية).

1-الحيوانات

  1. استخدام الفئران سبراغ داولي (3 – 5 أسابيع من العمر) من أي من الجنسين. بيت الحيوانات تحت دائرة ضوء الظلام ح 12 وإعطائهم إعلانية libitum الوصول إلى الغذاء الكافي والمياه.

2-إعداد الحلول والمواد

  1. الحلول
    1. إعداد النخاعي الاصطناعية (قام) (في مم): 117 كلوريد الصوديوم، 3.6 بوكل و 1.2 نة2بو4·2H2س، 2.5 كاكل2·2H2س، 1.2 مجكل2·6H2س، 25 ناكو3، 11 د-الجلوكوز، وحمض الأسكوربيك 0.4 و 2 بيروفات صوديوم. انظر الجدول 1.
    2. إعداد السكروز-قام (في مم): 240 السكروز، 2.5 بوكل، 1.25 نة2بو4·2H2س، 0.5 كاكل2·2H2س و 3.5 مجكل2·6H2س، 25 ناكو3، حمض الأسكوربيك 0.4 وبيروفات صوديوم 2. انظر الجدول 2.
    3. إعداد ك+-على أساس الحل داخل الخلايا (في مم): 130 كغلوكونات، 5 بوكل، 10 غ2-phosphocreatine، عطا 0.5، حبيس 10, 4 مغ-ATP، وأنشئ لي 0.3. انظر الجدول 3.
    4. إعداد Cs+-على أساس الحل داخل الخلايا (في مم): 92 كسميسو4, 43 CsCl، 10 غ2-فوسفوكريتيني، تيترايثيلامونيوم 5 (الشاي)-Cl، عطا 0.5، حبيس 10، 4 ملغ-ATP، وأنشئ لي 0.3. انظر الجدول 4.
      ملاحظة: يجب إعداد كل الحلول باستخدام الماء المقطر. قام وقام السكروز ينبغي أن يكون كاربوجيناتيد (خليط2 95% O2 و 5% CO) قبل استخدامها للحفاظ على درجة حموضة أمثل لما يقرب من 7.4، وينبغي تعديل osmolality من هذين الحلين لموسم 300-310. لأنه يمكن أن يؤثر حمض الأسكوربيك على قنوات الكالسيوم، يجب حذف هذا الوكيل إذا كان أحد يود أن يسجل التيارات الكالسيوم. ينبغي قياس osmolality ودرجة الحموضة من الحلول داخل الخلايا والمعدلة لموسم 290 – 300 و 7.2 – 7-3، على التوالي. من المستحسن لتصفية الحلول داخل الخلايا مع 0.2 ميكرون المرشحات وتخزين الحلول كمختبرين 1 مل في-20 درجة مئوية. تطبيق خدمات العملاء+ والشاي في Cs+-على أساس الحل داخل الخلايا إلى كتلة البوتاسيوم القناة، مما يفضي إلى استخدام مكبر للصوت لعقد الغشاء المحتملة ثابت، 0 mV عند تسجيل التيارات بوستسينابتيك المثبطة (إيبسكس).
    5. إعداد الحل نيوروبيوتين 488 0.05%. حل 2 مغ من نيوروبيوتين 488 في 4 مل ك+-على أساس الحل داخل الخلايا وضبط أوسمولاليتي لموسم 290 – 300 باستخدام الماء المقطر أو السكروز إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: 1 مم سكروز يزيد الاسموليه بموسم 1.
    6. إعداد أجار 3% ككتلة للحبل الشوكي. حل ز 7.5 من أجار في 250 مل مياه النقية في كوب زجاج، وثم استخدم ميكروويف للحرارة فإنه حتى الغليان وواضحة. دوامة الحل وصب الخليط 17.5 × 10.5 سم × 1.8 سم علبة بلاستيكية للتجميد بعد ذلك. تبقى في أجار عند 4 درجة مئوية قبل استخدامها.
    7. إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) لتجهيز المناعي. ز 40 مزيج من مسحوق منهاج عمل بيجين لمل ~ 800 من تسخين (حوالي 60 درجة مئوية) 1 × الحل برنامج تلفزيوني (130 مم كلوريد الصوديوم، 7 ملم Na2هبو4، 3 مم نة2ص4). ببطء قم بضبط درجة الحموضة بإضافة 1 هيدروكسيد الصوديوم N قطرات حتى يذوب مسحوق منهاج العمل تماما. وبمجرد أن الحل أصبح واضحا، ضبط الحجم الإجمالي إلى 1 لتر مع برنامج تلفزيوني 1 x. تعديل درجة الحموضة إلى 7.2 – 7.4 استخدام 1 N HCl عند الحاجة، ثم تصفية الحل منهاج العمل 4% وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: منهاج عمل بيجين السمية، حيث أنه مطلوب لارتداء أقنعة وقفازات، فضلا عن سلامة النظارات. إجراء عملية إعداد 4% منهاج العمل داخل غطاء التهوية. ويمكن حل مسحوق منهاج العمل تماما في الرقم الهيدروجيني من حوالي 9-10.
  2. الصكوك
    1. لنظام نموذجي الكهربية، استخدم مجهر تستقيم مجهزة بالتباين التدخل التفاضلية الأشعة تحت الحمراء (IR-DIC) وهدف غمر مياه عالية الاستبانة، كاميرا CCD/CMOS، مكبر للصوت في تصحيح-المشبك، حامل ميكروبيبيتي ميكرومانيبولاتور السماح بتعديل غرامة من موقف ماصة. مرحلة تخطيط س وص ضروري أيضا لنقل المجهر.
    2. تحميل جميع المعدات على طاولة عزل اهتزاز محاطة بقفص فاراداي. قم بتوصيل جهاز عرض فيديو كاميرا فيديو لمراقبة الخلايا العصبية وتصور ميكروبيبيتيس.
  3. ميكروبيبيتيس
    1. جعل أقطاب تسجيل من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية باستخدام ساحبة ميكروبيبيتي. نطاقات المقاومة ماصة نموذجية من 3-6 MΩ عندما تملأ مع الحل داخل الخلايا.
  4. كتلة أجار
    1. إعداد 1.2 سم × 1.5 سم × سم 2.0 أجار كتلة. تقليم الكتلة في الأشكال كما هو موضح في الشكل 1 المطلوبة.

3-إعداد شريحة الحبل الشوكي الحاد

ملاحظة: تعد عرضية أو باراساجيتال الحبل الشوكي الشرائح كما سبق وصف18،،من1920.

  1. قبل التروية ترانسكارديال واستخراج النخاع الشوكي، إعداد ~ 500 مل السكروز-قام اكويليبراتيد مع 95% O2 و 5% CO2 وبارد حل المثلج (0-4 درجة مئوية).
  2. تهدئة جميع أدوات تشريح (مثل تشريح مقص، قزحية مقص، ملقط مسنن، الملقط غرامة، ومنحني ملقط) على الجليد. يظهر الرسم التخطيطي لإعداد شريحة الحبل الشوكي الحاد في الشكل 1.
  3. نضح ترانسكارديال
    1. بعد حقنه واحدة (داخل، القائمة) من يوريتان (1.5 غرام/كغ)، انتظر لمدة 2 – 3 دقيقة، وتقييم عمق التخدير من الفئران عن طريق اختبار الاستجابات قرصه أخمص القدمين أو الذيل. بمجرد الحفاظ على طائرة جراحية التخدير، وضع الفئران في الثلج المجروش في موقف ضعيف.
      ملاحظة: لإنتاج كافية لعدم الإدراك للألم العميق التخدير خلال thoracotomy، اتبع المبادئ التوجيهية IACUC المحلية الخاصة بك.
    2. جعل شق (3 – 4 سم) من خلال الجلد من عملية الرهابه إلى الترقوة، ثم قم بإجراء شق عرضية تحت مستوى عملية الرهابه.
    3. فهم ورفع عملية الرهابه مع زوج من منحنى ملقط لفضح الحجاب الحاجز تماما. جعل شق عرضية من خلال الحجاب الحاجز، وبعد ذلك قطع طريق القفص الصدري بين عظمة الصدر والاضلاع ثنائيا لفتح تجويف الصدر. استخدام الملقط منحنى لفهم عملية الرهابه حتى يتم إصلاحها في القفص الصدري، ويتعرض القلب بما فيه الكفاية.
    4. عقد القلب بالملقط منحنى آخر برفق، ثم قم بإدراج إبرة ز 22 عن طريق البطين الأيسر إلى قاعدة القوس الاورطي.
    5. قطع الاذين الأيمن مع مقص غرامة فورا، ثم قم بتشغيل نضح قام السكروز المثلج، اﻷوكسيجين من خلال نظام جاذبية.
      ملاحظة: يمكن تيسير نضح ترانسكارديال السريع والكافي مع السكروز المثلج-قام التبريد السريع للحبل الشوكي، بينما تركيز الصوديوم والكالسيوم منخفض قد تساعد في التخفيف من سمية عليه وحماية الوظيفة العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، ستكون مفيدة للحد من تلطيخ الخلفية من بيوسيتين عند القيام بدراسة الخصائص مورفولوجية مسح خلايا الدم الحمراء. نضح يعتبر كافياً وراضية طالما السائل تخرج اتريوم الحق الواضح ولون الكبد في الفئران وآثار أقدام شاحب. ينبغي أن يكون غيض الإبرة ز 22 صريحا لتجنب تمزيق قلب والقوس الاورطي.
  4. تشريح النخاع الشوكي وتقطيع
    1. إجراء شق طولي (5 سم) على الجلد الخلفي من والذيلية إلى روسترال، ثم قطع طريق القفص الصدري بين العمود الفقري والاضلاع في أي من الجانبين في حالة التروية.
    2. إجراء خفض في نهاية العمود الفقري والذيلية واستخدام مقص لقطع الأنسجة المحيطة بها، وعزل الجزء لومبوساكرال من العمود الفقري سرعة.
    3. نقل الجزء لومبوساكرال إلى طبق زجاج تحتوي على قام على أساس السكروز المثلج. مع الجانب البطني التصاعدي، استخدام مقص جيد لقطع طريق بيديكلي الفقري ثنائيا وفضح الحبل الشوكي بعناية. عزل حبل الشوكي طويلة 2-سم مع توسيع lumbosacral (L1 – S3)، ونقل قسم العمود الفقري لآخر طبق زجاج مليئة بالبرد السكروز-قام.
    4. قم بإزالة في السحايا والغشاء بيا-العنكبوتية تحت مجهر تشريح. قطع جميع البطني والجذور الظهرية بعيداً بأقصى سرعة ممكنة.
    5. ضع الحبل الشوكي على كتلة أجار المشذبة سابقا. إعداد شرائح عرضية وإرفاق الجانب البطني من الحبل الشوكي أجار والسماح للجانب الظهرية تجاه بليد. إعداد شرائح باراساجيتال، إرفاق الجانب البطني مع superglue أجار في اتجاه رأسي كما هو مبين في الشكل 1. ثم، جبل كتلة أجار إلى منصة فيبرتوم مع superglue. إعداد 300 – 500 ميكرومتر عرضية أو شرائح باراساجيتال مع سرعة تقدم 0.025 mm/s وتواتر اهتزاز 80 هرتز.
    6. استخدام ماصة قطع البلاستيك لنقل الشرائح على شبكة النايلون في غرفة تخزين التي تحتوي على قام اﻷوكسيجين بشكل مستمر عند 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تسجيل.
      ملاحظة: الحرص على تجنب الإصابة بالحبل الشوكي، وبخاصة القرن الأفريقي الظهرية، عند إزالة السحايا وجذور العمود الفقري. وينبغي أن تكون شرائح الحبل الشوكي الظهرية بطنيا. للحصول على أفضل النتائج، ينبغي إعداد الشرائح سريعاً (في غضون 15-20 دقيقة). يجب أن يكون سمك شريحة العمود الفقري مكم لا يزيد عن 600 للوفاء برؤية الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الأسلوب الموصوفة أعلاه للحصول على شرائح الشوكي الأفقي.

4. تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية

  1. لإجراء تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الخلايا العصبية سان جرمان، استخدم ك+-على أساس الحل داخل الخلايا لمعظم تسجيل الحالات، أثناء تطبيق خدمات العملاء+-على أساس الحل فقط لتسجيل التيارات بوستسينابتيك المثبطة.
  2. نقل شريحة حبل الشوكي بلطف إلى دائرة التسجيل، وثم الحفاظ على تعلقها بسلك البلاتين على شكل U بخيوط النايلون بقوة للاستقرار شريحة الأمثل. نتخلل الشريحة مع فقاعات قام في RT من خلال نظام جاذبية بثبات وتعيين معدل التروية في 2 – 4 مل/دقيقة لتحقيق الأوكسجين الكافي.
  3. تحديد منطقة سان جرمان (عصابة شفافة) باستخدام عدسة مجهر منخفضة الدقة واختيار خلية صحية باستخدام هدف الاستبانة كالخلية الهدف وضبطه إلى وسط الشاشة الفيديو.
  4. ملء ميكروبيبيتي حجم مناسب ك+-على أساس أو Cs+-على أساس الحل داخل الخلايا حسب الحاجة، إدراج ميكروبيبيتي صاحب القطب، والتأكد من أن الحل داخل الخلية هو الاتصال بأسلاك الفضة داخل حامل.
  5. تجلب ميكروبيبيتي في التركيز وتزج أنه في قام استخدام ميكرومانيبولاتور ثم قم بتطبيق ضغط إيجابي معتدل (~ 1 هذه المبادرة عندما تقاس مع لكنها) إلى القوة ميكروبيبيتي بعيداً عن أي التراب والحطام.
  6. تحريك ميكروبيبيتي نحو العصبية المستهدفة تدريجيا. الإفراج عن ضغط إيجابي مرة واحدة الماصة النهج العصبية ومن أشكال نقرة صغيرة جداً في غشاء الخلايا العصبية لتشكيل جيجاسيل.
  7. تغيير عقد المحتملة إلى-70 mV، التي هي قريبة من الفسيولوجية يستريح غشاء المحتملة (خطة إدارة المبردات) خلية. ثم قم بتطبيق شفط عابرة ولطيف إلى ميكروبيبيتي تمزق الغشاء وإنشاء تكوين كامل الخلية جيدة.
    ملاحظة: بعد نقل الشريحة إلى دائرة التسجيل، تأكد من نضح المطرد لمدة 5 دقائق على الأقل لإزالة الأنقاض على سطح شريحة. تجدر الإشارة إلى أن القدرة على التمييز بين الخلايا العصبية سليمة وغير صحية/الميت من الأهمية بالنسبة لختم جيدة ومستقرة التسجيل. وقد العصبية غير صحية/قتيلا ظهور تورم أو منكمش، جنبا إلى جنب مع نواة كبيرة مرئية، بينما خلية صحية تتميز بشكل ثلاثي الأبعاد (3D) مع غشاء مشرق وسلس، ونواته غير مرئية. من الضروري لتحقيق تكوين كامل الخلية، للتعويض عن السعة سريعة أو بطيئة خطوة بخطوة عند الضرورة. في الرايت، يحسب تقاطع السائل المحتملة أن يكون المتوسط 15.1 – 15.2 و mV 4.3 – 4.4 في ك+-على أساس، وخدمات العملاء+-على أساس الحل داخل الخلية، على التوالي. في دراساتنا، صححت البيانات المسجلة لا لاحتمال تقاطع السائل.
  8. تسجيلات لخصائص الغشاء الجوهرية
    1. تسجيل خصائص الغشاء الجوهرية السلبي: "سجل خطة إدارة المبردات" فورا (ضمن 20 s) بعد انقطاع. تحديد مقاومة إدخال الخلايا العصبية عن طريق قياس الجهد ردا على ديبولاريزينج الحالي (10 باسكال، 500 مللي) في خطط إدارة المبردات في الوضع الحالي-المشبك.
    2. سجل إطلاق خصائص: اختبار نمط إطلاق النار كل الخلايا العصبية في المشبك الحالية مع سلسلة من 1 s ديبولاريزينج البقول الحالية (25 – 150 السلطة الفلسطينية مع زيادة السلطة الفلسطينية 25) في خطط إدارة المبردات. قياس العتبة والسعة ونصف العرض من إمكانات عمل واحد دون اتصال.
    3. سجل الحالي سوبثريشولد: لتقييم التيارات سوبثريشولد جسدية، عقد في الغشاء المحتملة في-50 أم في وضع المشبك الجهد. ثم قم بتطبيق سلسلة من هايبربولاريزينج نبضات التيار الكهربائي لمدة ثانية 1-60 من السيارات إلى-120 أم، مع إنقاص 10-أم.
    4. تسجيل التيارات بوستسينابتيك ضادات (ابسكس): "ابسكس سجل" مع ك+-على أساس الحل داخل الخلايا في وضع المشبك الجهد في إمكانية عقد من-70 mV.
    5. إيبسكس السجل: تطبيق خدمات العملاء+-على أساس الحل داخل الخلايا لتسجيل إيبسكس. حالما يتم إنشاء التكوين كامل الخلية، اضغط الغشاء المحتملة في-70 mV ~ 5 دقيقة، وقم بتغيير عقد المحتملة إلى 0 mV تدريجيا. انتظر لبضع دقائق لتحقيق الاستقرار، ومن ثم البدء في تسجيل أحداث اللجنة التوجيهية.
      ملاحظة: يجب تحديد الخلايا العصبية فقط مع خطة إدارة المبردات أقل من-50 أم وتبين الانحسار لمزيد من الدراسة. عادة مقاومات سلسلة في دراستنا MΩ 10-30، وينبغي أن تستبعد تسجيل مرة واحدة المقاومة سلسلة التغييرات بأكثر من 20%. يمكن التأكد من ابسكس مع تطبيق حمام من 50 ميكرومتر APV و 20 ميكرومتر كنقكس، في حين يمكن تأكيد إيبسكس مع 10 ميكرون بيكوكوليني والاستركنين 1 ميكرومتر.

5-الخصائص المورفولوجية دراسة

  1. لتجارب المورفولوجية، استخدم ك+-على أساس الحل داخل الخلايا التي تحتوي على 0.05% نيوروبيوتين 488.
  2. إزالة بعد الحفاظ على مستقر الكهربية تسجيل لمدة 20 دقيقة على الأقل، ببطء في ميكروبيبيتي في الاتجاه التصاعدي للسماح لغشاء الخلية لإعادة ختم ونقل الشريحة الحبل الشوكي إلى حاوية مليئة بنسبة 4 في المائة منهاج عمل بيجين. تحديد الشرائح في 4% منهاج عمل بيجين في RT ح 1، ثم في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  3. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني ومن ثم تزج لهم في الإيثانول 50% لمدة 30 دقيقة. بعد يغسل ثلاث أخرى في برنامج تلفزيوني، جبل الشرائح في سمكها الأصلي على الشرائح مع وسيلة متزايدة.
  4. استخدام مجهر [كنفوكل] (انظر الجدول للمواد) للحصول على الصور والتعمير 3D الخلايا العصبية. مسح الخلايا العصبية من خلال عدسة X 20 مع z-كومة من 1.5 ميكرومتر.

النتائج

وتم إعداد شرائح النخاع الشوكي الحادة وفقا للمخطط المبين في الشكل 1. بعد تقطيع والانتعاش، نقل شريحة حبل الشوكي إلى دائرة التسجيل. وتم تحديد الخلايا العصبية سليمة استناداً إلى مظهر سوما باستخدام الأشعة تحت الحمراء-DIC مجهرية. بعد ذلك، كانت أثارت إمكانات العم...

Discussion

هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة لإعداد شرائح الحبل الشوكي، التي كنا قد استخدمت بنجاح عند إجراء تجارب كامل الخلية التصحيح-المشبك في سان جرمان الخلايا العصبية18،19،،من2021. من خلال تنفيذ هذا الأسلوب، ونحن ذكرت مؤخرا ...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (رقم 81560198، 31660289).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigmaS7653Used for the preparation of ACSF and PBS
KClSigma60130Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2OSigma71500Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2OSigmaC5080Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2OSigmaM2670Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3SigmaS5761Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-GlucoseSigmaG7021Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acidSigmaP5280Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvateSigmaA7631Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
SucroseSigmaS7903Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconateWako169-11835Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-PhosphocreatineSigmaP1937Used for the preparation of intracellular solution
EGTASigmaE3889Used for the preparation of intracellular solution
HEPESSigmaH4034Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATPSigmaA9187Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTPSigmaG5884Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4SigmaC1426Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsClSigmaC3011Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-ClSigmaT2265Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488VectorSP-11450.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
AgarSigmaA70023% agar block was used in our protocol
ParaformaldehydeSigmaP61484% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4Hengxing Chemical ReagentsUsed for the preparation of PBS
Mount Coverslipping MediumPolyscience18606
UrethanNational Institute for Food and Drug Control301912281.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillariesWorld Precision InstrumentsTW150F-41.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette pullerSutter InstrumentP-97Used for the preparation of micropipettes
VibratomeLeicaVT1000S
Vibration isolation tableTechnical Manufacturing Corporation63544
Infrared CCD cameraDage-MITIR-1000
Patch-clamp amplifierHEKAEPC-10
MicromanipulatorSutter InstrumentMP-285
X-Y stageBurleighGIBRALTAR X-Y
Upright microscopeOlympusBX51WI
OsmometerAdvancedFISKE 210
PH meterMettler ToledoFE20
Confocol microscopeZeissLSM 700

References

  1. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  2. Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
  3. Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
  4. Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
  5. Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
  6. Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
  7. Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
  8. Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
  9. Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
  10. Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
  11. Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
  12. Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
  13. Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
  14. Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
  15. Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
  16. Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
  17. Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
  18. Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
  19. Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
  20. Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
  21. Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
  22. Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
  23. Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
  24. Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
  25. Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
  26. Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
  27. Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
  28. Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
  29. Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
  32. Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
  33. Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
  34. Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
  35. Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved