Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Resumen

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Resumen

Estudios recientes de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) han proporcionado un gran cuerpo de información sobre los mecanismos espinales que transmisión sensorial, regulación nociceptiva y desarrollo crónico de dolor o picazón. Las implementaciones de las grabaciones electrofisiológicas junto con estudios morfológicos basados en la utilidad de rebanadas agudo de la médula espinal han mejorado nuestra comprensión de las propiedades neuronales y la composición de los circuitos locales en SG. Aquí, presentamos a una guía práctica y detallada para la preparación de la médula espinal rebanadas y mostrar representante celulares grabación y resultados morfológicos. Este protocolo permite la preservación neuronal ideal y puede imitar en vivo condiciones hasta cierto punto. En Resumen, la capacidad para obtener una preparación en vitro de segmentos de la médula espinal permite grabaciones estable de fijación de corriente y voltaje y así podría facilitar investigaciones detalladas en las propiedades intrínsecas de la membrana, circuitos locales y estructura neuronal utilizando diferentes aproximaciones experimentales.

Introducción

La sustancia gelatinosa (SG, lámina II del asta dorsal espinal) es un centro de relé sin lugar a dudas importante para la transmisión y regulación de la información sensorial. Se compone de interneurons inhibitorios y excitatorios, que reciben entradas de las fibras aferentes primarias, interneuronas locales y el sistema inhibitorio descendente endógena¹. En las últimas décadas, el desarrollo de la preparación de rebanada aguda de la médula espinal y el advenimiento de la grabación de la abrazadera del remiendo de celulares ha permitido varios estudios sobre las propiedades electrofisiológicas y morfológicas intrínsecas del SG neuronas^{2, 3 , 4} así como los estudios de los circuitos locales en SG^5,6. Además, mediante el uso de la preparación de slice en vitro de la médula espinal, los investigadores pueden interpretar los cambios neuronales excitabilities^7,8, canales de la función de ion^9,10, y actividades sinápticas^11,12 en diversas condiciones patológicas. Estos estudios han profundizado nuestra comprensión del papel que juegan las neuronas de la SG en el desarrollo y mantenimiento del dolor crónico y picor neuropático.

Esencialmente, el requisito clave para lograr una clara visualización del soma neuronal y celulares ideal de remiendo usando rebanadas agudo de la médula espinal es para asegurar la calidad excelente de cortes por lo que pueden obtenerse las neuronas sanas y patchable. Sin embargo, preparando láminas medulares implica varios pasos, como realizar una laminectomía ventral y retirar la membrana de la pia-aracnoides, que puede ser obstáculos en la obtención de rodajas saludables. Aunque no es fácil preparar cortes de médula espinal, realizar grabaciones en vitro en segmentos de la médula espinal tiene varias ventajas. En comparación con las preparaciones de cultivo celulares, cortes de médula espinal pueden conservar parcialmente inherentes conexiones sinápticas que están en un estado fisiológicamente relevante. Además, células completas-abrazadera del remiendo realiza una grabación usando segmentos de la médula espinal podría combinarse con otras técnicas, como parche doble abrazadera^13,14, estudios morfológicos^15,16 y RT-PCR unicelular ¹⁷. por lo tanto, esta técnica proporciona más información sobre caracterización de la diversidad anatómica y genética dentro de una región específica y permite la investigación de la composición de circuitos locales.

Aquí, ofrecemos una descripción básica y de detalle de nuestro método para preparar láminas agudas de la médula espinal y la adquisición de grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la SG.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales descritos fueron aprobados por el Animal ética Comité de Nanchang University (Nanchang, China PR, ética No.2017-010). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el estrés y el dolor de los animales experimentales. Las grabaciones electrofisiológicas realizadas aquí se llevaron a cabo a temperatura ambiente (RT, 22 – 25 ° C).

1. los animales

1. Uso de ratas Sprague-Dawley (3 – 5 semanas) de ambos sexos. Los animales bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h de la casa y darles acceso ad libitum al agua y una alimentación adecuada.

2. preparación de soluciones y materiales

1. Soluciones
   1. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) (en mM): NaCl 117, 3.6 KCl, 1.2 NaH₂PO₄·2H₂O, 2,5 CaCl₂·2H₂O, 1,2 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 11 D-glucosa, ácido ascórbico 0,4 y 2 piruvato de sodio. Vea la tabla 1.
   2. Preparar la ACSF de sacarosa (en mM): 240 sacarosa, 2,5 KCl, 1.25 NaH₂PO₄·2H₂O, 0.5 CaCl₂·2H₂O, 3.5 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 0.4 ácido ascórbico y piruvato de sodio 2. Consulte la tabla 2.
   3. Preparar K⁺-solución intracelular (en mM): 130 K-gluconato, 5 KCl, 10 Na₂-fosfocreatina, EGTA 0,5, 10 HEPES, 4 Mg-ATP y 0.3 Li-GTP. Consulte la tabla 3.
   4. Preparar Cs⁺-solución intracelular (en mM): 92 CsMeSO₄, CsCl 43, 10 Na₂-fosfocreatina, 5 Tetraetilamonio (TEA) - Cl 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP y 0.3 Li-GTP. Véase el cuadro 4.
      Nota: Todas las soluciones deben prepararse con agua destilada. ACSF y sacarosa ACSF deben ser carbogenated (95% O₂ y 5% CO₂ mezcla) antes de su uso para mantener un pH óptimo de aproximadamente 7.4, y la osmolalidad de estas dos soluciones se debe ajustar a 300-310 mOsm. Porque el ácido ascórbico puede afectar los canales de calcio, este agente debe omitirse si uno quisiera grabar las corrientes de calcio. La osmolalidad y el pH de soluciones intracelulares deben ser medidos y ajustados a 290-300 mOsm y 7.2, 7.3, respectivamente. Se recomienda filtrar las soluciones intracelulares con 0,2 μm filtros y almacenar las soluciones como alícuotas de 1 mL a-20 ° C. CS⁺ y té se aplican en Cs⁺-basado en la solución intracelular al bloque del canal de potasio, que es propicio para usar el amplificador para sujetar la membrana potencial constante en 0 mV cuando graba corrientes postsinápticas inhibitorias (IPSCs).
   5. Preparar la solución neurobiotin 488 al 0,05%. Disolver 2 mg de neurobiotin 488 en 4 mL de K⁺-solución intracelular y ajustar la osmolalidad de 290-300 mOsm usando agua destilada o sacarosa, si es necesario.
      Nota: 1 mM de sacarosa aumenta osmolaridad 1 mOsm.
   6. Preparar agar al 3% como un bloque para la médula espinal. Disolver 7,5 g de agar en 250 mL de agua purificada en un vaso de vidrio y luego usar un microondas para calentar hasta que hierva y claro. Agitar la solución y vierta la mezcla en una 17,5 cm x 10,5 cm x 1.8 cm caja de plástico para solidificación luego. Mantener el agar a 4 ° C antes de usarlo.
   7. Preparar 4% paraformaldehido (PFA) para el procesamiento de immunohistochemical. Mezcla 40 g de polvo PFA a ~ 800 mL de calentado (aproximadamente 60 ° C) 1 x solución de PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄). Ajuste lentamente el pH añadiendo gotas de NaOH N 1 hasta PFA polvo se disuelva completamente. Una vez que la solución es clara, ajustar el volumen total a 1 L con PBS 1 x. Vuelva a ajustar el pH a 7.2-7.4, con 1 N HCl cuando sea necesario, luego filtrar la solución PFA 4% y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
      Nota: El PFA es tóxico, por lo que es necesario usar máscaras, guantes y gafas de seguridad. Llevar a cabo el proceso de preparación 4% PDA dentro de una campana ventilada. Polvo PFA puede disolverse completamente en un pH de aproximadamente 9-10.
2. Instrumentos
   1. Para un sistema electrofisiológico típico, usar un microscopio vertical equipado con contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) y un objetivo de inmersión de agua de alta resolución, una cámara de CCD/CMOS, un amplificador de la abrazadera del remiendo, un sostenedor de la micropipeta y instrumental quirúrgico que permite ajuste fino de la posición de la pipeta. Una etapa XY también es necesaria para mover el microscopio.
   2. Montar todo el equipo en una tabla de aislamiento de vibración rodeado por una jaula de Faraday. Conecte a un monitor de vídeo a la cámara de video para observar las neuronas y visualizar las Micropipetas.
3. Micropipetas
   1. Hacer electrodos de grabación de Capillares de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipeta. Los rangos de resistencia típica pipeta de MΩ 3-6 cuando se llena con solución intracelular.
4. Bloque de agar
   1. Preparar un 1,2 x 1,5 cm x bloque de agar de 2.0 cm. Recortar el bloque en las formas que se muestra en la figura 1 como sea necesario.

3. aguda de la médula espinal sector preparación

Nota: Transverso o parasagittal rebanadas de médula espinal se preparan como anteriormente descrito^18,19,20.

1. Antes de transcardial perfusión y extracción de la médula espinal, preparar ~ 500 mL sacarosa-ACSF equilibrado con 95% O₂ y 5% CO₂ y enfríe la solución a la helada (0 – 4 ° C).
2. Enfriar todas las herramientas de disección (p. ej., disección, tijeras, tijeras de iris, pinzas dentadas, pinzas finas, pinzas curvas) sobre el hielo. El diagrama de la preparación del segmento medular aguda se muestra en la figura 1.
3. Transcardial perfusión
   1. Después de una sola inyección de uretano (1,5 g/kg) (intraperitoneal, i.p.), espere de 2 a 3 minutos y evaluar la profundidad de la anestesia de las ratas por la prueba del dedo del pie o cola pizca respuestas. Una vez que se mantiene un plano quirúrgico de anestesia, colocar la rata en hielo picado en la posición supina.
      Nota: Para producir anestesia profunda suficiente para la no percepción del dolor durante la toracotomía, seguir sus pautas locales de IACUC.
   2. Hacer una incisión (3 – 4 cm) a través de la piel del proceso xifoides a la clavícula y luego realizar una incisión transversal debajo del nivel del proceso xifoides.
   3. Sujete y levante el proceso xifoide con un par de pinzas curvas para exponer completamente el diafragma. Hacer una incisión transversal a través del diafragma y luego atravesar el tórax entre el esternón y las costillas bilateralmente para abrir la cavidad torácica. Utilizar el fórceps curvado para comprender el proceso del xiphoid se fija la caja torácica y el corazón está lo suficientemente expuesto.
   4. Mantener el corazón con otro fórceps curvado suavemente y luego insertar una aguja de 22 G a través del ventrículo izquierdo a la base del arco aórtico.
   5. Corte la aurícula derecha con unas tijeras finas inmediatamente y luego iniciar la perfusión de sacarosa-ACSF helada, oxigenada a través de un sistema de gravedad.
      Nota: Transcardial rápido y suficiente perfusión con sacarosa-ACSF helada puede facilitar el rápido enfriamiento de la médula espinal, mientras que la baja concentración de sodio y de calcio puede ayudar a aliviar la toxicidad excitadora y proteger la función neuronal. Además, claro de glóbulos rojos sería beneficioso para la reducción de la tinción de fondo de biocitina al realizar un estudio morfológico. La perfusión se considera suficiente y satisfecho como el líquido que sale de la aurícula derecha es claro y el color del hígado y las patas de la rata es pálido. La punta de la aguja de 22 G debe ser contundente para evitar romper el corazón y el arco aórtico.
4. Disección de la médula espinal y rebanar
   1. Haga una incisión longitudinal (5 cm) en la piel posterior de caudal a rostral, cortan a través de la caja torácica entre la columna vertebral y las costillas a ambos lados en el estado de perfusión.
   2. Hacer un corte en el extremo caudal de la espina dorsal, use tijeras para cortar los tejidos circundantes y aislar rápidamente el segmento lumbosacro de la columna vertebral.
   3. Transferir el segmento lumbosacro en un plato de cristal que contienen helado ACSF basada en sacarosa. Con el lado ventral hacia arriba, utilice tijeras finas cortar el pedículo vertebral bilateral y exponer la médula espinal con cuidado. Aislar una médula espinal larga de 2 cm con ampliación sacrolumbar (L1-S3) y transferir la sección espinal a otro plato de cristal llenado de frío sacarosa-ACSF.
   4. Retire las meninges y la pia-aracnoides membrana debajo de un microscopio de disección. Corte todas las ventrales y dorsales raíces tan pronto como sea posible.
   5. Lugar de la médula espinal en un bloque de agar previamente recortado. Para preparar rodajas transversales, sujete el lado ventral de la médula espinal para el agar y dejar el lado dorsal hacia la hoja. Para preparar rodajas de parasagittal, sujete el lado ventral con superglue para el agar en dirección vertical como se muestra en la figura 1. A continuación, Monte el bloque de agar a una plataforma de un vibratome con superglue. Preparar 300 – 500 μm transversal o parasagittal rebanadas con una velocidad de avance de 0.025 mm/s y una frecuencia de 80 Hz.
   6. Use una pipeta de plástico recortado para transferir las rebanadas en malla de nylon en un compartimiento de almacenamiento que contengan ACSF continuamente oxigenada a 32 ° C por al menos 30 min antes de la grabación.
      Nota: tenga cuidado para evitar lesiones a la médula espinal, especialmente en el cuerno dorsal, al retirar las meninges y las raíces espinales. La médula espinal se debe rebanar dorsal ventral. Para mejores resultados, las láminas deben estar preparadas rápidamente (dentro de 15-20 min). El grosor de un segmento espinal debe ser no más de 600 μm para satisfacer la visibilidad de la célula. Además, la técnica descrita anteriormente podría utilizarse para obtener rodajas horizontales espinales.

4. celulares Patch-clamp grabaciones

1. Para llevar a cabo las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la SG, usar K⁺-basado en la solución intracelular para la mayoría de los casos de grabación, mientras aplica Cs⁺-solución sólo para la grabación de las corrientes postsinápticas inhibitorias.
2. Mueva suavemente un trozo de médula espinal a la sala de grabación y luego mantener con un alambre de platino en forma de U conectados con hilos de nylon firmemente por rebanada óptima estabilidad. Inundar la rebanada con ACSF burbujeado en el RT a través de un sistema de gravedad y ajustar la velocidad de perfusión a 2 – 4 mL/min para lograr la suficiente oxigenación.
3. Identificar la región de SG (una banda translúcida) usando un lente de microscopio de baja resolución, elija una neurona sana con el objetivo de alta resolución como la célula diana y ajustar el centro de la pantalla del monitor de vídeo.
4. Llene una micropipeta con un volumen adecuado de K⁺-basado o Cs⁺-basado en la solución intracelular según sea necesario, introduzca la micropipeta en el soporte del electrodo y asegúrese de que la solución intracelular esté en contacto con el alambre de plata dentro de la titular.
5. Traer la micropipeta en foco y sumergir en la ACSF utilizando un micromanipulador y luego aplicar una leve presión positiva (~ 1 psi cuando se mide con un manómetro) para forzar la micropipeta de toda suciedad y desechos.
6. Mueva la micropipeta hacia la neurona objetivo gradualmente. Lanzamiento de la presión positiva una vez que la pipeta acerca a la neurona y la forma de una concavidad muy pequeña en la membrana neuronal para formar un gigaseal.
7. Alterar la explotación potencial de -70 mV, que es cerca del fisiológico reposo potencial de membrana (RMP) de una célula. Luego, aplica una succión suave y transitoria a la micropipeta para romper la membrana y crear una buena configuración de célula entera.
   Nota: Después de transferir la rebanada en la cámara de grabación, asegúrese de perfusión constante durante al menos 5 minutos limpiar los escombros en la superficie de la rebanada. Cabe señalar que la capacidad de distinguir entre las neuronas sanas y malsanas o muertos es de importancia primordial para el buen lacre y grabación estable. Una neurona muertas o insalubres tiene un aspecto hinchado o contraído, junto con un núcleo grande visible, mientras que una neurona sana se caracteriza por la forma de 3 dimensiones (3D) con una membrana brillante y suave, y su núcleo es invisible. Para lograr una configuración de celulares, es esencial para compensar la rápida o lenta capacidad de paso a paso cuando sea necesario. A temperatura ambiente, se calcula la ensambladura líquida potencial mV 15.1, 15.2 y 4.3-4.4 mV en K⁺-basado y Cs⁺-basado en la solución intracelular, respectivamente. En nuestros estudios, los datos grabados no fueron corregidos para el potencial de Unión líquida.
8. Grabaciones de las propiedades intrínsecas de la membrana
   1. Registrar propiedades pasivas de membrana intrínseca: registro RMP inmediatamente (dentro de 20 s) después. Determinar la resistencia de entrada neuronal mediante la medición de la respuesta de voltaje a una corriente despolarizante (10 pA, 500 ms) en RMP en modo de pinza de corriente.
   2. Registro de propiedades de la leña: Pruebe el patrón de disparo de cada neurona en la abrazadera de la corriente con una serie de 1 s despolarizantes pulsos actuales (25 – 150 pA con incremento de 25 pA) en el RMP. Medir el umbral, la amplitud y el ancho medio de un solo potencial de acción fuera de línea.
   3. Registro actual subliminal: para evaluar las corrientes subliminal somáticas, sostenga la membrana potencial a -50 mV en el modo de pinza de voltaje. Luego, aplicar una serie de hiperpolarizantes pulsos de voltaje de 1 duración de s de -60 mV a -120 mV, con un decremento de 10 mV.
   4. Registrar corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs): registro de EPSCs con K⁺-intracelular solución en modo de pinza de voltaje en un potencial de explotación de -70 mV.
   5. Registro IPSCs: Aplicar Cs⁺-solución intracelular para la grabación de IPSCs. Una vez establecida la configuración de célula entera, sostener la membrana potencial en -70 mV ~ 5 min, y luego cambio la explotación potencial de 0 mV gradualmente. Espere unos minutos para la estabilización y luego empezar a registrar los eventos IPSC.
      Nota: Sólo las neuronas con una RMP de menos de-50 mV y mostrando overshoot deben seleccionarse para un estudio más profundo. Las resistencias de la serie en nuestro estudio son típicamente 10-30 MΩ, y una grabación debe ser excluida una vez que la resistencia cambia en más del 20%. EPSCs podían ser confirmados con una aplicación de baño de APV de 50 μm y 20 μm CNQX, mientras IPSCs podrían confirmarse con 10 μm bicuculina y estricnina de 1 μm.

5. morfológico estudio

1. Para los experimentos morfológicos, uso un K⁺-basado en la solución intracelular que contiene 0,05% neurobiotin 488.
2. Después de mantener una estable por al menos 20 min de grabación electrofisiológica, Retire lentamente la micropipeta en la dirección hacia arriba para permitir que la membrana de la célula sellar y transferir el segmento de la médula espinal a un recipiente llenado con 4% PFA. Arreglar las rodajas en 4% PFA a temperatura ambiente durante 1 hora y luego a 4° C durante la noche.
3. Enjuagar las rodajas en PBS y luego sumergirlos en etanol al 50% durante 30 minutos. Después de otro tres lavados en PBS, Monte las rebanadas en su espesor original en diapositivas con un medio de montaje.
4. Utilizar un microscopio confocal (véase Tabla de materiales) para la adquisición de imágenes y reconstrucción 3D neuronal. Analizar las neuronas a través de un lente X 20 con una z-pila de 1.5 μm.

Resultados

Medular aguda rebanadas se prepararon según el esquema mostrado en la figura 1. Después de rebanar y de recuperación, un trozo de médula espinal fue trasladado a la sala de grabación. Se identificaron las neuronas saludables basados en el aspecto de soma usando microscopia de IR-DIC. A continuación, los potenciales de acción de las neuronas de la SG fueron sacados por una serie de despolarización actuales pulsos (1 s de duración) cuando las neuronas ...

Discusión

Este protocolo detalla los pasos para la preparación de rodajas de la médula espinal, que hemos utilizado con éxito cuando se realizan experimentos celulares patch-clamp SG neuronas^18,19,20,21. Mediante la aplicación de este método, nos informó recientemente que la minociclina, una segunda generación de la tetraciclina, marcado podría aumentar la transmisión sináptica inhibitoria a tr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S7653	Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl	Sigma	60130	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O	Sigma	71500	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3	Sigma	S5761	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose	Sigma	G7021	Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid	Sigma	P5280	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate	Sigma	A7631	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose	Sigma	S7903	Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate	Wako	169-11835	Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine	Sigma	P1937	Used for the preparation of intracellular solution
EGTA	Sigma	E3889	Used for the preparation of intracellular solution
HEPES	Sigma	H4034	Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187	Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP	Sigma	G5884	Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4	Sigma	C1426	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl	Sigma	C3011	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl	Sigma	T2265	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488	Vector	SP-1145	0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar	Sigma	A7002	3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4	Hengxing Chemical Reagents		Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium	Polyscience	18606
Urethan	National Institute for Food and Drug Control	30191228	1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	TW150F-4	1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Used for the preparation of micropipettes
Vibratome	Leica	VT1000S
Vibration isolation table	Technical Manufacturing Corporation	63544
Infrared CCD camera	Dage-MIT	IR-1000
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285
X-Y stage	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Osmometer	Advanced	FISKE 210
PH meter	Mettler Toledo	FE20
Confocol microscope	Zeiss	LSM 700