급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

요약

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

초록

신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.

서문

Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템¹에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런^2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 ^{3 , 4} 뿐만 아니라 SG^5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities^7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능^9,10, 채널 및 시 냅 스 활동^11,12 다양 한 병 적인 조건 하에서. 이러한 연구 개발에 재생 SG 신경 역할에 대 한 우리의 이해 및 만성 통증과 neuropathic 가려움증의 유지 보수 깊 어 있다.

기본적으로, 이상적인 전체 셀 패치 급성 척수 조각을 사용 하 여 신경 소마의 명확한 시각화를 달성 하기 위해 핵심 필수 건강 하 고 패치되지 뉴런 얻어질 수 있다 조각의 우수한 품질을 보장 하기 위해입니다. 그러나, 척수 조각 준비 복 부 laminectomy 수행 하 고 건강 한 조각을 얻기에 장애물이 될 수 피아-거미 집 모양의 막 제거 등의 여러 단계가 포함 됩니다. 그것은 척수 조각 준비 하기 쉬운, 척수 조각에 녹음에서 시험관에서 수행는 여러 가지 장점이 있습니다. 셀 문화 준비에 비해, 척수 조각 순수 관련 조건에는 고유한 시 냅 스 연결을 부분적으로 보존할 수 있습니다. 또한, 전체 셀 패치 클램프 척수 조각을 사용 하 여 녹음 더블 패치 클램프^13,14, 형태학 연구^15,16 단일 셀 RT-PCR 등의 다른 방법을 결합 될 수 있는 ¹⁷. 따라서,이 특정 지역 내에서 해 부와 유전 다양성을 특성화에 더 많은 정보를 제공 합니다 기술과 지역 회로의 구성의 조사에 대 한 수 있습니다.

여기, 우리는 급성 척수 조각을 준비 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 SG 뉴런에서 인수에 대 한 우리의 방법의 기본과 상세한 설명을 제공 합니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜 설명 동물 윤리 위원회의 남 창 대학 (난창, 홍보 중국, 윤리적인 No.2017-010)에 의해 승인 되었다. 모든 노력이 스트레스와 실험 동물의 고통을 최소화 하기 위해 만들어졌다. 여기 수행 electrophysiological 녹음 실 온 (RT, 22-25 ° C)에서 실행 되었다.

1입니다. 동물

1. 어느 섹스의 Sprague-Dawley 쥐 (3-5 주 이전)을 사용 합니다. 12 h 빛 어두운 주기에서 동물을 집 고 그들에 게 충분 한 음식 및 물 광고 libitum 액세스.

2입니다. 솔루션 및 자료 준비

1. 솔루션
   1. 준비 하는 인공 뇌 척추 액체 (실제) (mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH₂포₄·2H₂O, 2.5 CaCl₂·2H₂O, 1.2 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 11 D-포도 당, 0.4 ascorbic 산 및 2 나트륨 pyruvate입니다. 표 1을 참조 하십시오.
   2. 자당-실제 (mM)에서 준비: 240 자당, 2.5 KCl, 1.25 NaH₂포₄·2H₂O, 0.5 CaCl₂·2H₂O, 3.5 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 0.4 Ascorbic 산 그리고 2 나트륨 pyruvate. 표 2를 참조 하십시오.
   3. K⁺준비-기반 (mM)에 세포내 솔루션: 130 K-구 루 콘, 5 KCl, 10 나₂-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 그리고 0.3 Li-GTP. 표 3을 참조 하십시오.
   4. Cs⁺준비-기반 (mM)에 세포내 솔루션: 92 CsMeSO₄, 43 CsCl, 10 나₂-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (차)-Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 그리고 0.3 Li-GTP. 표 4를 참조 하십시오.
      참고: 모든 솔루션이 준비 되어야 한다 증류수를 사용 하 여. 실제 및 자당 실제 약 7.4의 최적의 pH를 유지 하기 위해 사용 하기 전에 carbogenated (95% O₂ , 5% CO₂ 혼합물) 이어야 하며이 두 솔루션의 osmolality 300-310 mOsm을 조정 한다. 아 스 코르 빈 산 칼슘 채널에 영향을 미칠 수, 때문에이 에이전트 하나 칼슘 전류를 기록 하려는 경우 생략 해야 합니다. Osmolality 및 세포내 솔루션의 pH 측정와 각각 290-300 mOsm을 7.2-7.3 조정 있어야 합니다. 세포내 솔루션 0.2 µ m 필터 필터링-20 ° c.에 1 mL aliquots로 솔루션을 저장 하는 것이 좋습니다. Cs⁺ 및 차 Cs⁺에 적용 됩니다-기반 블록 칼륨 채널 사용 하 여 앰프는 막 잠재력에 도움이 되는 세포내 솔루션 0에서 꾸준한 mV 금지 postsynaptic 전류 (Ipsc)를 기록할 때.
   5. 0.05% neurobiotin 488 솔루션을 준비 합니다. K⁺의 neurobiotin 488에서 4 mL의 2 밀리 그램을 분해-세포내 솔루션을 기반으로 하 고 필요한 경우 증류수 또는 자당을 사용 하 여 290-300 mOsm osmolality 조정.
      참고: 자당의 1 m m 1 mOsm osmolarity를 증가합니다.
   6. 척수에 대 한 블록으로 3 %agar 준비 합니다. 순화 된 물 유리 비 커에서 250 mL에 한 천의 7.5 g을 녹이 고 하 고 끓는 때까지 열 전자 레인지를 사용 하 여. 솔루션의 소용돌이는 17.5 c m x 10.5 c m x 1.8 cm 플라스틱 상자 응고 후에 혼합물을 부 어. 4 ° C에서는 한 계속 사용 하기 전에.
   7. Immunohistochemical 처리에 대 한 4 %paraformaldehyde (PFA)를 준비 합니다. ~ 800 ml의 PFA 가루 믹스 40 g (약 60 ° C)가 열 PBS 솔루션 (130 m m NaCl, 7 m m 나₂HPO₄, 3mm NaH₂포₄) x 1. 천천히 PFA 분말 완전히 해산 될 때까지 1 N NaOH 방울을 추가 하 여 pH를 조정 합니다. 솔루션 취소 되고있다, 일단 1 x PBS 가진 1 l 총 볼륨을 조정 합니다. PH 7.2-7.4 1 N HCl 필요할 때, 그리고 4 %PFA 솔루션 필터링 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장을 사용 하 여를 재조정합니다
      참고: PFA 이므로 독성, 마스크, 장갑 뿐만 아니라 안전 안경을 착용 하는 데 필요한. 4%를 준비 하는 과정을 수행 PFA 통풍된 후드 내부. PFA 분말 약 9-10의 pH에 완전히 해산 될 수 있다.
2. 악기
   1. 전형적인 electrophysiological 시스템 사용 적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC)와 고해상도 물 침수 목표, CCD/CMOS 카메라, 패치 클램프 증폭기, micropipette 홀더 장착 된 수직 현미경 및 micromanipulator 피펫은 위치의 미세 조정 허용입니다. XY 스테이지 또한 현미경을 이동 하려면 필요 합니다.
   2. 패러데이 케이지로 둘러싸인 진동 절연 테이블에 모든 장비를 탑재 합니다. 신경 세포를 관찰 하 고 시각화는 micropipettes를 비디오 카메라에 비디오 모니터를 연결 합니다.
3. Micropipettes
   1. 기록 전극 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여 붕 규 산 유리 모 세관에서 확인 합니다. 3-6 m ω 세포내 솔루션으로 채워질 때 전형적인 피 펫 저항 범위.
4. 한 블록
   1. 1.2 cm x 1.5 cm x 2.0 c m 한 블록을 준비 합니다. 필요에 따라 그림 1 에 표시 된 모양으로 블록을 잘라.

3. 급성 척수 슬라이스 준비

참고: 가로 또는 parasagittal 척수 조각 준비 이전 설명된^18,,1920.

1. Transcardial 관류 및 척수 추출, 이전 ~ 500 mL 자당-실제 equilibrated 95% O₂ , 5% CO₂ 를 준비 하 고 얼음을 솔루션을 냉각 (0 ~ 4 ° C).
2. 모든 해 부 도구 (예를 들어, 가 위, 아이리스가 위, 이빨된 집게, 집게를 잘, 곡선된 겸 자 해 부) 얼음에 식혀. 급성 척수 조각 준비의 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다.
3. Transcardial 관류
   1. 우 레 탄 (1.5 g/kg)의 단일 주사 (복, i.p.), 후 2-3 분을 기다려야 하 고 발가락이 나 꼬리 핀치 응답을 테스트 하 여 쥐의 마 취 깊이 평가. 일단 마 취의 수술 평면 유지 부정사 위치에 얼음에 쥐를 놓습니다.
      주: thoracotomy 동안 깊은 마 취 통증의 지 각에 대 한 충분 한 생산, 현지 IACUC 지침을 따릅니다.
   2. 쇄 골, 칼 과정에서 피부를 통해 (3-4 cm) 절 개를 확인 하 고 칼 절차의 수준 아래 가로 절 개를 하 게.
   3. 파악 하 고 횡 경 막 완전히 노출 곡선된 집게의 쌍 칼 프로세스를 인상. 통해 횡 경 막, 횡 절 개를 만들고 가슴뼈와 갈비뼈 양측 흉 여 사이 흉 곽을 극복. 굽은 집게를 사용 하 여 흉 곽을 고정 하 고 심장 충분히 노출 칼 프로세스를 파악.
   4. 부드럽게, 다른 곡선된 겸 자 마음 잡고 하 고 좌 심 실 대동맥 아치의 자료를 통해 22 G 바늘을 삽입 합니다.
   5. 즉시, 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 잘라 고 얼음 처럼 차가운, 산소 자당-실제 중력 시스템을 통해 관류를 시작 합니다.
      참고: 차가운 자당-실제와 신속 하 고 충분 한 transcardial 관류 낮은 나트륨 및 칼슘 농도 흥분 성의 독성을 완화 하 고 신경 기능을 보호 하기 위해 도움이 될 수 있지만, 척수의 급속 한 냉각 촉진 수 있습니다. 또한, 붉은 혈액 세포를 지우기 형태학 연구를 수행할 때 biocytin의 배경 얼룩을 줄이기 위한 도움이 될 것 이다. 관류 액체 종료 오른쪽 아 트리 움은 분명 하 고 쥐의 간, 발 색은 창백 충분 하 고 만족을 간주 됩니다. 22 G 바늘의 끝 무딘 심장 및 대동맥 아치 파열 방지 해야 합니다.
4. 척수의 해 부 및 슬라이스
   1. 뒤에서 피부 꼬리 rostral, 관류의 상태에서 어느 한쪽에 척추와 갈비뼈 사이 흉 곽을 통해 다음 컷에 세로 절 개 (5 cm)를 확인 합니다.
   2. 척추의 꼬리 끝에 컷을 확인 하 고가 위를 사용 하 여 주변 조직, 버려야 빠르게 lumbosacral 세그먼트는 척추의 분리.
   3. 얼음 처럼 차가운 자당 기반 실제를 포함 하는 유리 접시에 lumbosacral 세그먼트를 전송 합니다. 위쪽 복 부 쪽으로 좋은 위를 사용 하 여 양측 척추 작은 꽃 자루를 극복 하 고 척수를 신중 하 게 노출. 2 cm 긴 척추 코드 lumbosacral 확대 (L1-S3)를 분리 하 고 다른 유리 접시 가득 찬 자당-실제 척추 섹션을 전송.
   4. Meninges과 해 현미경 피아-거미 집 모양의 막 제거 합니다. 최대한 빨리 멀리 모든 복 부와 지 뿌리를 잘라.
   5. 이전 트림된 한 블록에 척수를 놓습니다. 가로 분할 영역을 준비 하는 agar를 척수의 복 부 측을 첨부 하 고 잎으로 등 쪽을 보자. 그림 1에서 보듯이 parasagittal 슬라이스를 준비 하려면 수직 방향으로 한 천 하 superglue와 복 부 측을 연결 합니다. 그런 다음 superglue와 vibratome의 플랫폼으로 한 블록을 탑재 합니다. 가로 300-500 µ m 또는 0.025 m m/s와 80 Hz의 진동 주파수의 사전 속도와 parasagittal 슬라이스를 준비 합니다.
   6. 플라스틱 트림 피 펫을 사용 하 여 지속적으로 산소 실제 녹음 전에 적어도 30 분 동안 32 ° C에를 포함 하는 저장 챔버에 나일론 메쉬에 슬라이스를 전송.
      참고: meninges 척추 뿌리를 제거 하는 때 척수, 특히 등 쪽 뿔에 부상을 피하기 위해 주의. 척수 등 ventrally 슬라이스 한다. 최상의 결과 얻으려면 빠르게 (15-20 분) 내에서 슬라이스를 준비 한다. 척추 슬라이스의 두께 셀 가시성을 충족 하기 위해 더 이상 600 µ m 이어야 한다. 또한, 위에서 설명한 기술은 수평 척수 조각 얻을 사용 될 수 있습니다.

4. 전체 셀 패치 클램프 기록

1. SG 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹화를 수행 하려면 K⁺-Cs⁺를 적용 하는 동안 대부분의 녹음 경우 세포내 솔루션을 기반으로-금지 postsynaptic 현재 녹음에만 솔루션을 기반으로.
2. 부드럽게 척수 조각 녹음 실로 이동한 다음 U 자 모양의 백 금 철사와 함께 나일론 스레드 단단히 최적의 슬라이스 안정성에 대 한 연결을 유지 합니다. 꾸준히 중력 시스템을 통해 실시간에 버블링 된 실제와 슬라이스를 perfuse 하 고 충분 한 산소를 달성 하기 위해 2-4 mL/min에서 관류 속도 설정 합니다.
3. 저해상도 현미경 렌즈를 사용 하 여 SG (반투명 밴드)의 영역을 식별, 건강 한 신경 목표 셀으로 고해상도 목표를 사용 하 여 선택한 비디오 모니터 스크린의 센터에 그것을 조정 합니다.
4. K⁺의 적절 한 볼륨을 채워는 micropipette-기반 또는 Cs⁺-는 micropipette 전극 홀더에 삽입 고 세포내 솔루션 안에 실버 와이어 연락은 필요에 따라 세포내 솔루션을 기반으로 합니다 홀더입니다.
5. 초점으로는 micropipette가지고 micromanipulator를 사용 하 여 실제에 몰입할 고 온화한 긍정적인 압력 (~ 1 psi는 압력 게이지로 측정 하는 때) 적용 모든 먼지와 파편 micropipette 강제로.
6. 타겟된 신경 쪽으로 micropipette 점차적으로 이동 합니다. 피펫으로 신경 및 아주 작은 보조 개 형태는 gigaseal를 형성 하기 위하여 신경 막에 접근 하는 일단 긍정적인 압력을 릴리스 합니다.
7. 지주-70에 잠재적인 변경 mV, 가까이 생리 적인 휴식 막 잠재적인 (RMP) 셀의. 다음, 과도 하 고 부드러운 흡입 막 파열을 만들 좋은 전체 셀 구성 micropipette 적용 됩니다.
   참고: 녹음 실에는 슬라이스를 전송 후 적어도 5 분 조각 표면에 파편을 취소에 대 한 지속적인 관류를 확인 하십시오. 그것은 건강 하 고 건강에 해로운/죽은 신경 세포 사이 구별 하는 능력 좋은 씰링 및 안정적인 기록을 위한 최고 중요성의 지적 가치가 있다. 건강에 해로운/죽은 신경은 보이는 큰 핵 함께 부 또는 긴축 외관, 밝고 부드러운 막으로 3 차원 (3D) 모양 특징 이다 건강 한 신경 및 그것의 핵 표시 되지 않습니다. 전체 셀 구성 달성 하기 위해 필요할 때 단계별 빠르거나 느린 커패시턴스에 대 한 보상을 필수적 이다. RT에 잠재적인 액체 접합은 계산 15.1-15.2 mV 및 k⁺4.3-4.4 mV-기반 및 Cs⁺-각각 세포내 솔루션을 기반으로. 우리의 연구에 기록 된 데이터 하지 액체 접합 잠재력에 대 한 수정 했다.
8. 본질적인 막 속성의 녹음
   1. 수동 내장 막 속성 기록: 기록 RMP을 즉시 (20 내 s)에서 휴식 후. 전류 클램프 모드에서 RMP에 전압에 대 한 응답 depolarizing 현재 (10 pA, 500 밀리초)를 측정 하 여 신경 입력된 저항을 결정 합니다.
   2. 기록 속성을 발사: 1의 시리즈와 전류 클램프에 각 뉴런의 발사 패턴을 테스트 전류 펄스 (25 pA 증가와 25-150 pA) RMP에 depolarizing s. 임계값, 진폭 및 오프 라인으로 단일 활동 전위의 반-폭 측정 합니다.
   3. Subthreshold 전류 기록: 체세포 subthreshold 전류를 평가 하는 막 잠재적인에서 개최-50 mV 전압 클램프 모드에서. 그런 다음 hyperpolarizing-60에서 1 s의 전압 펄스의 시리즈를 적용 mV-120 ~ mV, mV 10 감소.
   4. 흥분 성의 postsynaptic 전류 (EPSCs) 기록: 기록 EPSCs k⁺-기반으로-70의 지주 잠재력에 전압 클램프 모드에서 세포내 솔루션 mV.
   5. 레코드 Ipsc: Cs⁺적용-Ipsc를 기록 하기 위한 세포내 솔루션을 기반으로. 전체 셀 구성 설정 되 면 막 잠재적인에서 개최-70 mV ~ 5 분, 및 다음 변경 0으로 잠재적인 지주에 대 한 mV 점차적으로. 안정화를 위한 몇 분 그리고 IPSC 이벤트 기록 시작 합니다.
      참고:-50 mV 및 표시 오버 슛 보다는 적게는 RMP만 신경 더 학문을 위해 선택 되어야 합니다. 우리의 연구에서 시리즈 저항은 일반적으로 10-30 m ω, 그리고 직렬 저항을 20% 이상 변경 되 면 녹음을 제외 해야 합니다. EPSCs 50 µ M APV의 목욕 응용 프로그램으로 확인 될 수 있는 20 µ m CNQX, Ipsc 10 µ M bicuculline와 1 µ M strychnine 확인 될 수 있는 하는 동안.

5. 형태학 연구

1. 형태학 실험에 대 한 사용 K⁺-0.05% neurobiotin 488을 포함 하는 세포내 솔루션을 기반으로.
2. 안정적인 electrophysiological 적어도 20 분에 대 한 기록 유지 후 천천히 봉인 및 컨테이너 4%로 가득 척수 조각 전송 세포 막 수 있도록 위쪽 방향으로 micropipette를 제거 PFA. 수정 조각 4 %PFA 하룻밤에 4 ° C에서 그리고 1 시간에 대 한 실시간에.
3. PBS에서 슬라이스를 헹 구 고 30 분 50% 에탄올에 그들을 담가. PBS에서 또 다른 3 개의 세척, 후 슬라이드 장착 매체에 그들의 원래 두께에 슬라이스를 탑재.
4. Confocal 현미경을 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 이미지 수집 및 신경 3D 재구성. 1.5 µ m의 z-스택 20 X 렌즈를 통해 신경 세포를 검사 합니다.

결과

급성 척수 조각 그림 1에 표시 된 다이어그램에 따라 준비 되었다. 조각화 및 복구, 후 척수 조각 녹음 실로 옮겨 졌다. 건강 한 신경 소마 모양 IR DIC 현미경을 사용 하 여에 따라 확인 되었다. 다음, SG 뉴런의 활동 전위 전류 펄스 (1 s 기간) depolarizing의 시리즈에 의해 elicited 했다 신경 RMP에서 열렸다. 보이는 것 처럼 그림 2설명 되...

토론

이 프로토콜 세부 SG 뉴런^18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런¹⁹에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S7653	Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl	Sigma	60130	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O	Sigma	71500	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3	Sigma	S5761	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose	Sigma	G7021	Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid	Sigma	P5280	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate	Sigma	A7631	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose	Sigma	S7903	Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate	Wako	169-11835	Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine	Sigma	P1937	Used for the preparation of intracellular solution
EGTA	Sigma	E3889	Used for the preparation of intracellular solution
HEPES	Sigma	H4034	Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187	Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP	Sigma	G5884	Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4	Sigma	C1426	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl	Sigma	C3011	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl	Sigma	T2265	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488	Vector	SP-1145	0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar	Sigma	A7002	3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4	Hengxing Chemical Reagents		Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium	Polyscience	18606
Urethan	National Institute for Food and Drug Control	30191228	1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	TW150F-4	1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Used for the preparation of micropipettes
Vibratome	Leica	VT1000S
Vibration isolation table	Technical Manufacturing Corporation	63544
Infrared CCD camera	Dage-MIT	IR-1000
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285
X-Y stage	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Osmometer	Advanced	FISKE 210
PH meter	Mettler Toledo	FE20
Confocol microscope	Zeiss	LSM 700