膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

要約

ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG ニューロンの形態的特性をことができます。

要約

膠 (SG) ニューロンからの最近の全細胞パッチク ランプ-研究は、膨大な感覚伝達、侵害受容規制と慢性的な痛みやかゆみの開発の基礎となる脊髄のメカニズムについての情報を提供しています。急性脊髄スライスの効用に基づく形態学的研究と電気生理学的記録の実装は、神経膜特性の理解と SG の局所回路の構成にさらに改善しています。脊髄スライスとショー代表全細胞記録の形態の調製のための詳しく、実用的なガイドを紹介します。このプロトコルは、理想的な神経の保存を許可し、生体内である程度条件を模倣することができます。要約すると、脊髄スライス培養準備を取得できる安定した電流、電圧クランプ録音を有効にしたがって局所神経回路の組み込み膜プロパティに詳細な調査を促進する可能性があり、様々 な実験的アプローチによる神経の構造。

概要

膠 (SG、ラミナの脊髄後角 II) は送信および感覚情報を規制する議論の余地なく重要な中継センターです。一次求心性線維、ローカル介在ニューロンと内因性下行抑制系¹から入力を受ける興奮性と抑制性の介在ニューロン、それで構成されます。最近十年間の急性脊髄スライス標本の開発と全細胞パッチク ランプ記録の出現 SG ニューロン^2,の本質的な電気生理学的および形態学的特性の様々 な研究が可能にします。^3,SG^5,6の局所神経回路の研究と同様、 ⁴ 。また、体外脊髄スライス標本を使用して、研究者は、神経 excitabilities^7,8の変化を解釈できる、^9,10チャンネルはイオンの機能と各種病態下でシナプス活動^11,12 。これらの研究は深めた SG ニューロンが開発に果たす役割の理解や慢性的な痛みや神経因性のかゆみのメンテナンスです。

基本的に、神経相馬や急性脊髄スライスを使用して理想的な全細胞パッチ適用の明確に可視化を達成するために重要な前提条件は、健康とパッチ適用可能な細胞を得ることができるので、スライスの優れた品質を確保するためです。しかし、脊髄スライスの準備と、腹側椎弓切除術を実行する、健康的なスライスの取得の障害となるクモ膜膜の削除など、いくつかの手順が含まれます。脊髄スライスを準備するは簡単じゃないがいくつかの利点があります脊髄スライス上の in vitro録音を実行します。細胞培養の準備と比較して、脊髄スライス部分的に関連する生理学的条件は、固有のシナプス接続を保持できます。さらに、脊髄スライスを使用して録音全細胞パッチクは二重パッチ クランプ^13,14、形態学的研究^15,16シングルセル RT-PCR 法などの他の手法と組み合わせることができます。¹⁷します。 したがって、この手法は、特定地域内で解剖学的および遺伝的多様性の特性に関する詳細と局所神経回路の構成の調査では。

ここでは、急性脊髄スライスの準備及び SG ニューロンから全体セル ホールセル記録手法の基本と詳細な説明を提供します。

プロトコル

説明すべての実験のプロトコルは、動物倫理委員会の南昌大学 (南昌、PR 中国、倫理 No.2017-010) によって承認されました。すべての努力は、実験動物の苦痛やストレスを最小限に抑えるため行われました。ここで実行される電気生理学的記録は、常温 (RT、22-25 ° C) を実施しました。

1. 動物

1. どちらの性別の Sprague-dawley ラット (3-5 週齢) を使用します。12 時間の明暗周期下動物の家し、十分な食糧や水に自由にアクセスします。

2. ソリューションおよび材料の準備

1. ソリューション
   1. (MM) における人工髄液 (アプライド) を準備: 3.6 117 塩化ナトリウム、KCl、1.2 NaH₂PO₄·2H₂O、2.5 CaCl₂·2H₂O、1.2 MgCl₂·6H₂O、25 NaHCO₃、11 D グルコース、0.4 アスコルビン酸 2ピルビン酸ナトリウム。表 1を参照してください。
   2. (MM) のショ糖アプライドの準備: 240 ショ糖、2.5 KCl、1.25 NaH₂PO₄·2H₂O、0.5 CaCl₂·2H₂O、3.5 MgCl₂·6H₂O、25 NaHCO₃、0.4 のアスコルビン酸、ピルビン酸 2 ナトリウム。表 2を参照してください。
   3. K⁺を準備-ベース (mM) の細胞内のソリューション: グルコン酸 K 130-5 KCl、10 Na₂-0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、10 HEPES はクレアチンリン酸 4 Mg ATP と 0.3 李 GTP。表 3を参照してください。
   4. Cs⁺を準備-ベース (mM) の細胞内のソリューション: 92 CsMeSO₄、43 CsCl 10 Na₂-クレアチンリン酸、5 テトラエチル アンモニウム (茶) - Cl、0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、10 HEPES、4 Mg - ATP と 0.3 李 GTP。表 4を参照してください。
      注: すべてのソリューションは、蒸留水を使用して準備する必要があります。アプライドとショ糖アプライド約 7.4 の最適な pH を維持するために使用する前に carbogenated (95% O₂と 5% CO₂の混合物) をする必要があります、これらの 2 つの溶液の浸透圧は 300-310 mOsm に調整必要があります。アスコルビン酸は、カルシウム チャネルに影響を与えることができるので 1 つはカルシウム電流を記録したい場合このエージェントを省略する必要があります。浸透圧と細胞内の溶液の pH を測定し、それぞれ 290 – 300 mOsm と 7.2-7.3 に調整ください。0.2 μ m フィルターで細胞内のソリューションをフィルター処理し、-20 ° C で 1 mL 因数としてソリューションを格納お勧めCs⁺と紅茶の Cs⁺適用-ベースのアンプを使用して潜在的な膜を保持するために助長されているブロック カリウム チャネルに細胞内ソリューション 0 で安定した mV 抑制性シナプス電流 (Ips) を記録するとき。
   5. 0.05% neurobiotin 488 ソリューションを準備します。K⁺の neurobiotin 4 で 488 mL の 2 mg を溶解-ベースの細胞内のソリューションと、蒸留水またはサッカロースを使用して必要な場合、290 – 300 mOsm に浸透圧を調整します。
      メモ: ショ糖の 1 mM は 1 mOsm で浸透圧を増加します。
   6. ブロックとして脊髄の 3% 寒天培地を準備します。ガラス ビーカーに精製水 250 mL の寒天の 7.5 g を溶解し、沸騰するまで加熱し、オフに電子レンジを使用します。ソリューションを旋回、17.5 cm × 10.5 cm × 1.8 cm 凝固後のプラスチックの箱に混合物を注ぐ。使用前に 4 ° C で寒天をしてください。
   7. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を免疫組織化学的処理に備えます。ミックス 40 g 〜 800 mL に PFA 粉体の加熱 (約 60 ° C) PBS ソリューション (130 mM NaCl、Na₂HPO₄、7 mM 3 mM NaH₂PO₄) x 1。ゆっくりと PFA パウダーが完全に溶けるまで 1 N 水酸化ナトリウム滴を追加することで、pH を調整します。解決策は明らかになった、一度 1x PBS で 1 L に容量を調整します。7.2-7.4 1 N の hcl 4 %pfa ソリューションをフィルター処理し、使用するまで-20 ° C で保管して、必要なときに pH を調整してください。
      注: PFA は有毒、マスク、手袋、保護メガネを着用する必要があるのでです。4% を準備するプロセスを行う換気フード内部 PFA。粉体 PFA は、pH 約 9-10 で完全に溶解することができます。
2. 楽器
   1. 典型的な電気生理学的システム、赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) と高解像度水の液浸対物レンズ、CCD/CMOS カメラ、パッチ ・ クランプ アンプ、ピペット ホルダーを搭載した直立した顕微鏡を使用し、マニピュレーター ピペット位置の細かい調整が可能です。XY ステージも顕微鏡を移動する必要です。
   2. ファラデーケージに囲まれた振動アイソレーション テーブル上のすべての機器をマウントします。神経細胞を観察し、マイクロ ピペットを視覚化するビデオカメラにビデオ モニターを接続します。
3. マイクロ ピペット
   1. ホウケイ酸ガラス管をマイクロ ピペットの引き手を使用してから記録電極を作る。典型的なピペット抵抗の範囲は、3-6 MΩ ときに細胞内液でいっぱいです。
4. 寒天ブロック
   1. 1.2 cm × 1.5 cm × 2.0 cm 寒天ブロックを準備します。必要に応じて、図 1に示す形にブロックをトリムします。

3. 急性脊髄スライス標本

注: 横断または傍脊髄スライス説明^18,19,20以前として調理されます。

1. Transcardial 血流と脊髄抽出前、~ 500 mL スクロース-アプライド 95% O₂と 5% CO₂平衡を準備し、クール冷たいへの解決策 (0-4 ° C)。
2. 氷の上のすべての郭清のツールは (例えばはさみ、アイリスはさみ、歯の鉗子、微細鉗子、カーブタイプ鉗子を解剖) を冷やします。急性脊髄スライスの準備の図を図 1に示します。
3. Transcardial 血流
   1. ウレタン (1.5 g/kg) の単一の注入 (腹腔内、i. p.) 後、2-3 分待つし、つま先や尾のピンチの応答をテストすることによってラットの麻酔深度を評価します。麻酔外科平面を維持すると、一度は、仰臥位で砕いた氷にラットを配置します。
      注: 開胸の中に深い麻酔痛み感十分の生産、あなたのローカル IACUC のガイドラインに従ってください。
   2. 鎖骨、剣状突起から皮膚を切開 (3-4 cm) を確認し、剣状突起の下に横切開を行います。
   3. 把握し、横隔膜を完全に公開するカーブタイプ鉗子のペアで剣状突起を発生させます。通しダイアフラム、横切開し、胸骨と肋骨胸の空洞を開くには二国間の間胸部を切り取ります。胸郭を固定すると、心臓は十分に公開されているので、剣状突起を把握するのにカーブタイプ鉗子を使用します。
   4. 別のカーブタイプ鉗子で優しく、心を保持し、大動脈弓のベースに左心室を通して 22 G 針を挿入します。
   5. すぐに高級ハサミで右房をカットし、冷たい、酸素ショ糖アプライド重力システムを介しての灌流を開始します。
      注: 冷たいショ糖アプライドで迅速かつ十分な transcardial 血流低ナトリウムとカルシウム濃度が興奮性毒性を緩和し、神経機能を守るために役立つかもしれないが、脊髄の急速な冷却を促進できます。さらに、赤色の血液細胞をクリア形態学的研究を実行するときに、背景の染色 biocytin の削減のために有益でしょう。灌流は右心房を出る流体はラットの肝臓と足の色が淡い、明確な限り十分なと満足するいると見なされます。22 G 針の先端は心臓や大動脈の破裂を避けるために鈍である必要があります。
4. 脊髄の解剖とスライス
   1. 灌流の状態で両側胸部の背骨と肋骨の間を切って、吻側に尾から背中肌に縦切開 (5 cm) を確認します。
   2. 背骨の尾側端でカットをする、はさみを使用して、周囲の組織を切り取る、脊椎の腰仙部セグメントを急速に分離します。
   3. 腰仙部のセグメントを冷たいショ糖ベース アプライドを含んでいるガラス皿に転送します。腹側を上向き、左右相称椎骨の椎弓根を切って、脊髄を慎重に公開する高級はさみを使用します。2 cm 長い脊髄腰仙部拡大 (L1-S3) とを分離し、脊髄のセクションを満ちている冷たいショ糖アプライド別ガラス皿に転送します。
   4. 髄膜と解剖顕微鏡の下でクモ膜膜を削除します。できるだけ早く離れてすべての腹と背根をカットします。
   5. 以前トリミング寒天ブロックに脊髄を配置します。横スライスを準備するには、脊髄の腹側を付ける、寒天、ブレードに向かう背側します。傍矢状洞スライスを準備、図 1に示すように、瞬間接着剤で腹側を垂直方向の寒天に取り付けます。その後、瞬間接着剤と vibratome のプラットフォームに寒天のブロックをマウントします。300-500 μ m の横または 0.025 mm/s と 80 Hz の振動の送り速度と傍矢状洞スライスを準備します。
   6. プラスチック トリムのピペットを使用すると、記録する前に、少なくとも 30 分のための 32 ° C で継続的に酸素のアプライドを含む貯蔵室でナイロン メッシュの上にスライスを転送します。
      注: 削除するとき脳膜と脊髄根特に背側角、脊髄への損傷を避けるために注意してください。脊髄は背腹スライスする必要があります。最良の結果を急速に (15-20 分) 以内のスライスが準備されるべき。脊髄スライスの厚さは、細胞可視性を満たすためにこれ以上より 600 μ m をする必要があります。さらに、上記の方法を利用して水平脊髄スライスが取得される可能性があります。

4. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録

1. SG ニューロンから全体セル ホールセルパッチク ランプ記録を実施する K⁺を使用して、-Cs⁺を適用している間ほとんどの録音の場合、細胞内のソリューションをベース-ベースの抑制性シナプス電流の記録だけにソリューション。
2. 優しく記録室に脊髄スライスを移動し、それ U 字白金細線を最適なスライスの安定のためにしっかりとナイロン スレッドに接続を維持します。着実に重力システムによって RT でバブルのアプライドでスライスを灌流し、十分な酸素化を達成するために 2-4 mL/分で灌流率を設定します。
3. 低解像度顕微鏡レンズを使用して SG (半透明バンド) の領域を識別する、ターゲット セルとして高解像度の目的を使用して、健康的なニューロンを選択、ビデオ モニター画面の中央にそれを調整します。
4. K⁺の適切なボリュームでピペットを埋める-基づくまたは Cs⁺-電極ホルダーにマイクロ ピペットを挿入し、細胞内のソリューション内銀線に連絡していることを確認、必要に応じて、細胞内のソリューションをベース、ホルダーです。
5. 焦点にマイクロ ピペットをもたらすと、マニュピュレーターを使用してアプライドに没頭し、穏やかな肯定的な圧力 (~ 1 psi 圧力計で測定した場合) に適用任意の汚れや破片からピペットを強制します。
6. 対象となるニューロンに向けてマイクロ ピペットを徐々 に移動します。ピペット、gigaseal を形成する神経細胞の膜にニューロンおよび非常に小さいディンプル フォームに近づく一度肯定的な圧力をリリースします。
7. -70 に潜在的な保有物の変更は、生理学的に近い膜電位を休んで (RMP) セルの mV。膜を破裂し、良い全体セル構成を作成するマイクロ ピペットに過渡的で穏やかな吸引を適用します。
   メモ: スライスを記録室に編入、スライス表面上の破片をクリアする、少なくとも 5 分の安定した血流を確保します。それは、健康と不健康な/デッド ニューロン間を区別する能力が良いシーリングと安定した記録の最も重要は注目に値するです。不健康な/デッド ニューロンいます腫れ、または縮められた外観、目に見える大きな核と共に健康的なニューロンは、明るいと滑らかな膜を 3 次元 (3 D) の形状によって特徴付けられる、その核は表示されません。全体セル構成を達成するためには、必要な場合に段階的な高速または低容量を補うために不可欠です。常温では、液絡部の潜在的な計算、15.1-15.2 mV と k⁺4.3-4.4 mV-ベースと Cs⁺-細胞内のソリューションをそれぞれベースします。私たちの研究では、記録されたデータが液間電位の修正されません。
8. 本質的な膜特性の録音
   1. 本質的な膜特性を記録: 直ちにレコード RMP (20 内 s) で休憩後。電流クランプ モードで RMP で脱分極電流を電圧応答 (10 pA、500 ms) を測定することによって神経の入力抵抗を決定します。
   2. 発火特性記録: 1 のシリーズで電流クランプの各ニューロンの発火パターンをテスト脱分極電流パルス (25-150 pA 25 pA の増分で) RMP で s。しきい値、振幅およびオフラインに単一活動電位の半分幅を測定します。
   3. サブスレッショルド電流を記録: 不定サブスレッショルド電流を評価するために開催膜電位-50 mV 電圧クランプ モードで。-60 から 1 時間の電圧パルス過分のシリーズを適用して-120 mV mV、10 mV デクリメントします。
   4. 興奮性シナプス電流 (工) を記録: k⁺レコード工-ベースの-70 の開催可能性でクランプ電圧モードで細胞内ソリューション mV。
   5. レコード Ips: 適用 Cs⁺-ベースの Ips を記録するため細胞内のソリューション。全体セル構成が確立されると、膜電位で保持-70 mV、0 に潜在的な保有物を変更し 〜 5 分 mV 徐々 に。安定化は、数分待ってから、IPSC のイベントを記録するために開始します。
      注:-50 mV と表示のオーバー シュートでは未満、RMP の唯一のニューロンはさらなる研究のため選択する必要があります。本研究ではシリーズ抵抗は 10-30 MΩ では通常、直列抵抗が 20% 以上変更記録を除外すべき。工は 50 μ m APV 風呂アプリケーションで確認できると 20 μ M CNQX、10 μ M ビククリンにより 1 μ M ストリキニーネと Ips を確認可能性があります。

5. 形態学的研究

1. 形態実験用 K⁺-0.05% neurobiotin 488 を含む細胞内の溶液を用いた。
2. 少なくとも 20 分記録電気生理学的安定を維持し後、ゆっくりと再シールし、脊髄スライスを 4% を入れた容器に転送する細胞膜を許可するように上向き方向にマイクロ ピペットを削除 PFA。4% で、スライスを修正する PFA 常温 1 時間放置、4 ° C 一晩。
3. Pbs は、スライスをすすいで、その後 30 分間 50% エタノールに浸ってください。PBS で洗浄 3 つの別の後、メディアをマウントをスライド上に、元の厚さのスライスをマウントします。
4. 共焦点顕微鏡を使用 (材料表参照) 画像の獲得および神経細胞の 3次元再構成のため。1.5 μ m の z スタック 20 X レンズを通してニューロンをスキャンします。

結果

急性脊髄スライスは、図 1に示す図に従って調製しました。スライスと回復後、脊髄スライスは、記録室に移されました。健康的なニューロンは、IR DIC 顕微鏡を用いた相馬外観に基づいて識別されました。次に、SG ニューロンの活動電位が脱分極電流パルス (1 時間) のシリーズによって誘発されるときのニューロンは、RMP で開催されました。に...

ディスカッション

このプロトコルの詳細 SG ニューロン^18,19,20,21の全細胞パッチク ランプ-実験を行う際、我々 は正常に使用している脊髄スライスを準備するための手順。このメソッドを実装すると、我々 は最近報告ミノサイクリン、テトラサイクリンの第二世代は著しく¹⁹SG ニューロンのシナプ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S7653	Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl	Sigma	60130	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O	Sigma	71500	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3	Sigma	S5761	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose	Sigma	G7021	Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid	Sigma	P5280	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate	Sigma	A7631	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose	Sigma	S7903	Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate	Wako	169-11835	Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine	Sigma	P1937	Used for the preparation of intracellular solution
EGTA	Sigma	E3889	Used for the preparation of intracellular solution
HEPES	Sigma	H4034	Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187	Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP	Sigma	G5884	Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4	Sigma	C1426	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl	Sigma	C3011	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl	Sigma	T2265	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488	Vector	SP-1145	0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar	Sigma	A7002	3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4	Hengxing Chemical Reagents		Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium	Polyscience	18606
Urethan	National Institute for Food and Drug Control	30191228	1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	TW150F-4	1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Used for the preparation of micropipettes
Vibratome	Leica	VT1000S
Vibration isolation table	Technical Manufacturing Corporation	63544
Infrared CCD camera	Dage-MIT	IR-1000
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285
X-Y stage	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Osmometer	Advanced	FISKE 210
PH meter	Mettler Toledo	FE20
Confocol microscope	Zeiss	LSM 700