Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Özet

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Özet

Bütün hücreli yama-kelepçe çalışmalar gözlemliyorum gelatinosa (SG) nöronlar gelen duyusal iletim, nosiseptif yönetmelik ve kronik ağrı ve kaşıntı geliştirme temel spinal mekanizmaları hakkında bilgi büyük gövdeli hazırladık. Uygulamaları ile birlikte akut spinal kord dilimleri yardımcı programında temel morfolojik araştırmalar elektrofizyolojik kayıtlar daha da nöronal özellikleri anlayışımızı ve SG yerel devre bileşimi iyileştirilmiştir. Burada, spinal kord dilimleri ve gösteri temsilcisi bütün hücreli kayıt ve morfolojik sonuçları hazırlanması için detaylı ve pratik bir rehber mevcut. Bu iletişim kuralı ideal nöronal koruma izni ve in vivo koşullar belli bir ölçüde taklit edebilirsiniz. Özetle, spinal kord dilimleri vitro hazırlanması elde etmek için yeteneği sağlar istikrarlı akım ve gerilim kelepçe kayıtları ve böylece içsel membran özellikleri, yerel devresi detaylı soruşturma kolaylaştırabilir ve nöronal yapısı çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanarak.

Giriş

Gözlemliyorum gelatinosa (SG, lamina II. spinal dorsal boynuz), verici ve duyusal bilgileri düzenleyen bir tartışmasız önemli geçiş merkezidir. Birincil afferent lifler, yerel interneurons ve endojen azalan inhibitör sistem¹girdileri almak eksitatör ve inhibitör interneurons oluşur. Akut omurilik dilim hazırlık gelişimi ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıt gelişiyle SG nöronlar^2, iç elektrofizyolojik ve morfolojik özellikleri çeşitli çalışmalar son yıllarda etkin ^{3 , 4} gibi çalışmalar yerel devresi SG^5,6. Ayrıca, vitro omurilik dilim hazırlık kullanarak, araştırmacılar nöronal excitabilities^7,8değişiklikleri yorumlamak,^9,10, iyon fonksiyonu kanalları ve sinaptik aktiviteleri^11,12 çeşitli patolojik şartlar altında. Bu çalışmalar kronik ağrı ve nöropatik kaşıntı bakım ve SG nöronlar gelişiminde oynadığı rol bizim anlayış derinleştirdi.

Esasen, nöronal soma ve ideal bütün hücreli akut spinal kord dilimleri kullanarak yama açık bir görselleştirme elde etmek için anahtar sağlıklı ve tamsayı nöronlar elde edilebilir bu yüzden dilimleri mükemmel kalitesini garanti etmek için ön koşuldur. Ancak, spinal kord dilimleri hazırlanıyor ventral laminektomi gerçekleştirme ve sağlıklı dilimleri elde engeller olabilir pia-araknoid membran kaldırma gibi birkaç adımdan oluşur. Spinal kord dilimleri hazırlamak kolay olmasa da, kayıtları vitro omurilik dilimleri gerçekleştirme birçok avantajı vardır. Hücre kültür hazırlıkları için karşılaştırıldığında, spinal kord dilimleri kısmen bir fizyolojik ilgili durumdadır doğasında sinaptik bağlantıları koruyabilirsiniz. Buna ek olarak, tüm hücreli yama-kelepçe kayıt omurilik dilimleri kullanarak Çift Kişilik yama kelepçe^13,14, morfolojik araştırmalar^15,16 ve tek hücreli RT-PCR gibi diğer teknikleri ile kombine ¹⁷. bu nedenle, bu teknik belirli bir bölge içindeki anatomik ve genetik farklılıkların karakterize üzerinde daha fazla bilgi sağlar ve yerel devresi bileşimi incelenmesi için izin verir.

Burada, akut spinal kord dilimleri hazırlama ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları SG nöronlar edinme için bizim Yöntem, temel ve ayrıntılı açıklamasını sağlamak.

Protokol

Açıklanan tüm deneysel protokoller hayvan Etik Komitesi, Nanchang üniversite tarafından (Nanchang, PR Çin, etik No.2017-010) kabul edildi. Tüm çabaları stres ve deneysel hayvan ağrı en aza indirmek için yapılmıştır. Burada yapılan elektrofizyolojik kayıtlar oda sıcaklığında (RT, 22-25 ° C) gerçekleştirilmiştir.

1. hayvanlar

1. Her iki cinsiyetten Sprague-Dawley rat (3-5 hafta eski) kullanın. 12 h koyu döngüsü altında hayvanlar ev ve onlara ad libitum erişim yeterli yiyecek ve su için.

2. çözüm ve malzemelerin hazırlanması

1. Çözümleri
   1. Yapay serebrospinal sıvı (ACSF) (mM) hazırlamak: 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH₂PO₄·2H₂O, 2.5 CaCl₂·2H₂O, 1.2 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 11 D-glikoz, 0.4 askorbik asit ve 2 Sodyum pyruvate. Bkz. Tablo 1.
   2. Sükroz-ACSF (mM) olarak hazırlamak: 240 sukroz, 2.5 KCl, 1,25 NaH₂PO₄·2H₂O, 0.5 CaCl₂·2H₂O, 3,5 MgCl₂·6H₂O, 25 NaHCO₃, 0.4 askorbik asit ve 2 Sodyum pyruvate. Tablo 2' ye bakın.
   3. K⁺hazırlamak-hücre içi çözümde (mM) dayalı: 130 K-glukonat, 5 KCl, 10 Na₂-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP ve 0.3 Li-GTP. Tablo 3' e bakın.
   4. CS⁺hazırlamak-hücre içi çözümde (mM) dayalı: 92 CsMeSO₄, 43 CsCl, 10 Na₂-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (çay) - Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg - ATP ve 0.3 Li-GTP. Bkz. Tablo 4.
      Not: Tüm çözümler distile su kullanılarak hazırlanması gerekir. ACSF ve sukroz-ACSF carbogenated (% 95'i O₂ ve %5 CO₂ karışımı) yaklaşık 7,4 bir optimum pH korumak için kullanılmadan önce olmalıdır ve bu iki çözüm osmolalite 300-310 mOsm için ayarlanmalıdır. Askorbik asit kalsiyum kanalları etkileyebilir çünkü bir kalsiyum akımları kaydetmek istiyorsanız bu aracı ihmal gerekir. Osmolalite ve hücre içi çözümler pH ölçülen olmalı ve 290-300 mOsm ve 7,2-7.3, anılan sıraya göre ayarlanır. Bu hücre içi çözümler 0.2 µm filtreleriyle filtre uygulama ve çözümleri-20 ° C'de 1 mL aliquots olarak saklamak için tavsiye edilir CS⁺ ve çay için geçerli olan Cs⁺-membran potansiyeli tutmak için amplifikatör kullanmaya elverişli blok Potasyum kanal için hücre içi çözüm tabanlı 0 sabit inhibitör postsinaptik akımları (IPSCs) kayıt yaparken mV.
   5. % 0.05 neurobiotin 488 çözüm hazırlamak. K⁺neurobiotin 488 4 mL 2 mg çözülür-hücre içi çözüm tabanlı ve osmolalite 290-300 mOsm için gerekirse distile su veya sukroz kullanarak ayarlayın.
      Not: sükroz 1 mM tarafından 1 mOsm Osmolarite artırır.
   6. %3 agar bir taşı olarak spinal kord için hazır olun. Agar bir cam ölçek arıtılmış su 250 ml 7,5 gr dağıtılması ve bir mikrodalga kaynar kadar ısı ve temizlemek için kullanın. Çözüm girdap ve bir 17,5 cm x 10,5 cm x 1,8 cm plastik kutu için katılaşma sonra içine karışımı dökün. Agar 4 ° C'de kullanmak için önceden tutun.
   7. %4 paraformaldehyde (PFA) immunohistokimyasal işlenmek üzere hazırlayın. Mix 40 g ~ 800 mL için İngiltere'de yılın tozu ısıtmalı (yaklaşık 60 ° C) 1 x PBS çözüm (130 mM NaCl, 7 mM Na₂HPO₄, 3 mM NaH₂PO₄). Yavaş yavaş pH PFA tozu tamamen eriyene kadar 1 N NaOH damla ekleyerek ayarlayın. Bir kez belgili tanımlık eriyik netlik kazandı, 1 x PBS ile 1 L için toplam ses düzeyini ayarlayın. PH 7.2-7.4 sonra % 4 İngiltere'de yılın çözüm filtre ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın, gerektiğinde 1 N HCl kullanarak için yeniden ayarlayabilirsiniz.
      Not: maske, eldiven gibi koruyucu gözlük takmak için gerekli bu yüzden İngiltere'de yılın, zehirlidir. %4 hazırlama işlemini yapmak PFA havalandırılmış bir başlık içinde. İngiltere'de yılın toz pH değeri yaklaşık 9-10 tamamen çözülmüş.
2. Aletleri
   1. Tipik bir elektrofizyolojik sistem için donanımlı kızılötesi fark girişim kontrast (IR-DIC) ve yüksek çözünürlüklü su-daldırma amaç, CCD/CMOS Kamera, bir yama-kelepçe amplifikatör, bir micropipette sahibi ile dik bir mikroskop kullanın ve bir Pipet konumu hassas ayar sağlayan micromanipulator. Bir XY sahne de mikroskop taşımak için gereklidir.
   2. Faraday kafesi tarafından çevrili bir titreşim yalıtım tablo tüm ekipmanları monte. Nöronlar gözlemlemek ve Mikropipetler görselleştirmek için video kameranın video monitörü bağlayın.
3. Mikropipetler
   1. Kayıt elektrotları borosilikat cam kılcal bir micropipette çektirmenin kullanarak üzerinden yapmak. Tipik pipet direnç ile hücre içi çözüm dolu 3-6 MΩ aralığındadır.
4. Agar blok
   1. Bir 1.2 cm x 1,5 cm x 2,0 cm agar blok hazırlamak. Şekil 1 ' de gerektiği gibi gösterilen şekiller halinde blok döşeme.

3. Akut Spinal kord dilim hazırlık

Not: Enine veya parasagittal omurilik dilimler olarak daha önce açıklanan^18,19,20hazırlanır.

1. Transcardial perfüzyon ve spinal kord ayıklama önce ~ 500 mL sukroz-ACSF % 95'i O₂ ve %5 CO₂ ile equilibrated hazırlamak ve çözüm için buz gibi serin (0-4 ° C).
2. Tüm diseksiyon (diseksiyon makası, Iris makas, dişli forseps, iyi forseps, Kıvrımlı penslermesela ) buz üzerinde serin alet. Akut omurilik dilim hazırlanması diyagramı Şekil 1' de gösterilen.
3. Transcardial perfüzyon
   1. Bir tek enjeksiyon (mayi, IP) üretan (1.5 g/kg) sonra 2-3 dakika bekleyin ve fareler anestezi derinliği ayak veya kuyruk tutam yanıt test ederek değerlendirmek. Bir kez cerrahi uçağa anestezi korunur, fareyi ezilmiş buz sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
      Not: torakotomi sırasında derin anestezi sigara-algı için acı yeterli üretmek için yerel IACUC yönergeleri izleyin.
   2. Köprücük kemiği xiphoid işleminden cilde aracılığıyla bir kesi (3-4 cm) ve xiphoid işlem düzeyi altında enine bir kesi olun.
   3. Kavramak ve xiphoid işlemi çift diyafram tamamen ortaya çıkarmak için eğri forseps ile yükseltmek. Diyafram aracılığıyla enine bir kesi yapın ve sonra göğüs ve bilateral göğüs boşluğunu açmak için kaburga arasında göğüs kafesi kesti. Kıvrımlı pensler göğüs kafesi sabit ve kalp yeterince maruz xiphoid süreci kavramak için kullanın.
   4. Kalp başka bir eğri forseps ile yavaşça tutun ve sol ventrikül tabanına aort yoluyla 22 G iğne yerleştirin.
   5. Sağ atrium hemen iyi makasla kesmek ve buz gibi oksijenli sükroz-ACSF yerçekimi sistemi ile perfüzyon başlatın.
      Not: Hızlı ve yeterli transcardial perfüzyon ile buz gibi sükroz-ACSF düşük sodyum ve kalsiyum konsantrasyonu eksitatör toksisite hafifletmek ve nöronal fonksiyon korumak yardımcı olabilir süre omuriliğin, hızlı soğutma kolaylaştırabilir. Ayrıca, kırmızı kan hücreleri temizleme bir morfolojik çalışma yaparken boyama arka plan biocytin azaltmak için yararlı olacaktır. Perfüzyon sağ atrium çıkmadan sıvı açıktır ve sıçan karaciğer ve pençeleri rengi soluk olarak yeterli ve tatmin olarak kabul edilir. 22 G iğne ucu kalp ve aort parçalanma önlemek için künt olmalı.
4. Spinal kord diseksiyon ve dilimleme
   1. Perfüzyon eyaletinde iki tarafında omurga ve kaburga arasında göğüs kafesi üzerinden kesip arka cilde gelen kaudal rostral, boyuna kesik (5 cm) yapmak.
   2. Omurga kaudal sonundaki bir kesim yapmak, uzak çevre dokular kesmek için makas kullanın ve hızla omurga lumbosakral parçasını yalıtır.
   3. Lumbosakral segment buz gibi sükroz tabanlı ACSF içeren bir cam tabak aktarın. Ventral yanında yukarı doğru çift taraflı vertebral Transpediküler kesilmiş ve spinal kord dikkatle maruz iyi makas kullanın. 2 cm uzun Medulla Spinalis lumbosakral büyütme (L1-S3) ile yalıtmak ve soğuk sükroz-ACSF ile dolu başka bir cam tabak spinal bölüm aktarmak.
   4. Meninkslerde ve pia-araknoid membran diseksiyon mikroskop altında kaldırın. Ventral ve dorsal kök kısa zamanda sadece... Kes gitsin.
   5. Spinal kord önceden kesilmiş agar blokta yer. Enine dilimleri hazırlamak için omurilik ventral yan agar için ekleyin ve bıçak arka tarafa izin. Parasagittal dilimleri hazırlamak için ventral tarafı yapıştırıcı ile dikey yönde agar Şekil 1' de gösterildiği gibi takın. Sonra bir vibratome yapıştırıcı ile bir platform için agar bloğunu bağlayın. 300-500 µm enine veya parasagittal dilim önceden bir hızla 0.025 mm/s ve bir titreşim frekansı 80 Hz hazırlayın.
   6. Plastik kesilmiş pipet dilimleri üzerine naylon mesh 32 ° c en az 30 dk önce kayıt için sürekli oksijenli ACSF içeren bir depolama odasında aktarmak için kullanın.
      Not: özellikle dorsal boynuz, omurilik yaralanma meninkslerde ve omurilik kök kaldırırken önlemek için dikkat ediniz. Spinal kord ventrally dorsal dilimlenmiş. En iyi sonuçlar için dilimleri (15-20 dk) içinde hızlı bir şekilde hazırlanmalıdır. Omurilik bir dilim kalınlığı hücre görünürlük karşılamak için 600'den fazla µm olmalıdır. Ayrıca, yukarıda açıklanan tekniği yatay spinal dilimleri elde etmek için kullanılabilir.

4. bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları

1. Bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları SG nöronlar üzerinden yapmak kullanmak K⁺-Cs⁺uygulanırken çoğu kayıt zaman, hücre içi çözüm dayalı-tabanlı çözümü sadece inhibitör postsinaptik akıntılarının kayıt için.
2. Yavaşça bir omurilik dilim kayıt odasına taşıyın ve sonra U şeklinde platin tel ile naylon iplik en iyi dilim istikrar için sıkıca bağlı korumak. Sürekli kabarcıklanma ACSF RT, dilimle bir yerçekimi sistemi ile sıvı ve perfüzyon oranı 2-4 mL/dk yeterli oksijenasyonu elde etmek için ayarlayın.
3. Düşük çözünürlüklü mikroskop lens ile SG (yarı saydam bant) bölgenin tanımlamak, yüksek çözünürlüklü objektif hedef hücre kullanarak sağlıklı bir nöron belirleyin ve video monitörü ekranın ortasına doğru ayarlayın.
4. Bir micropipette K⁺uygun bir hacmi ile doldurun-tabanlı veya Cs⁺-micropipette Elektrot tutucu yerleştirin ve hücre içi çözüm içinde gümüş tel bağlantı kurmanızı sağlamak, gerektiğinde hücre içi çözüm tabanlı tutucu.
5. Micropipette odak haline getirmek ve bir micromanipulator kullanarak ACSF sokmak ve hafif pozitif basınç (~ 1 bir manometre ile ölçülen zaman PSI) geçerli herhangi bir kir ve enkaz uzak micropipette zorlamak için.
6. Micropipette hedeflenen nöron doğru yavaş yavaş hareket. Pipet nöron ve bir çok küçük çukur formları yaklaşımlar nöronal membran üzerinde bir gigaseal oluşturmak için bir kez pozitif basınç serbest bırakmak.
7. -70 için potansiyel holding alter fizyolojik yakın membran potansiyeli (RMP) bir hücrenin dinleniyor mV. Daha sonra geçici ve yumuşak emici membran rüptürü ve iyi bir bütün-hücre yapılandırması oluşturmak için micropipette uygulayın.
   Not: kayıt odasına dilimi aktardıktan sonra enkaz dilim yüzeyi temizlemek en az 5 min için sürekli perfüzyon olun. Bu yeteneği sağlıklı ve sağlıksız/ölü nöronlar arasında ayırt etmek için büyük önem iyi sızdırmazlık ve istikrarlı kaydı için olduğu dikkati çekiyor. Bir sağlıksız/ölü nöron süre sağlıklı bir nöron bir 3 boyutlu (3D) şekil parlak ve pürüzsüz bir membran ile karakterizedir ve çekirdeği görünmez görünür bir büyük çekirdeği ile birlikte bir şiş veya küçültülmüş görünüme sahiptir. Bütün hücre yapılandırma elde etmek için hızlı veya yavaş kapasite için adım adım gerektiğinde telafi etmek için esastır. RT sıvı kavşak potansiyel 15,1-15,2 mV ve k⁺4.3-4.4 mV olmak hesaplanır-dayalı ve Cs⁺-hücre içi çözüm, sırasıyla dayalı. Çalışmalarımız, kaydedilen veri için sıvı kavşak potansiyel düzeltildi değil.
8. Kayıtları içsel membran özellikleri
   1. Kayıt pasif içsel membran Özellikler: kayıt RMP hemen (20 içinde s) içinde aradan sonra. Nöronal giriş direnci için geçerli depolarize gerilim yanıt (10 pA, 500 ms) ölçerek RMP akım tipi kelepçe modunda belirlemek.
   2. Kayıt özellikleri ateş: Her neuron ateş paterni akım-kelepçe 1 bir dizi Test geçerli bakliyat (25 pA artış 25 – 150 pA) RMP, kutuplarını s. Eşik, genlik ve yarım-bir tek aksiyon potansiyeli çevrimdışı genişliğini ölçmek.
   3. Kayıt subthreshold geçerli: somatik subthreshold akımları değerlendirmek için membran potansiyel -50 basılı tutun mV gerilim tipi kelepçe modunda. Daha sonra bir dizi hyperpolarizing -60 üzerinden 1 s süresi ve gerilim darbeleri uygulayın mV -120 için 10 mV azaltma ile mV.
   4. Kayıt eksitatör postsinaptik akımları (EPSCs):⁺K ile kayıt EPSCs--70 holding potansiyelini gerilim tipi kelepçe modunda hücre içi çözüm tabanlı mV.
   5. Kayıt IPSCs: Cs⁺uygulamak-IPSCs kayıt için hücre içi çözüm tabanlı. Bütün hücre yapılandırma kurulduktan sonra membran potansiyel-70 tutun mV ~ 5 min ve o zaman değişim 0 olarak potansiyel holding mV yavaş yavaş. İstikrar için birkaç dakika bekleyin ve IPSC olayları kaydetmek başlatın.
      Not: Sadece nöronlar bir RMP-50 mV ve gösterme kaçmak daha az ile daha fazla çalışma için seçili olmalıdır. Serisi dirençlerin çalışma genellikle 10-30 MΩ olan ve seri direnç fazla % 20 oranında dönüştüğünde bir kayıt tutulmalıdır. EPSCs 50 µM APV banyo uygulaması ile teyit ve 20 µM IPSCs 10 µM bicuculline ve 1 µM striknin ile teyit edilmesi ise CNQX.

5. morfolojik çalışma

1. Bir K⁺morfolojik deneyler için kullanın-%0,05 neurobiotin 488 içeren hücre içi çözüm dayalı.
2. İstikrarlı bir elektrofizyolojik en az 20 dk kayıt tutarak sonra yavaş yavaş micropipette hücre zarının yeniden mühürlemek ve spinal kord dilim %4 ile dolu bir kapsayıcı aktarmak izin vermek için yukarı doğru yönde kaldırmak PFA. Dilimleri %4 oranında tamir PFA RT için 1 h ve daha sonra 4° C gecede.
3. Dilimleri içinde PBS durulama ve sonra onları % 50 Etanol 30 dk için bırakın. Peş peşe üç PBS içinde yıkar, dilimleri içinde onların orijinal kalınlığı ile bir montaj araç slayta takma.
4. Confocal mikroskop kullanın (bkz. Tablo reçetesi) resim alma ve nöronal 3D yeniden inşa için. Nöronlar 20 X lens 1,5 µm yığını z ile inceden inceye gözden geçirmek.

Sonuçlar

Akut omurilik dilimleri Şekil 1' de gösterilen diyagramı göre hazırlanmıştır. Dilimleme ve kurtarma sonra spinal kord dilim kayıt odasına transfer edildi. Sağlıklı nöronlar IR-DIC mikroskobu kullanılarak soma görünüşüne göre tespit edilmiştir. SG nöronlar Aksiyon potansiyelleri geçerli bakliyat (1 s süresi) depolarize bir dizi tarafından daha sonra elde edildi nöronlar RMP otelde yapıldı. Şekil 2, a?...

Tartışmalar

Bu protokolü ayrıntıları Biz başarıyla bütün hücreli yama-kelepçe deneyler SG nöronlar^18,19,20,21tarihinde gerçekleştirirken kullanılan spinal kord dilimleri hazırlanması için adımları. Bu yöntemi uygulayarak, biz son zamanlarda o minosiklin rapor tetrasiklin, ikinci nesil belirgin geliştirmek inhibitör sinaptik iletimi SG nöronlar¹⁹presynaptic bir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S7653	Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl	Sigma	60130	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O	Sigma	71500	Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O	Sigma	M2670	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3	Sigma	S5761	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose	Sigma	G7021	Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid	Sigma	P5280	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate	Sigma	A7631	Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose	Sigma	S7903	Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate	Wako	169-11835	Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine	Sigma	P1937	Used for the preparation of intracellular solution
EGTA	Sigma	E3889	Used for the preparation of intracellular solution
HEPES	Sigma	H4034	Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP	Sigma	A9187	Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP	Sigma	G5884	Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4	Sigma	C1426	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl	Sigma	C3011	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl	Sigma	T2265	Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488	Vector	SP-1145	0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar	Sigma	A7002	3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4	Hengxing Chemical Reagents		Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium	Polyscience	18606
Urethan	National Institute for Food and Drug Control	30191228	1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	TW150F-4	1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Used for the preparation of micropipettes
Vibratome	Leica	VT1000S
Vibration isolation table	Technical Manufacturing Corporation	63544
Infrared CCD camera	Dage-MIT	IR-1000
Patch-clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-285
X-Y stage	Burleigh	GIBRALTAR X-Y
Upright microscope	Olympus	BX51WI
Osmometer	Advanced	FISKE 210
PH meter	Mettler Toledo	FE20
Confocol microscope	Zeiss	LSM 700