قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

Summary

ويصف هذا الأسلوب تسجيل الوقت الحقيقي لاستهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية في أنسجة الشبكية الماوس اكسبلانتيد محلل تدفق خارج الخلية باستخدام.

Abstract

رؤية عالية الحدة عملية استهلاك الطاقة بشكل كبير، والشبكية وقد وضعت عدة تعديلات فريدة من نوعها لتلبية هذه الطلبات مع المحافظة على الشفافية للمحور البصري تحديداً. اضطرابات بهذا التوازن الدقيق يسبب الأمراض المسببة للعمى، مثل اعتلال الشبكية السكري. ولذلك لا بد من تطوير العلاج العقلاني للأسباب المختلفة لفقدان الرؤية فهم تغيرات استقلاب الطاقة في الشبكية أثناء المرض. ظهور المحلﻻت التمويه المتاحة تجارياً خارج الخلية الأخيرة جعلت دراسة الأيض الطاقة الشبكية أكثر يسرا. ويصف هذا البروتوكول استعمال هذه محلل قياس المساهمات لإمدادات الطاقة الشبكية من خلال أسلحتها مبدأ اثنين-الفسفرة وتحلل-بالتحديد الكمي للتغيرات في معدلات استهلاك الأوكسجين (OCR) وخارج الخلية معدلات التحمض (عكر) كوكلاء لهذه المسارات. يتم تنفيذ هذا الأسلوب سهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد، تيسير تقييم الاستجابات لعدة عوامل دوائية في تجربة واحدة. تتم مقارنة التوقيعات الأيضي في شبكية العين من الحيوانات التي تفتقر إلى ورود إشارات مستقبله إلى البرية من نوع عناصر التحكم باستخدام هذا الأسلوب. قيداً رئيسيا في هذه التقنية هو عدم القدرة على التمييز بين استخدام الطاقة داركادابتيد وتتكيف مع الضوء، الاعتبارات الفسيولوجية هامة في نسيج الشبكية.

Introduction

شبكية العين بين أنسجة معظم الطاقة تطالب في الجهاز العصبي المركزي¹. مثل معظم الأنسجة، فإنه ينشئ الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق تحلل في سيتوسول أو عن طريق الفسفرة في الميتوكوندريا. ميزة حيوية من الفسفرة على تحلل لإنتاج ATP من جزيء واحد من السكر واضح: 36 جزيئات ATP الناتجة السابق مقابل 2 جزيئات ATP التي تم إنشاؤها من هذا الأخير. وبناء على ذلك، الخلايا العصبية الشبكية تعتمد أساسا على التنفس المتقدرية للإمداد بالطاقة وهذا ينعكس على كثافة عالية من الميتوكوندريا². حتى الآن، الشبكية أيضا تعتمد اعتماداً كبيرا على الآلات جليكوليتيك حتى في حالة وفرة الأوكسجين. ووصفت هذه العملية تحلل الهوائية أصلاً في الخلايا السرطانية "أوتو واربورغ"³، الذين مرة لاحظ أن الشبكية الأنسجة فقط بعد انتهاء الانقسامية قادرة على هذا الشكل من الأيض⁴. منذ تلك الملاحظات الأولية، وقد وصف العديد من الأنسجة الانقسامية بعد القيام بدرجات متفاوتة من تحلل بالإضافة إلى الفسفرة لتلبية مطالبهم ATP.

فوتوترانسدوكشن، والصباغ البصرية إعادة التدوير، والتركيب الحيوي من شرائح الخارجي مستقبله، ونشاط متشابك، جميع العمليات تطلبا الطاقة في فوتوريسيبتورس، فئة فرعية العصبية الغالبة في الشبكية. ولكن الحاجة إلى النقل بنشاط الأيونات ضد تلك الكهربائية والتدرجات وتركيز هو إلى حد بعيد عملية تستهلك أكثر قوة في الخلايا العصبية¹. فوتوريسيبتورس هي غريبة من الخلايا العصبية في الإحساس بأنهم ديبولاريزيد في غياب التحفيز (أي في الظلام)، بينما حافزا خفيفة يؤدي إغلاق القناة وفرط الاستقطاب اللاحقة. ولذلك، يستهلك الشبكية في الظلام، وكميات كبيرة من ATP الحفاظ على ديبولاريزيشن أو "الحالي الظلام" كما يطلق عليه عادة. من وجهة نظر تكيفية، تحديا كبيرا في توفير هذه الكميات الضخمة من ATP هو الحاجة للكائنات الحية للحفاظ على الوضوح البصري عن طريق المحور البصري. البنية الشبكية المقلوبة ينظر في المخلوقات الحديثة هو الحل المهيمنة، كما أنها تحافظ على الشبكة الشعرية الكثيفة توفير photoreceptors بعيداً عن مسار الضوء. ولكن هذه معجزة الهندسة البيولوجية الطبيعية يضع الشبكية في هاوية من حيث الاحتياطي الأيضية. الشتائم حتى الصغيرة للشبكية يمكن أن تعطل يحتمل أن التوازن الدقيق لإمدادات الطاقة للطلب، والخلل البصري أو عمي الصريح قد تنشأ بسرعة.

نظراً لمتطلبات حيوية فريدة من نوعها الشبكية العصبية، مقرونا قيود مشددة إمدادات الأوعية الدموية، ويمكن أن يكون القياس الدقيق لاستهلاك ATP في الشبكية والتغييرات أثناء المرض آثار عميقة في فهم وعلاج الظروف المسببة للعمى مثل التهاب الشبكية الصباغي، واعتلال الشبكية السكري. عادة، تتطلب هذه القياسات معدات مكلفة، ومصممة خصيصا مع معظم الدراسات الناشئة من حفنة من مختبرات مكرسة تماما لقياس النشاط الأيضي^2،،من^{56، 7،8}. وتشمل تقنيات الاختبارات الفردية لنواتج الأيض محددة، دراسات التتبع باستخدام الراديو المسمى السلائف، استهلاك الأكسجين تسجيل باستخدام أقطاب كلارك والتنميط⁹metabolomic.

مع التقدم في تكنولوجيا عالية الإنتاجية، وزيادة توافر الأجهزة التجارية، تقنيات الأيض الشبكية سجل متزايدة وميسورة التكلفة. الأسلوب الموصوفة هنا يقيس كلا الفسفرة وتحلل في الشبكية باستخدام اكسبلانتيد الأنسجة والتمويه متاحة تجارياً خارج الخلية محلل^9،10،،من¹¹¹². هذا المحلل بشكل منفصل يسجل معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) ومعدل تحمض خارج الخلية (عكر)، بمثابة المؤشرات غير المباشرة من الفسفرة وتحلل، على التوالي¹³. وتتم هذه القياسات بتحقيق سوبميرسيد داخل ميكروتشامبير تم إنشاؤها عبر الأنسجة لمصلحة. يستخدم هذا التكيف من أساليب المنشورة سابقا لوحة التقاط مصممة أصلاً للبنكرياس جزر لانجرهانز لتسجيل النشاط الأيضي في مقاطع صغيرة، دائرية الشبكية الماوس. يمكن تسليم التعرض دوائية متعددة للأنسجة أثناء تسجيل واحد لأن النظام يحتوي على 4 منافذ حقن لكل عينة أيضا. باستخدام هذا النظام مع بروتوكولات منفصلة الأمثل لتسجيلات عكر والتعرف الضوئي على الحروف، يمكن مقارنة ردود البرية من نوع شبكية العين على شبكية العين التي تفتقر إلى ترانسدوسين (Gnat1^--/--)، سببا من أسباب خلقية ثابتة من العمى الليلي في ¹⁴من البشر.

Protocol

تابعت رابطة البحوث في الرؤية وبيان العيون "استخدام الحيوانات" البروتوكولات وأقرتها جامعة واشنطن.

1-إعداد الحيوان

1. الحفاظ على الحيوانات في الإسكان القياسية مع 12 ساعة الظلام إلى دائرة الضوء 12 ساعة. بدء تجارب في توحيد مرات لتجنب التأثيرات الإيقاعية، عادة في الصباح بعد أن يتم تشغيل أضواء.

2. إعداد الحل

1. إعداد قاعدة الوسائط بتذويب 8.4 ملغم من مسحوق وسائل الإعلام في المقطر مزدوجة ح₂س (ddH₂س) وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl أو هيدروكسيد الصوديوم، إلى وحدة تخزين نهائي 1 تعقيم L. عامل التصفية هذا الحل مع عامل تصفية زراعة الأنسجة 0.22 ميكرومتر.
   1. إضافة الجلوكوز 1 م وبيروفات صوديوم 100 مم إلى وسائل الإعلام لبلوغ النهائي تركيزات الجلوكوز 5 مم وبيروفات 1 مم.
   2. مكان قاسمة 50 مل الإعلام قاعدة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. إعداد حل تحلل، للأنسجة كوانتيتيشن في نهاية التحليل، والتمويه بإضافة قاعدة تريس إلى 10 ملم، والبولي إيثيلين غليكول ثالثي-أوكتيلفينيل الاثير إلى 0.2% (v/v)، وادتا إلى 1 ملم، كل ما في ddH₂ميكس O. حتى كافة المكونات تماما بحل وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
3. بروتوكول المتقدرية الإجهاد، تعد أسهم ميكرومتر 11 من أوليجوميسين، مثبط ATP Synthase، حلت في وسائل الإعلام قاعدة لاستهداف تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في البئر. إعداد أسهم 11 ميكرومتر الكربونيل السيانيد--4--(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، عامل يفصل، حلت في وسائل الإعلام قاعدة لاستهداف تركيز نهائي من 1 ميكرومتر في البئر. إعداد كوكتيل مثبطات سلسلة نقل الإلكترون، والروتينون، وأنتيميسين أ (RAA) عن طريق إضافة والروتينون 11 ميكرومتر وأنتيميسين أ إلى 22 ميكرومتر، حلت في وسائل الإعلام قاعدة لاستهداف تركيز نهائي والروتينون ميكرومتر 1 و 2 ميكرومتر أنتيميسين أ في جيدا.
4. للبروتوكول، وتحلل إعداد مخزون 220 ملم من الجلوكوز المذاب في قاعدة وسائل الإعلام، وتستهدف تركيز نهائي من 20 مم في البئر. كما تعد مخزون 1.1 م 2-ديوكسيجلوكوسي (2-المديرية العامة)، ومثبط تنافسي للسكر وخصم glycolytic، قبل حلها في الوسائط الأساسية. وسيستهدف هذا تركيز نهائي من 100 مم 2-المديرية العامة في البئر.

3-أداة المعايرة

1. لمعايرة الأجهزة مقايسة الجريان خارج الخلية، أضف 1 مل من محلول المعايرة لكل بئر من خرطوشة الاستشعار (مجموع الآبار 24) واحتضان في 37 درجة مئوية في CO₂-الحرة حاضنة بين عشية وضحاها (أو على الأقل ح 8).
2. تحميل إضافات للبروتوكول الإجهاد المتقدرية أو بروتوكول تحلل في كل منفذ حاقن، أ إلى د، على استشعار خرطوشة، التكيف للتغيرات في الحجم في البئر.
   ملاحظة: على سبيل مثال، تشمل مقايسة نموذجية ميليلتر 45 من مادة مضافة إلى أول ميناء حاقن، ميليلتر 49.5 في الثانية، ميليلتر 54.5 في ميليلتر الثالثة، و 60 إلى آخر، على افتراض وحدة تخزين جيدا أولية من 450 ميليلتر.
3. أثناء تجارب عدة الأول، تحميل الوسائط قاعدة منفذ A لقياس مقدار حركة الأنسجة/الحرفية يحدث بعد حقنه منفذ.
4. تسمح لوحة الاستشعار محملة احتضانها في 37 درجة مئوية في حاضنة غير CO₂ لمدة 60 دقيقة على الأقل.

4-عزل نسيج الشبكية الماوس جديدة

ملاحظة: هذه الخطوة مقتبسة من أسلوب الدكتور باري وينكلر¹⁵.

1. بعد إدارة التخدير العميق استخدام كوكتيل الكيتامين/xylazine قياسية، euthanize الفئران بخلع عنق الرحم.
2. استخدام زوج من الملقط منحنى المتوسطة على فهم العالم الخلفي في العصب البصري وتطبيق الضغط إلى الأمام بلطف إلى برتوس العين (الشكل 1A).
   1. مع شفرة حلاقة نظيفة، إنشاء شق ليمبوس إلى ليمبوس عبر القرنية باستخدام ممر واحد ومتعمدة من الشفرة.
   2. استخدام غرامة، قرصه الزاوية طراز ماكفرسون الملقط، العالم الخلفي للتعبير عن العدسة والأغشية الوثيرة الأمامي من شق القرنية. تجاهل هذه الأنسجة.
   3. كرر المناورة معسر مع الملقط للتعبير عن الشبكية العصبية.
   4. استخدام الملقط مثل ملعقة رفع شبكية العين، بدلاً من أن يمسك الأنسجة، نقل الشبكية بعيداً عن شق القرنية ومكان مباشرة إلى وسائل الإعلام الحار في طبق 3 سم أو صفيحة كتلة زراعة الأنسجة 6-جيدا.
3. استخدام اثنين من أزواج من الملقط ماكفرسون على غرار غرامة، والزاوية بلطف تشريح زجاجي المتبقية من الشبكية. وهذا هو الأفضل القيام باستيعاب زجاجي على هامش كأس الشبكية وسحب نحو المركز، مع ديسينسيرشن نهائي للجسم الزجاجي من المركز ككل. استخدام الملقط، إزالة أي ظهارة صباغ الشبكية المتبقية من سطح الشبكية مستقبله.
   1. قص تلميح بيبيت P1000 بشفرة حلاقة لإنشاء افتتاح ~ 4 ملم لمنع الصدمات لا مبرر له لنسيج الشبكية الحساسة أثناء نقل هذه المناورات.
   2. نقل نسيج الشبكية معزولة في وسائط جديدة باستخدام تلميح بيبيت P1000 قص.
   3. قطع اللكمات 1 مم من الشبكية حول العصب البصري مع خزعة 1 مم لكمه مزودة بالمكبس لإزاحة الأنسجة في حالة يصبح قدمت إلى تتحمل (الشكل 1B). تعيين اللكمات الشبكية جانبا في وسائل الإعلام نظيفة أبقى على كتلة 37 درجة مئوية أو تدفئة وسادة.

5-فحص بروتوكول

1. نقل اللكمات الفردية إلى ميكروسكوبية التقاط جزيرة 24-جيدا استخدام تلميح P1000 قص، يسفط ميليلتر 450 من وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الأنسجة.
2. استخدام غرامة، الملقط مستقيم للتلاعب بلطف اللكمات داخل المركز من الميكروسكوبية. الاحتفاظ باللكمات الموجه في نفس اتجاه (مثلاً، العقدة خلية الجانب صعودا).
   1. ضع لوحة الاستيلاء على وسادة تدفئة أو التسخين مجموعة كتلة إلى 37 درجة مئوية، يتم تكرار هذه الخطوات للعينات المتبقية.
      ملاحظة: لكل تجربة، جانبا 3-4 آبار فارغة مع 450 ميليلتر من قاعدة وسائل الإعلام لتكون بمثابة عناصر سلبية. في 20-21 الآبار المتبقية، اختبار كل تكرار بيولوجي في ثلاث نسخ. ولهذا سيسمح لتسجيل كل لوحة 24-جيدا من الحيوانات المختلفة أو ظروف العلاج من 6-7.
3. تجنب فقاعات الهواء، الموقف بلطف الجزيرة التقاط إدراجات مش في كل منها أيضا استخدام الملقط وتأمين تدرج مع المكبس معدني أو بتلميح بيبيت P1000 قطع (الشكل 1 ج).
   ملاحظة: تجنب حركة الأنسجة المفرط أثناء هذه الخطوة الحفاظ على موقف لكمه الشبكية داخل المركز ميكروتشامبير عينة. فقاعات الهواء شدة تشويه قراءات التعرف الضوئي على الحروف. على الرغم من أن ميكروتشامبير عمق كاف لاستيعاب الماوس المعتاد الشبكية (الشكل 1)، أحياناً قد يتسبب في عيوب القطع في يدخل مش الأنسجة تصبح ضغط مفرط أثناء الإدراج الشاشة. إذا حدث هذا، ببساطة تقديم مذكرة من الأنسجة سحقت واستبعاد تلك العينة من التحليل النهائي.
4. احتضان لوحة الأنسجة في 37 درجة مئوية CO₂-حاضنة مجاناً لمدة 60 دقيقة على الأقل.
5. برنامج محلل الجريان خارج الخلية باستخدام مزيج، والانتظار، والتدبير، وتكرار الأوامر. على سبيل مثال، قد تتضمن تجربة نموذجية مع نسيج الشبكية التالية: مزيج 2 دقيقة وانتظر دقيقتين وقياس مدة 5 دقائق. تكرار التجربة مع هؤلاء الثلاثة خطوات بين 5-8 مرات (دورات) لتسجيل خط أساس، وبعد حقن لكل مجمع يجري اختبارها أثناء التشغيل.
6. اضغط على زر بدء البرنامج على محلل التدفق خارج الخلية، واتبع الإرشادات على الشاشة لإدراج خرطوشة استشعار للمعايرة.
7. في نهاية المعايرة، اتبع الإرشادات على الشاشة لتحل محل لوحة كاليبرانت مع اللوحة التي تحتوي على عينات الشبكية.
8. السماح للبرنامج بتشغيل، حسب ما هو مبرمج. عند انتهاء التشغيل، اتبع الإرشادات على الشاشة لإخراج لوحة الأنسجة. قم بعرض نتائج التشغيل وتخزين ملف البيانات.
9. مع بنت قياس 20 إبرة والملقط، إزالة جميع مش إدراجات من الآبار، تاركين لكمه الشبكية.
10. عناية نضح وسائل الإعلام من الأنسجة وغسل الأنسجة مرتين مع 0.5 مل من المحلول الملحي الباردة مخزنة الفوسفات (PBS). نضح برنامج تلفزيوني بعد الغسيل.
11. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل لكل بئر وبيبيت صعودا وهبوطاً لمجانسة الأنسجة.
12. كوانتيتاتي مستويات المدخلات على أساس مجموع مزدوج تقطعت الحمض النووي (dsDNA) أو محتوى البروتين الكلي.
    ملاحظة: التالي يستند إلى مقايسة دسدنا متاحة تجارياً.
13. تمييع تفكيك عينات 1:1 بإضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) ونقل 100 ميليلتر من العينة المخففة للوحة جيدا 96.
    1. إضافة 100 ميليلتر من الكشف عن المخزن المؤقت في كل بئر. وبعد الخلط لمدة 2-5 دقائق، كوانتيتاتي fluorescence بعد الإثارة في 480 نانومتر والانبعاثات في 520 نانومتر، مقارنة لمنحنى قياسي.
    2. تطبيع تعقب التدفق خارج الخلية الخام إلى محتوى الحمض النووي داخل البئر.
       ملاحظة: في النتائج المعروضة هنا، يتم تطبيع عينات إلى 50 نانوغرام دسدنا-كمية نموذجية لكمه شبكية 1 مم. ولذلك، يمكن مقارنة القيم المطلقة المقدمة هنا إلى دراسات عرض البيانات "لكل لكمه الشبكية". تطبيع وسم بمعيار داخلية، مثل تشغيل خط الأساس بتركيز جلوكوز 5 ملم.

النتائج

باستخدام تقنيات وصف (الملخصة في الشكل 1)، explants الشبكية من 8 أسبوع البرية نوع (WT) الفئران كانت مقارنة بالعمر والخلفية مطابقة ترانسدوسين فارغة الفئران (Gnat1^--/--). للحيوانات^-/- Gnat1تفتقر إلى إليه لإغلاق دوري النوكليوتيدات بوابات قنوات أي?...

Discussion

التعرف الضوئي على الحروف وعكر تقاس بسهولة في نسيج الشبكية اكسبلانتيد باستخدام بيواناليزير استخدام الأساليب الموصوفة. ينطلق هذا الأسلوب من الفئات الأخرى في العديد من الخطوات الحاسمة. الأنسجة الشبكية المعزولة من خلال شق القرنية كبير دون انوكليتينج الكرة الأرضية، وصف أصلاً وينكلر

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals