细胞外通量分析技术在视网膜组织外种中的能量代谢测定

摘要

该技术描述了使用细胞外助焊剂分析仪实时记录小鼠视网膜组织的耗氧量和细胞外酸化率。

摘要

高敏锐度视觉是一个消耗大量能源的过程, 视网膜已经开发了几个独特的适应, 以精确地满足这些需求, 同时保持视觉轴的透明度。这种微妙平衡的扰动会导致致盲疾病, 如糖尿病视网膜病变。因此, 了解疾病期间视网膜能量代谢的变化, 对于开发合理的治疗各种原因的粘滞丢失至关重要。最近出现的商业细胞外通量分析仪使视网膜能量代谢的研究更容易获得。该协议描述了使用这种分析仪来测量通过其两个主要武器-氧化磷酸化和糖酵解-通过量化氧气消耗率 (ocr) 和细胞外的变化对视网膜能量供应的贡献酸化率 (ecar) 作为这些途径的代理。这项技术很容易在视网膜组织的移植中进行, 有助于在一个实验中评估对多种药理制剂的反应。利用该方法将缺乏棒光感受器信号的动物视网膜的代谢特征与野生型对照进行了比较。这项技术的一个主要局限性是缺乏区分光适应和暗适应能量利用的能力, 这是视网膜组织中的一个重要的生理考虑因素。

引言

视网膜是中枢神经系统中能量要求最高的组织之一 1.与大多数组织一样, 它通过细胞溶胶中的糖酵解或线粒体中的氧化磷酸化生成三磷酸腺苷 (atp)。氧化磷酸化比糖酵解产生 atp 的高能优势是显而易见的:36 分子的 atp 产生的前者与2分子产生的 atp产生后者。因此, 视网膜神经元主要依靠线粒体呼吸来获得能量供应, 这反映在它们的高密度线粒体²上。然而, 即使氧气丰富, 视网膜也严重依赖糖酵解机械。奥托尔·沃堡3号最初在癌细胞中描述了这种有氧糖酵解的过程, 他曾经指出, 视网膜是唯一能够产生这种代谢形式的有丝分裂后组织.自从这些初步观察, 许多有丝分裂后的组织已被描述为从事不同程度的糖酵解, 除了氧化磷酸化, 以满足他们的 atp 需求。

光转导、视觉色素回收、光感受器外段的生物合成和突触活动都是光感受器中的能量要求过程, 是视网膜中的主要神经元亚类。但在神经元¹中, 积极地根据其电梯度和浓度梯度运输离子的需要是迄今为止最有活力的消耗过程。光感受器是一种特殊的神经元, 因为它们在没有刺激的情况下 (即在黑暗中) 会去极化, 而光刺激会触发通道闭合和随后的超极化。因此, 在黑暗中, 视网膜消耗大量的 atp 来维持其去极化或通常所说的 "暗流"。从适应性的角度来看, 提供大量 atp 的一个主要挑战是生物体需要通过光轴保持视觉清晰度。在现代生物中看到的倒置视网膜结构是主要的解决方案, 因为它使密集的毛细管网络远离光的路径提供光感受器。但这种自然生物工程的奇迹使视网膜在代谢储备方面处于悬崖状态。即使是对视网膜的小侮辱, 也有可能破坏能源供应与需求的微妙平衡, 视觉功能障碍或坦率失明可能会很快接踵而至。

鉴于神经视网膜独特的能量需求, 再加上其对血管供应的严格限制, 准确测量视网膜中 atp 的消耗及其在疾病期间的变化可能对理解和治疗产生深远的影响。致盲疾病, 如视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变。传统上, 这些测量需要昂贵的、定制设计的设备, 大多数研究来自于少数完全致力于测量代谢活动^{2,5, 6、 7,8}。技术包括针对特定代谢物的单独检测、使用无线电标记前体的示踪剂研究、使用克拉克电极的耗氧量记录以及代谢组学特征^{分析 9}。

随着高通量技术的进步和商业设备供应的增加, 记录视网膜代谢的技术越来越容易获得, 而且价格也越来越实惠。这里描述的方法测量氧化磷酸化和糖酵解在视网膜使用解释组织和一个商业上可用的细胞外通量分析仪^{9,10,11, 12.}该分析仪单独记录耗氧率 (ocr) 和细胞外酸化率 (ecar), 分别作为氧化磷酸化和糖酵解的间接指标 13.这些测量是通过一个埋在所关注组织上的微腔内的探针完成的。这种对先前公布的方法的调整使用了最初为朗格汉胰岛设计的捕获板, 记录小鼠视网膜小的圆形部分的代谢活动。由于该系统包含每个样品井的4个注射端口, 因此在一次记录过程中, 可以将多种药物暴露传递给组织。使用该系统与单独的协议优化 ecar 和 ocr 记录, 野生类型视网膜的反应可以比较视网膜缺乏传感器(gnat1-/^-), 一个先天性固定夜盲症的原因人类^14.

研究方案

这些议定书遵循了《动物使用视觉和眼科研究声明》, 并得到了华盛顿大学的批准。

1. 动物准备

1. 将动物放在标准的住房中, 有12小时的黑暗到12小时的光循环。在标准化时间开始实验, 以避免生理影响, 通常在早晨打开灯后不久。

2. 解决方案准备

1. 在双蒸馏 h2o (ddh2o₎中溶解8.4 毫克粉末介质, 并使用 hcl 或 naoh 将 ph 值调整到 7.4, 最终体积为 1 l. 滤清器, 用0.22 微米的组织培养过滤器对该溶液进行灭菌。
   1. 在培养基中加入 1 m 葡萄糖和 100 mm 丙酮酸钠, 以达到 5 mm 葡萄糖和 1 mm 丙酮酸的最终浓度。
   2. 在37°c 的水浴中放置50毫升的基介质。
2. 准备裂解溶液, 用于在通量分析结束时进行组织定量, 方法是将 tris 碱添加到 10 mm, 聚乙二醇叔八丁醚添加到 0.2% (v/v), edta 添加到 1 mm, 所有在 ddh_{2o 中}混合, 直到所有成分完全溶解并进行调整ph 值为8.0。
3. 对于线粒体应激协议, 准备一份11μm 的寡霉素, 一种 atp 合酶抑制剂, 溶解在基础介质中, 以达到井内1微米的最终浓度。制备一份11μm 的碳基氰化物-4-(三氟甲基氧) 苯氨 (fccp), 一种溶解在基介质中的分离剂, 以达到井内1微米的最终浓度。通过将鱼烯酮添加到 11μm, 将抗霉素 a 添加到 22μm, 在基介质中溶解, 以达到井中1微米的最终浓度为1μm 的鱼藤酮和2μm 的抗霉素 a, 制备电子转运链抑制剂、鱼藤酮和抗霉素 a (raa) 的混合物。
4. 对于糖酵解协议, 准备一个 220 mm 的葡萄糖库存溶解在基础介质中, 以井内的最终浓度为 20 mm 为目标。还准备一个 1.1 m 库存的 2-脱氧葡萄糖 (2-dg), 葡萄糖和糖酵解拮抗剂的竞争抑制剂, 通过溶解它在基础介质。这将以井内 100 mm 2-dg 的最终浓度为目标。

3. 仪器校准

1. 要校准用于细胞外通量检测的仪器, 请在传感器盒的每口井 (共24口) 上添加1毫升的校准溶液, 并在37°c 时在无 co 2孵化器中孵育一夜 (或至少 8小时)。
2. 将线粒体应力协议或糖酵解协议的添加剂加载到传感器墨盒上的每个喷射器端口 a 至 d 中, 根据井体的体积变化进行调整。
   请注意:例如, 一个典型的检测方法将包括45μl 的添加剂进入第一个喷射器端口, 49.μl 进入第二个, 54.5μl 进入第三个端口, 60μl 进入最后一个端口, 假设初始井量为450μl。
3. 在最初的几个实验中, 将基基介质加载到端口 a 中, 以测量端口注入后发生的组织运动/人工制品的数量。
4. 允许加载的传感器板在37°c 下在非 co₂孵化器中孵育至少60分钟。

4. 新鲜小鼠视网膜组织的分离

请注意:这一步是根据巴里·温克勒博士¹⁵的技术改编而成的。

1. 使用标准的酮胺/木糖鸡尾酒进行深度麻醉后, 用颈椎脱位对小鼠进行安乐死。
2. 使用一对中等大小的弯曲钳抓住视神经的后地球, 轻轻地施加向前压力, 以推进眼睛 (图 1 a)。
   1. 用干净的剃须刀刀片, 使用刀片的单一、故意的传递, 创建一个限制, 在角膜上的边缘切口。
   2. 使用精细的角度麦克弗森式的钳子, 捏后地球, 以表达镜头和前透明质膜的角膜切口。丢弃这些纸巾。
   3. 用钳子重复夹紧动作来表达神经视网膜。
   4. 使用像勺子一样的钳子来抬起视网膜, 而不是抓住组织, 将视网膜从角膜切口移开, 并直接放入3厘米的盘子或6孔组织培养团块板的温暖介质中。
3. 使用两对细, 角度麦克弗森风格的钳子轻轻地解剖剩余的玻璃体从视网膜。最好是抓住视网膜杯外围的玻璃体, 向中心拉, 最后将玻璃体从整体中心插入。使用钳子, 从视网膜的光感受器表面去除任何残留的视网膜色素上皮。
   1. 用剃须刀片切割 p1000 管尖, 形成一个 ~ 4 毫米的开口, 以防止在转移过程中对精致的视网膜组织造成不应有的创伤。
   2. 使用切割的 p1000 管尖将分离的视网膜组织转移到新鲜培养基中。
   3. 用装有柱塞的1毫米活检冲床在视神经周围切割1毫米的视网膜, 以移出组织, 以防组织卡入孔中 (图 1b)。将视网膜拳脚放在保存在37°c 块或加热垫上的清洁介质中。

5. 检测协议

1. 使用切割的 p1000 尖端将单个冲孔转移到24口胰岛捕获微板上, 与组织一起吸气450μl 的培养基。
2. 使用精细的直钳轻轻地操纵在微板中心的冲孔。保持拳击方向朝同一方向 (例如, 神经节细胞侧向上)。
   1. 将捕获板放在加热垫或加热块上, 设置为 37°c, 因为剩余样品重复执行这些步骤。
      请注意:对于每个实验, 留出3-4 个带有450μl 基介质的空白井作为负控制。在剩余的20-21 口井中, 测试每一个生物复制一式三份。因此, 每个24孔板将允许记录从6-7 种不同的动物或处理条件。
3. 避免气泡, 使用钳子轻轻将胰岛捕获网格插入每口井, 并用金属柱塞或切割 p1000 管头固定刀片 (图 1c)。
   请注意:在这一步中避免过度的组织运动, 以保持视网膜冲孔位置在样品微室的中心。气泡严重扭曲 ocr 读数。尽管微室有足够的深度来容纳典型的小鼠视网膜 (图 1c), 但在网格插入物中偶尔会出现加工缺陷, 可能会导致组织在屏幕插入过程中过度压缩。如果发生这种情况, 只需记下压碎的组织, 并将该样本排除在最终分析之外。
4. 将组织板孵育 37°c co 2 无孵化器至少60分钟。
5. 使用 "混合"、"等待"、"测量" 和 "重复" 命令对细胞外流量分析仪进行编程。例如, 视网膜组织的典型实验可能包括以下内容: 混合 2分钟, 等待 2分钟, 测量5分钟。在以下三个步骤中重复实验, 进行基线记录5-8 次 (周期), 并在注入每个化合物后在运行过程中进行测试。
6. 按下细胞外磁通分析仪上的程序开始按钮, 然后按照屏幕上的说明插入传感器墨盒进行校准。
7. 校准结束时, 请按照屏幕上的说明, 将校准板替换为包含视网膜样本的板。
8. 允许程序运行, 如编程的那样。运行完成后, 按照屏幕上的说明弹出组织板。查看运行的结果并存储数据文件。
9. 用弯曲的20规格针和钳子, 从井上取出所有的网状刀片, 留下视网膜冲床。
10. 小心地从组织中吸气, 用0.5 毫升的冷磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗组织两次。清洗后吸收 pbs。
11. 在每个井中加入100μl 的裂解缓冲液, 上下移液, 使组织均匀。
12. 根据总双链 dna (dsdna) 或总蛋白质含量定量输入水平。
    请注意:以下是基于商业上可用的 dsdna 检测。
13. 稀释裂解样品 1:1, 加入100μl 的 tris-edta (te) 缓冲液, 并将稀释样品的100μl 转移到96井板上。
    1. 在每口井中添加100μl 的检测缓冲液。混合2-5 后, 在 480 nm 和 520 nm 的发射时定量荧光, 与标准曲线进行比较。
    2. 将对井内 dna 含量的原始细胞外通量追踪进行归一化。
       请注意:在这里给出的结果中, 样本被归一化为50纳克 dsdn--这是1毫米视网膜冲床的典型量。因此, 这里提出的绝对值可以与 "每个视网膜打孔" 数据的研究相比较。归一化对内部标准的跟踪, 例如在 5 mm 的葡萄糖浓度下运行基线。

结果

利用所述技术 (如图 1所示), 将8个一周龄野生小鼠的视网膜外植体与零小鼠 (gnat1-/^-)的年龄和背景匹配的传感器进行了比较. 由于gnat1--/^-动物缺乏关闭环核苷酸门控离子通道以响应光刺激的机制, 它们的棒光感受器即使在光14中也能保持去极化状态.随后需要保持钾的流出将产生大量的 atp 需求, 导致...

讨论

ocr 和 ecar 很容易测量在解释视网膜组织使用生物分析仪使用所述的技术。此方法在几个关键步骤中与其他组的方法不同。视网膜组织是通过一个大的角膜切口分离而不是在地球上摘除的, 正如温克勒^{15 最初}所描述的那样。这种视网膜隔离方法允许从活眼快速转移到组织捕捉板 (通常在5分钟内)。在整个过程中, 组织保持在 37°c, 比放在冰上时更好地保持细胞呼吸。使用最少添加剂?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals