Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

요약

이 기술은 산소 소비와 세포 외 산성화 속도 explanted 마우스 망막 조직 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 실시간으로 녹음을 설명 합니다.

초록

높은 시력 비전 무 겁 게 에너지 소모 하는 프로세스 이며 망막 정확 하 게 시각적 축의 투명성을 유지 하면서 이러한 요구를 충족 하기 위해 여러 가지 독특한 적응을 개발 했다. 이 섬세 한 균형에 섭 눈부신 질병, 당뇨병 성 망막 증 등 원인. 따라서, 질병 중 에너지 대사 변화는 망막에 이해 vison 손실의 다양 한 원인에 대 한 합리적인 치료의 발전에 필수적입니다. 상용 세포 외 유출 분석기의 최근 출현은 망막 에너지 대사의 연구를 더 접근 했다. 이 프로토콜은 산소 소비 속도 (OCR)에 변화를 측정 하 여 측정 하는 그것의 2 개의 원리 팔-산화 인 산화 및 분해-통해 망막 에너지 공급에 기여 하는 등 분석기의 사용을 설명 합니다 및 세포 외 산성화 요금 (ECAR)이이 경로 대 한 프록시. 이 기술은 단일 실험에서 여러 pharmacologic 에이전트에 대 한 응답의 평가 촉진 explanted 망막 조직에 쉽게 수행 됩니다. 이 메서드를 사용 하 여 야생-타입 컨트롤 막대 포토 리셉터 신호 부족 한 동물에서 망막에서 대사 서명은 비교 됩니다. 이 기술은 주요 한계 빛 적응 하 고 dark-adapted 에너지 이용, 망막 조직에 중요 한 생리 적인 고려 사항 사이 구별할 수 있는 능력의 부족 이다.

서문

망막은 중추¹에서 가장 에너지 요구 하는 조직 중 하나입니다. 대부분 조직 같이 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 통해 분해 cytosol 또는 통해 산화 인 산화에서 미토 콘 드리 아에서 생성합니다. 포도 당 한 분자에서 ATP를 생산 하기 위해 분해 산화 인 산화의 활기찬 장점은 분명 하다: 후자에서 생성 된 ATP의 2 분자는 전 대 에서 생성 된 atp 36 분자. 따라서, 망막 신경 세포는 주로 에너지 공급에 대 한 미토 콘 드리 아 호흡에 따라,이 미토 콘 드리 아²의 그들의 높은 밀도 의해 반영 됩니다. 그러나, 망막 또한 무 겁 게에 의존 glycolytic 기계 산소 풍부한 경우에 합니다. 이 과정은 호 기성 분해 원래 오토 바르 부르 크³, 한 번 망막이이 형태의 대사⁴수만 포스트 mitotic 조직 이었다고 언급 하 여 암 세포에 설명 했다. 그 초기 관측 이후 많은 포스트 mitotic 조직 그들의 ATP 요구를 충족 시킬 뿐만 아니라 산화 인 산화 분해의 다양 한 각도에 종사 하 설명 했습니다.

Phototransduction, 시각적인 안료 재활용, 포토 리셉터 외부 세그먼트, 및 시 냅 시스 활동의 생 합성 하는 대뇌, 망막의 우세 신경 하위 클래스에서에서 모든 에너지 요구 프로세스. 하지만 적극적으로 그들의 전기에 대 한 이온 농도 기온 변화도 수송 하는 필요 지금까지 신경¹에서 가장 정력적으로 소모 되는 과정입니다. 대뇌는 가벼운 자극 유발 채널 폐쇄 및 후속 hyperpolarization 반면 그들은 (즉, 어둠 속에서), 자극의 부재에서 depolarized는 의미에서 독특한 신경. 따라서, 어둠, 망막 대량의 ATP의 도발은 또는 "전류"로 일반적으로 불리는를 유지 하기 위해 사용 합니다. 적응의 관점에서 이러한 방대한 양의 ATP 공급 하는 주요 과제 광 축 통해 시각적 선명도 유지 하기 위해 유기 체를 위한 필요 이다. 현대 생물에서 거꾸로 망막 아키텍처는 지배적인 솔루션 공급 하는 빛의 경로에서 대뇌 조밀한 모 세관 네트워크 유지. 하지만 자연 생명 공학의이 놀라운 변화 준비에서 절벽에 망막 장소. 망막에도 작은 모욕 잠재적 수요, 에너지 공급의 섬세 한 균형을 혼란 시킬 수 있다 그리고 시각 장애 또는 솔직 실명 빠르게 ensue 수 있습니다.

혈관 공급의 그것의 단단한 제한 함께 신경 망막의 독특한 에너지 수요를 감안할 때 질병 동안 망막 및 그것의 변화에서 ATP 소비의 정확한 측정 이해 하 고 치료에 깊은 의미를 가질 수 있습니다. 당뇨병 성 망막 증 망막 화 등 눈부신 조건. 전통적으로, 이러한 측정 신진 대사 활동^2,5,6,^{의 측정에 전적으로 헌신 하는 실험실의 소수에서 나오는 대부분의 연구 비용이 많이 드는, 맞춤형 장비를 필요로 7,8}. 기술은 특정 대사 산물, 라디오 라는 선구자, 클라크 전극, 및⁹를 프로 파일링 하는 metabolomic를 사용 하 여 녹음 하는 산소 소비를 사용 하 여 추적 연구에 대 한 개별 분석을 포함 한다.

진보와 함께 높은 처리 기술 및 상용 장치의 증가 가용성, 기술 기록 망막 물질 대사에 점점 접근 가능 하 고 저렴 한 있습니다. 여기 설명 하는 방법을 모두 산화 인 산화 하 고 망막을 사용 하 여 분해 explanted 조직 및 상용 세포 외 유출 분석기^9,10,,1112. 이 분석기는 별도로 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR), 산화 인 산화 및 분해, 각각¹³의 간접 지표 역할을 기록 합니다. 이러한 측정은 관심의 조직에 만든 microchamber 내 submersed 프로브에 의해 수행 됩니다. 이전에 게시 방법의이 적응이 원래 췌 장 독도 Langerhans 위한 캡처 플레이트를 사용 하 여 마우스 망막의 작은, 원형 섹션에서 신진 대사 활동을 기록. 다중 pharmacologic 노출 시스템 각 샘플에 대 한 4 주입 포트를 잘 포함 되어 있기 때문에 단일 기록의 과정에서 조직에 전달할 수 있습니다. 별도 프로토콜 ECAR 및 OCR 녹음/녹화에 대 한 최적화 된이 시스템을 사용 하 여, 야생-타입 망막의 반응을 비교 될 수 있다 망막 (Gnat1^-/-), transducin 부족에 선 천 성 고정 야 맹 증의 원인 인간¹⁴.

프로토콜

프로토콜 비전에서 연구를 위한 협회와 동물의 사용에 대 한 안과 문을 고 워싱턴 대학에 의해 승인 했다.

1. 동물 준비

1. 동물에에서 계속 12 시간으로 표준 주택 어두운 12 시간 빛 주기. 시작에서 실험 시간을 잠시 후 조명이 켜져 아침에 일반적으로 circadian 효과 피하기 위해 표준화.

2. 솔루션 준비

1. 8.4 mg 더블 소 주 H₂O 가루 미디어 (ddH₂O)를 용 해 하 여 기본 미디어 준비 7.4 HCl 이나 NaOH를 pH 조정, 1의 최종 볼륨을 L. 필터 0.22 μ m 조직 문화 필터와 함께이 솔루션을 소독.
   1. 1 M 포도 당 및 100 m m 5 mM 포도 당의 최종 농도 달성 하기 위해 미디어에 나트륨 pyruvate 그리고 1 mM pyruvate를 추가 합니다.
   2. 장소는 37 ° C 물 목욕에서 기본 미디어의 50 mL 약 수.
2. 10 m m, 0.2% (v/v), 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르 그리고 ddH₂오 믹스까지 모든 구성 요소는 완전히 해산 하 고 조정에 모두 1 mm EDTA를 기본 트리를 추가 하 여 세포 솔루션, 유출 분석의 끝에 조직의 정량에 대 한 준비 8.0 산 도입니다.
3. 미토 콘 드리 아 스트레스 프로토콜 oligomycin, ATP Synthase 억제제, 우물에 1 µ M의 최종 농도 대상으로 기본 미디어에 녹아의 11 µ M 재고를 준비 합니다. 카보닐기 시안-4-(trifluoromethoxy)의 11 µ M 재고 준비 잘에서 1 µ M의 최종 농도 대상으로 기본 미디어에 녹아 있는 phenylhydrazone (FCCP), 연결을 푸는 에이전트. 전자 전송 체인 억제제로 테 논과 antimycin로 테 논 11 µ M 및 22 µ m, antimycin A 추가 하 여 A (RAA)의 칵테일을 준비 기본 미디어를 대상으로 1 µ M로 테 논 및에서 2 µ M antimycin A의 최종 농도에 용 해는 잘.
4. 분해 프로토콜에 대 한 포도 당 우물에서 20 mM의 최종 농도 대상으로 기본 미디어에 녹아의 220 m m 재고를 준비 합니다. 또한 기본 미디어에 용 해 하 여 포도 당과 glycolytic 적 경쟁 억제 물, 2-deoxyglucose (2-DG)의 1.1 M 재고 준비 합니다. 이 우물에서 100 m m 2-DG의 최종 농도 대상으로 합니다.

3. 계측기 교정

1. 보정 세포 외 유출 분석 결과 대 한 계측, 센서 카트리지 (24 웰 스 총)의 각 음을 교정 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 CO₂에서 37 ° C에서 품 어-무료 보육 하룻밤 (또는 적어도 8 h).
2. 각 인젝터 포트, D, A에 우물에서 볼륨 변경에 대 한 조정 센서 카트리지, 미토 콘 드리 아 스트레스 프로토콜 또는 분해 프로토콜에 대 한 첨가제를 로드 합니다.
   참고: 예를 들어, 일반적인 분석 결과 첫 번째 인젝터 포트에 첨가물의 45 µ L, 두 번째, 마지막으로 세 번째, 및 60 µ L에 54.5 µ L 450 µ L의 초기 잘 볼륨을 가정으로 49.5 µ L 포함 됩니다.
3. 첫 번째 몇 가지 실험 하는 동안 기본 미디어 포트 A 포트 주입 후 발생 하는 얼마나 많은 조직 운동/인 게이지를 로드.
4. 적어도 60 분 동안 비 CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 품 어를 로드 센서 플레이트를 허용 합니다.

4. 신선한 마우스 망막 조직 격리

참고: 이 단계는 박사 배리 Winkler¹⁵의 기술에서 적응.

1. 표준 케 타 민/xylazine 칵테일을 사용 하 여 깊은 마 취 관리, 후 경부 전위에 의해 마우스를 안락사.
2. 중간 크기의 굽은 집게의 쌍을 사용 하 여 시 신경에서 후부 세계를 파악 하 고 부드럽게 proptose 눈 (그림 1A)에 압력을 적용.
   1. 깨끗 한 면도날으로 잎의 단일, 패스를 사용 하 여 각 막에 걸쳐 limbus limbus 절 개를 만듭니다.
   2. 잘 사용 하 여 직각된 맥 퍼 슨-스타일 겸 자, 렌즈 앞쪽 hyaloid 막에서 각 막 절 개를 표현 하는 사후 세계를 꼬집어. 이러한 조직 삭제 합니다.
   3. 신경 망막을 표현 하는 집게와 곤란 하 게 책략을 반복 합니다.
   4. 조직 파악 보다는 망막을 들어 숟가락 처럼 집게를 사용 하 여, 각 막 절 개에서 망막을 전송 하 고 3 cm 접시 또는 6 잘 조직 문화 클러스터 접시에 따뜻한 미디어에 직접 배치.
3. 괜 찮 아 요, 각 맥 퍼 슨 스타일 집게의 두 쌍을 사용 하 여 부드럽게 나머지 유리 체 망막에서 해 부. 이것은 최고의 유리 체 망막 컵의 주변에서 파악 하 고 전체적으로 센터에서 유리 체의 마지막 disinsertion와 중심 쪽으로 당기에 의해 이루어집니다. 집게를 사용 하 여 망막의 포토 리셉터 표면에서 어떤 잔여 망막 안료 상피를 제거 합니다.
   1. P1000 피펫으로 팁 ~ 4 m m 오프닝 전송 기동 중 섬세 한 망막 조직에 과도 한 외상을 방지 하기 위해 만들 면도날으로 잘라.
   2. 격리 된 망막 조직을 잘라 P1000 피펫으로 팁을 사용 하 여 신선한 미디어로 전송 합니다.
   3. 1mm 생 검으로 시 신경 주변 망막의 1 m m 펀치 펀치 구멍 (그림 1B)에 박 혀 됩니다 경우에 조직을 꺼내 려 플런저를 갖춘 잘라. 깨끗 한 미디어 블록 37 ° C에 보관 또는 열 패드에 따로 망막 펀치를 설정 합니다.

5. 분석 결과 프로토콜

1. 잘라 P1000 팁, 조직 함께 미디어의 450 µ L 발음을 사용 하 여 24-잘 섬 캡처 microplate에 개별 펀치를 전송.
2. 직선 겸 자는 미 판 중심으로 펀치를 부드럽게 조작 하 잘 사용 합니다. (예를 들어, ganglion 셀 측면 위쪽) 같은 방향으로 지향 펀치를 유지 합니다.
   1. 가 열 패드 또는 다음이 단계는 나머지 샘플에 대 한 반복 블록 세트 37 ° C에 난방에 캡처 접시 휴식.
      참고: 각 실험에 대 한 부정적인 컨트롤 역할을 기본 미디어의 450 µ L 3-4 빈 우물 옆으로 설정 합니다. 나머지 20-21 웰 스, 3 중에서 각 생물 복제를 테스트 합니다. 따라서, 각 24-잘 접시 6-7 다른 동물 또는 치료 조건에서 기록에 대 한 수 있습니다.
3. 공기 방울, 부드럽게 위치를 피하는 섬 메쉬 삽입 각 잘 집게를 사용 하 여 캡처하고 금속 플런저 또는 컷된 P1000 피펫으로 팁 (그림 1 C) 삽입을 확보 합니다.
   참고: 샘플 microchamber의 센터 내에 망막 펀치 위치를 유지 하려면이 단계 동안 과도 한 조직의 움직임을 피하십시오. 기포는 심하게 OCR 판독을 왜곡 한다. microchamber을가지고 있지만 일반적인 마우스 망막 (그림 1C)에 맞게 적절 한 깊이, 때때로 메쉬 삽입에 가공 결함 조직 화면 삽입 지나치게 압축 될 발생할 수 있습니다. 이 경우, 단순히 짓 눌린된 조직 기록 하 고 최종 분석에서 그 샘플을 제외 합니다.
4. 37 ° C 공동₂조직 접시를 품 어-적어도 60 분 동안 무료 보육.
5. 세포 외 유출 분석기, 대기, 측정, 혼합을 사용 하 여 프로그래밍 하 고 명령을 반복 합니다. 예를 들어, 망막 조직으로 전형적인 실험 다음 포함 될 수 있습니다: 믹스 2 분, 2 분 및 5 분을 측정. 이 세 가지와 실험 사이 단계 반복 5-8 시간 (주기) 기준 기록 하 고 실행 하는 동안 테스트 되 고 각 화합물의 주입 후.
6. 세포 외 유출 분석기에 프로그램 시작 버튼을 누르고 구경 측정을 위한 센서 카트리지를 삽입 하려면 화면의 지침을 따릅니다.
7. 교정의 끝에, 망막 샘플을 포함 하는 접시 calibrant 플레이트 바꿉니다 화면의 지침을 따르십시오.
8. 프로그래밍을 실행 하려면 프로그램을 허용 합니다. 실행의 완료에 조직 접시를 추출 하려면 화면의 지침을 따릅니다. 실행의 결과 데이터 파일을 저장 합니다.
9. 구부러진된 20 게이지 바늘과 포 셉으로 망막 펀치를 남겨두고 우물에서 모든 메쉬 삽입을 제거 합니다.
10. 신중 하 게 조직에서 미디어를 발음 하 고 씻어 감기 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 0.5 mL로 두 번 조직. 세척 후 PBS를 발음.
11. 각 잘을 아래로 조직 균질을 피펫으로 100 µ L의 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
12. 총 이중 가닥 DNA (dsDNA) 또는 총 단백질 함량에 따라 입력된 레벨 quantitate
    참고: 다음은 상용 dsDNA 분석 결과에 기반.
13. 트리 스-EDTA (테) 버퍼의 100 µ L을 추가 하 여 lysed 샘플 1: 1을 묽 게 하십시오 그리고 96 잘 접시에 희석된 샘플의 100 µ L를 전송.
    1. 각 잘으로 감지 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다. 2-5 분 동안 혼합 후 480 nm에서 여기 및 520에서 방출 후 형광을 quantitate nm, 표준 곡선을 비교.
    2. 잘 내 DNA 콘텐츠를 원시 세포 외 유출 추적 정상화.
       참고: 여기에 제시 된 결과에 샘플 50 ng dsDNA-1 m m 망막 펀치에 일반적인 금액을 정규화 됩니다. 따라서, 여기 절대 값 데이터 "망막 펀치"를 제시 하는 연구와 비교 될 수 있습니다. 기준선 5 mM의 포도 당 농도에 run과 같은 내부 표준 경시를 정상화.

결과

( 그림1에서) 요약 설명한 기법을 사용 하 여, 8 주 된 야생 타입 (WT) 마우스에서 망막 explants는 나이 및 배경 일치 transducin null 쥐 (Gnat1^-/-)에 비교 되었다. Gnat1^-/- 동물을 기계 부족 하기 때문에 주기적인 뉴클레오티드 문이 빛 자극에 대 한 응답에서 이온 채널, 그들의 막대 대뇌 남아 빛¹⁴에 depolarize...

토론

OCR과 ECAR explanted 망막 조직 설명 된 기술을 사용 하 여 bioanalyzer를 사용 하 여 쉽게 측정 됩니다. 이 메서드는 몇 가지 중요 한 단계에서 다른 그룹의 출발. 망막 조직 윈 클 러¹⁵에 의해 원래 기술 세계를 enucleating 없이 큰 각 막 절 개를 통해 격리 됩니다. 망막 분리의이 방법 (5 분) 안에 종종 조직 캡처 접시에 살아있는 눈에서 빠른 전송에 대 한 수 있습니다. 조직 세포 호흡을 얼음...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals