מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

Summary

טכניקה זו מתארת הקלטה בזמן אמת של צריכת החמצן ואת המחירים acidification חוץ-תאית ברקמות רשתית העכבר explanted באמצעות של מנתח השטף חוץ-תאית.

Abstract

חזון חדות גבוהה היא תהליך בכבדות הצורכים אנרגיה, הרשתית פיתחה מספר עיבודים ייחודיים לדרישות בדיוק כזה תוך שמירה על שקיפות של הציר חזותי. לפליטת כדי איזון עדין זה לגרום מחלות מסנוור, כגון רטינופתיה סוכרתית. לכן, ההבנה של האנרגיה חילוף החומרים משתנה ברשתית במהלך המחלה הכרחי להתפתחות של טיפולים רציונלי עבור גורמים שונים של אובדן vison. הופעתו האחרונה של מנתחי השטף חוץ-תאית זמין מסחרית הפך המחקר של חילוף החומרים האנרגיה ברשתית נגיש יותר. פרוטוקול זה מתאר את השימוש כזה מנתח כדי למדוד את התרומות לאספקת אנרגיה ברשתית באמצעות זרועותיה עיקרון שני - זרחון חמצוני, גליקוליזה - מאת לכימות שינויים בשערי צריכת חמצן (OCR), חוץ-תאית המחירים acidification (ECAR) כאל שליחים עבור המסלולים הללו. טכניקה זו מבוצעת בקלות ברקמת הרשתית explanted, הקלה על הערכה של התגובות מרובות סוכנים תרופתי בניסוי יחיד. חתימות מטבולית הרשתיות מחיות חסר רוד קולט אור איתות מושווים לפקדים פראי-סוג בשיטה זו. מגבלה משמעותית בטכניקה זו הוא חוסר היכולת להבחין בין ניצול האנרגיה הותאם-אור, dark-adapted, שיקול חשוב הפיזיולוגיות ברקמת הרשתית.

Introduction

הרשתית היא בין הרקמות ביותר דורש אנרגיה מערכת העצבים המרכזית¹. כמו רוב רקמות, שהיא מייצרת אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך גליקוליזה ב זרחון חמצוני ציטוזול או דרך בתוך המיטוכונדריה. היתרון האנרגטי של זרחון חמצוני על גליקוליזה לייצר ATP ממולקולה אחת של גלוקוז נקי: 36 מולקולות של ATP שנוצר מתוך לשעבר לעומת 2 מולקולות של ATP שנוצר האחרון. בהתאם לכך, הנוירונים ברשתית תלויים בעיקר נשימה מיטוכונדריאלי לאספקת אנרגיה, זה משתקף על ידי שלהם צפיפות גבוהה של המיטוכונדריה². ובכל זאת, הרשתית גם מסתמכת במידה רבה על מכונות glycolytic גם כאשר חמצן בשפע. תהליך זה של אירובי גליקוליזה תוארה לראשונה על ידי אוטו ורבורג³, מי פעם ציין, כי הרשתית הרקמה רק שלאחר mitotic מסוגל צורה זו של חילוף החומרים⁴בתאים סרטניים. מאז תצפיות ראשוניות אלה, ברקמות רבות שלאחר mitotic תוארו לעסוק בדרגות שונות של גליקוליזה בנוסף זרחון חמצוני כדי לענות על דרישותיהם ATP.

Phototransduction, פיגמנט חזותי מיחזור, ביוסינטזה של מקטעי החיצוני קולט אור, בפעילות הסינפטית הם כל התהליכים תובעניים אנרגיה photoreceptors, מחלקת המשנה השולט עצביים ברשתית. אך הצורך להעביר באופן פעיל יונים נגד שלהם חשמל ומעברי הריכוז הוא עד כה התהליך לארוך ביותר אנרגטית נוירונים¹. Photoreceptors הם נוירונים מוזר במובן שהם אינם depolarized בהיעדר גירוי (קרי, בחושך), ואילו גירוי אור מפעילה ערוץ הסגר, hyperpolarization הבאים. לכן, בחושך, הרשתית צורכת כמויות גדולות של ATP כדי לשמור על דפולריזציה או "זרם אפל" שלה, כפי שהיא מכונה בדרך כלל. מההיבט אדפטיבית, הוא אתגר גדול באספקת אלה כמויות אדירות של ATP עבור אורגניזמים לשמור על בהירות חזותית באמצעות לציר האופטי. הארכיטקטורה ברשתית הפוך אצל יצורים מודרני הוא הפתרון דומיננטי, כמו זה שומרת את הרשת נימי צפופה הספקת photoreceptors לברוח מדרכו של אור. . אבל זה מעורר פליאה bioengineering טבעי מקומות הרשתית צוק במונחים של שמורת מטבולית. עלבונות קטן אפילו לרשתית פוטנציאלי יכול לשבש את האיזון העדין של אספקת אנרגיה לדרוש, תפקוד חזותי או עיוורון פרנק עשוי לנבוע במהירות.

בהתחשב הדרישות האנרגטי הייחודי של הרשתית עצבית, בשילוב עם הגבלה חזק של אספקת הדם, מדידה מדויקת של צריכת ATP הרשתית ואת שלו משתנה במהלך המחלה עשויות להיות השלכות עמוקה תוך הבנה וטיפול מעלף מצבים כגון רטיניטיס פיגמנטוזה רטינופתיה סוכרתית. באופן מסורתי, מדידות אלה דורשים ציוד יקר, אישית מעוצבת עם רוב המחקרים מתוך קומץ של מעבדות שכולו מוקדש מדידות של פעילות חילוף החומרים^{2,5,6, 7,8}. טכניקות כוללים מבחני בודדים של המטבוליטים ספציפיים, מחקרים מעקב באמצעות התווית על-ידי רדיו סימנים מקדימים, צריכת חמצן הקלטה באמצעות אלקטרודות קלארק, ו metabolomic פרופיל⁹.

עם ההתקדמות בטכנולוגיית תפוקה גבוהה וזמינות מוגברת של התקנים מסחריים, טכניקות כדי הרשומה מטבוליזם ברשתית הם יותר ויותר נגיש וזול. השיטה המתוארת כאן מודד בשני זרחון חמצוני, גליקוליזה רשתית העין באמצעות explanted רקמות ו זמין מסחרית השטף חוץ-תאית מנתח^9,10,11,12. זה מנתח מתעדת בנפרד קצב צריכת החמצן (OCR), שער חוץ-תאית acidification (ECAR), הגשה אינדיקטורים עקיף של זרחון חמצוני, גליקוליזה, בהתאמה¹³. מדידות אלה נעשית על ידי בדיקה submersed במרחק microchamber שנוצרו על הרקמה של ריבית. זה עיבוד של שיטות שפורסמו בעבר משתמש צלחת לכידת תוכנן במקור עבור לנגרהנס בלבלב כדי להקליט את פעילות חילוף החומרים בסעיפים קטנים, עגולים של רשתית העכבר. חשיפות מרובות תרופתי יכול להיות מועברת הרקמה במהלך הקלטה יחיד כי המערכת מכילה 4 יציאות הזרקת עבור כל דגימה. טוב. באמצעות מערכת זו עם פרוטוקולים נפרד אופטימיזציה עבור הקלטות ECAR, OCR, התגובות של פראי-סוג באדמומיות ניתן להשוות הרשתיות חסר transducin (Gnat1^{- / -}), סיבת עיוורון לילה נייח מולדות ב בני¹⁴.

Protocol

פרוטוקולים עקב האגודה לחקר חזון והצהרת רפואת עיניים עבור שימוש של בעלי החיים ואושרו על-ידי אוניברסיטת וושינגטון.

1. הכנה בעלי חיים

1. לשמור חיות בדיור סטנדרטי עם 12 שעות כהה מחזור אור 12 שעות. בגין ניסויים ב סטנדרטית פעמים כדי למנוע תופעות היממה, בדרך כלל בבוקר זמן קצר לאחר אורות דולקים.

2. פתרון הכנה

1. להכין בסיס מדיה על ידי המסת 8.4 מ ג של אבקת מדיה מזוקק פעמיים H₂O (ddH₂O) להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl או NaOH, לאמצעי אחסון הסופי של 1 ל' מסנן לחטא זה פתרון עם מסנן תרביות רקמה 0.22 מיקרומטר.
   1. מוסיפים גלוקוז 1 מ' ו- 100 מ מ פירובט נתרן בכלי התקשורת כדי להשיג הסופי ריכוזי גלוקוז 5 מ מ 1 מ"מ פירובט.
   2. המקום aliquot 50 מ של אמצעי התקשורת הבסיס באמבט מים 37 º C.
2. להתכונן פירוק פתרון, רקמות כימות בסוף הניתוח השטף, על-ידי הוספת טריס בסיס 10 מ מ, פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר 0.2% (v/v), EDTA עד 1 מ"מ, כל ddH₂O. לערבב עד שכל הרכיבים התפרקה לחלוטין, להתאים ה-pH ל 8.0.
3. עבור פרוטוקול מתח מיטוכונדריאלי, להכין מלאי של מיקרומטר 11 של oligomycin, מעכב ATP סינתאז, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין מלאי של מיקרומטר 11 של ציאניד קרבוניל - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), סוכן uncoupling, מומס בסיס מדיה למטרה הסופית ריכוז 1 מיקרומטר בבאר. להכין קוקטייל של מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה, rotenone antimycin A (ראה) על-ידי הוספת rotenone 11 מיקרומטר, antimycin א 22 מיקרומטר, מומס מדיה בסיס היעד הסופי ריכוז rotenone מיקרומטר 1 ו- 2 מיקרומטר antimycin א ב טוב.
4. עבור פרוטוקול גליקוליזה, להכין מלאי 220 מ מ של גלוקוז מומס מדיה הבסיס, כדי להתמקד ריכוז סופי של 20 מ מ בתוך הבאר. גם להכין מלאי 1.1 מ' של 2-deoxyglucose (2-DG), מעכב תחרותי של גלוקוז, אנטגוניסט glycolytic, על ידי המסת זה בתקשורת הבסיס. זה יעד ריכוז סופי של 100 מ מ 2-DG בבאר.

3. מכשיר כיול

1. כדי לכייל את ומכשור וזמינותו השטף חוץ-תאית, להוסיף 1 מ"ל של כיול פתרון כל טוב של המחסנית חיישן (סה כ 24 בארות), דגירה ב 37 ° C ב- CO₂-חינם חממה לילה (או לפחות 8 שעות).
2. לטעון תוספים עבור פרוטוקול מיטוכונדריאלי מתח או בפרוטוקול גליקוליזה ליציאת כל מזרק, A עד D, שעל מחסנית חיישן, התאמת נפח שינויים בתוך הבאר.
   הערה: לדוגמה, יכלול assay טיפוסי 45 µL של תוסף ליציאת ה-מזרק הראשון, µL 49.5 לתוך השני, µL 54.5 לתוך µL השלישי, 60 לתוך האחרון, בהנחה אמצעי טוב הראשונית של 450 µL.
3. במהלך הניסויים מספר הראשון, לטעון מדיה בסיס ליציאה A לאמוד כמה רקמות תנועה/החפץ מתרחשת לאחר זריקה יציאה.
4. לאפשר את הצלחת חיישן טעון על דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה-CO₂ לפחות 60 דקות.

4. בידוד של רקמת רשתית העכבר טרי

הערה: השלב זה ממאמרו של הטכניקה של ד ר בארי ווינקלר¹⁵.

1. לאחר ניהול הרדמה עמוקה באמצעות קוקטייל קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים סטנדרטי, המתת חסד עכברים מאת נקע בצוואר הרחם.
2. השתמש זוג מלקחיים מעוקל בגודל בינוני תופסים את העולם האחורי על עצב הראייה, בעדינות קדימה אל תפעילו לחץ על proptose העין (איור 1 א').
   1. עם סכין גילוח נקי, ליצור חתך לימבוס כדי לימבוס על פני הקרנית באמצעות כרטיס יחיד, מכוונת של הלהב.
   2. שימוש בסדר, מלקחיים מקפירסון בסגנון זוויתי, צבוט הגלובוס האחורי כדי לבטא את העדשה וממברנות הקדמי hyaloid מתוך החתך הקרנית. להתעלם רקמות אלו.
   3. חזור על התמרון צובט עם מלקחיים לבטא עצביים ברשתית.
   4. עם המלקחיים כמו כפית כדי להרים את הרשתית, במקום להבין את הרקמה, העברת הרשתית מן החתך הקרנית ומניחים ישירות לתוך המדיה חמה תבשיל 3-ס"מ או צלחת אשכול 6-ובכן תרביות רקמה.
3. השתמש שני זוגות של מלקחיים מקפירסון בסגנון בסדר, בזווית לנתח בעדינות הזגוגיות שנותרו מן הרשתית. זה נעשית על ידי האוחז את הזגוגיות בפריפריה של הגביע ברשתית ומושך לכיוון המרכז, עם disinsertion הסופית של הגוף בזגוגית מהמרכז בכללותה. עם המלקחיים, הסר כל אפיתל הפיגמנט ברשתית שיורית משטח קולט אור ברשתית.
   1. חותכים טיפ pipet P1000 עם סכין גילוח כדי ליצור פתח ~ 4 מ מ כדי למנוע טראומה מיותרת לרקמת הרשתית עדין במהלך העברת תמרונים.
   2. להעביר את רקמת רשתית מבודד טריים מדיה באמצעות טיפ pipet לחתוך P1000.
   3. חותכים 1 מ"מ האגרופים של הרשתית סביב עצב הראייה עם ביופסיה 1 מ"מ אגרוף מצויד עם פומפה מכך הרקמה, במקרה זה הופך ונתקע לתוך נשא (איור 1B). הגדר את האגרופים ברשתית הצידה בתקשורת נקייה כל הזמן על בלוק 37 ° C או חימום משטח.

5. assay פרוטוקול

1. העברה אגרופים בודדים microplate לכידת 24-ובכן איון באמצעות טיפ P1000 לחתוך, כ רפה בעברית µL 450 של המדיה יחד עם הרקמה.
2. השתמש בסדר, ישר מלקחיים בעדינות לתפעל אגרופים למרכז microplate. שמור אגרופים חוקיים באותו כיוון (למשל, תא גנגליון בצד כלפי מעלה).
   1. הנח את הצלחת הלכידה על כרית חימום או חימום בלוק מוגדר כ- 37 מעלות צלזיוס כפי שלבים אלה חוזרים על עצמם על הדגימות הנותרים.
      הערה: עבור ניסוי, להפריש 3-4 בארות ריק עם 450 µL של בסיס מדיה כדי לשמש כפקדי שלילי. הנותרים 20-21 וולס, לבדוק כל שכפול וחיסונים דולר. לכן, כל צלחת 24-ובכן יאפשר עבור הקלטת של 6-7 בעלי חיים שונים או טיפול תנאים.
3. הימנעות בועות אוויר, מיקום בעדינות איון ללכוד רשת מוסיף לתוך כל טוב באמצעות מלקחיים, לאבטח את הכיסויים עם פומפה מתכת, או עם טיפ pipet P1000 לחתוך (איור 1 C).
   הערה: להימנע התנועה רקמות מופרז במהלך שלב זה כדי לשמור על מיקום הניקוב רשתית בתוך המרכז של microchamber הדגימה. בועות אוויר לעוות קשות OCR קריאות. למרות microchamber יש עומק מספיק כדי להכיל את עכבר אופייני רשתית (איור 1C), לעתים עיבוד שבבי-פגמים הכיסויים רשת עלול לגרום רקמות להיות דחוס מדי במהלך מסך הכניסה. אם זה קורה, פשוט רשום של הרקמה כתוש, אל תכלול הדגימה הניתוח הסופי.
4. דגירה לצלחת רקמות 37 ° C CO₂-חממה חינם לפחות 60 דקות.
5. תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית באמצעות ערבוב, חכה. מידה, וחזור על פקודות. לדוגמה, ניסוי טיפוסי עם רקמת רשתית עשויים לכלול את הפריטים הבאים: מערבבים 2 דקות, להמתין 2 דקות, וכך למדוד 5 דקות. חזור על הניסוי עם שלושת השלבים בין 5 - 8 פעמים (מחזורים) לצורך הקלטה בסיסית, ואחרי הזרקה של כל המתחם נבדק במהלך הריצה.
6. לחץ על לחצן התחל תוכנית במנתח השטף חוץ-תאית, בצע את ההוראות שעל המסך כדי הכנס את מיכל הדיו חיישן לכיול.
7. בסוף הכיול, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להחליף את הצלחת calibrant עם לוחית המכיל את הדגימות ברשתית.
8. מאפשר לתוכנית לפעול, כפי מתוכנת. בסיום ההפעלה, בצע את ההוראות שעל המסך כדי להוציא את הצלחת רקמות. הצג את תוצאות המרוץ ולאחסן את קובץ הנתונים.
9. עם מחט בקוטר 20 כפופות, מלקחיים, הסר מוסיף רשת כל הבארות, ומותיר את האגרוף ברשתית.
10. בזהירות תשאף המדיה מן הרקמה ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 0.5 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS). האחות של PBS לאחר הרחצה.
11. להוסיף 100 µL מאגר פירוק כל טוב, pipet למעלה ולמטה כדי homogenize רקמות.
12. Quantitate רמות הקלט בהתבסס על סך כפול גדילי הדנ א (dsDNA) או תכולת החלבון הכולל.
    הערה: להלן מבוססת על וזמינותו dsDNA זמינים מסחרית.
13. לדלל דגימות lysed 1:1 על-ידי הוספת µL 100 טריס-EDTA (TE) מאגר ולהעביר µL 100 המדגם מדולל צלחת טוב 96.
    1. להוסיף 100 µL מאגר זיהוי כל טוב. לאחר ערבוב 2-5 דקות, quantitate קרינה פלואורסצנטית לאחר עירור-480 ננומטר, פליטה-520 nm, השוואת לעקומה סטנדרטי.
    2. לנרמל את העקיבה raw השטף חוץ-תאי DNA תוכן בתוך הבאר.
       הערה: בתוצאות המובאות כאן, דוגמאות הן מנורמל ל 50 ng dsDNA - כמות אופיינית באגרוף ברשתית 1 מ מ. לכן, הערכים המוחלטים המובאות כאן ניתן להשוות מחקרים בהצגת נתונים "לפי ברשתית פאנץ'". לנרמל לשרטוטים כדי תקן פנימי, כגון הבסיס להפעיל בכל ריכוז הגלוקוז של 5 מ מ.

תוצאות

תוך שימוש בטכניקות המתואר (מסוכם באיור1), explants ברשתית מ 8 בת שבוע פראי סוג (WT) עכברים היו לעומת גיל - ועל רקע-מתאימים transducin null עכברים (Gnat1^{- / -}). כי Gnat1^{- / -} בעלי חיים חסרי המכונות כדי לסגור מחזורית-נוקלאוטיד מגודרת תעלות יונים בתגובה לגיר...

Discussion

OCR, ECAR נמדדים ברצון ברקמת הרשתית explanted באמצעות bioanalyzer תוך שימוש בטכניקות המתואר. שיטה זו יוצאת מאלו של קבוצות אחרות במספר שלבים קריטיים. רקמות ברשתית מבודדים דרך חתך גדול הקרנית ללא enucleating העולם, כפי שהם במקור מתוארת על ידי וינקלר¹⁵. שיטה זו של בידוד ברשתית מאפשר העברה מהירה מעינ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals