Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Zusammenfassung

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Zusammenfassung

Hohe Schärfe Vision ist ein stark energieverbrauchender Prozess, und die Netzhaut hat mehrere einzigartige Anpassungen um genau solche Anforderungen unter Beibehaltung der Transparenz von der Sehachse entwickelt. Störungen auf dieses empfindliche Gleichgewicht führen blendende Erkrankungen wie diabetische Retinopathie. Daher ist das Verständnis Energie-Stoffwechsel-Veränderungen in der Netzhaut bei Erkrankung zwingend notwendig, um die Entwicklung rationaler Therapien für verschiedene Ursachen von Vison Verlust. Den letzten Aufkommen von handelsüblichen extrazelluläre Flussmittel Analysatoren hat die Untersuchung der Netzhaut Energiestoffwechsel zugänglicher gemacht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung solch eines Analyzers, Beiträge zur Netzhaut Energieversorgung durch seine zwei Prinzip Arme - Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse - messen durch Quantifizierung von Steuersatzänderungen Sauerstoff Verbrauch (OCR) und extrazellulären Versauerung Preise (ECAR) als Stellvertreter für diese Wege. Diese Technik ist ohne weiteres in explantierten Netzhautgewebe, Erleichterung der Bewertung der Antworten auf mehrere pharmakologische Wirkstoffe in einem einzigen Experiment durchgeführt. Metabolische Signaturen in Netzhaut von Tieren fehlt Stab Photorezeptor Signalisierung sind im Vergleich zu Wildtyp Steuerelemente, die mit dieser Methode. Eine große Einschränkung bei dieser Technik ist die mangelnde Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Licht angepasst und angepassten Energieausnutzung, einen wichtigen physiologischen Gesichtspunkt Netzhautgewebe.

Einleitung

Die Netzhaut gehört zu den anspruchsvollsten Energie Geweben in das zentrale Nervensystem¹. Wie den meisten Geweben generiert es Adenosintriphosphat (ATP) über Glykolyse im Zytosol oder durch Oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien. Der energetische Vorteil Oxidative Phosphorylierung über Glykolyse ATP aus einem Molekül Glucose herzustellen ist klar: 36 Moleküle ATP generiert aus der ehemaligen vs 2 Molekülen ATP aus letzterer erzeugt. Entsprechend, Netzhaut Neuronen hängen in erster Linie mitochondriale Atmung für Energieversorgung und dies spiegelt sich durch ihre hohe Dichte der Mitochondrien². Allerdings stützt sich die Netzhaut auch auf glykolytischen Maschinen auch wenn Sauerstoff reichlich vorhanden ist. Dieser Prozess der aeroben Glykolyse wurde ursprünglich in Krebszellen durch Otto Warburg³, der einmal darauf hingewiesen, dass die Netzhaut nur Post-mitotische Gewebe in der Lage, diese Form der Stoffwechsel⁴beschrieben. Seit dieser ersten Beobachtungen sind viele Post-mitotische Gewebe beschrieben worden, um in unterschiedlichem Ausmaß der Glykolyse neben Oxidative Phosphorylierung zu engagieren, um ihre ATP-Anforderungen zu erfüllen.

Phototransduction, recycling, Sehpigment Biosynthese der Photorezeptor Außensegmenten und synaptische Aktivität sind alle anspruchsvollen Energieprozesse in Photorezeptoren, die vorherrschende neuronalen Unterklasse in der Netzhaut. Aber die Notwendigkeit, aktiv Ionen gegen ihre elektrischen und Konzentration Steigungen zu transportieren ist bei weitem die meisten energetisch raubender Prozess in Neuronen¹. Photorezeptoren sind eigentümliche Neuronen in dem Sinne, dass sie in Ermangelung der Stimulation (d. h. im Dunkeln), depolarisiert werden während ein Lichtreiz Kanal Schließung und anschließende Hyperpolarisation auslöst. Daher im Dunkeln verbraucht die Netzhaut große Mengen an ATP zur Aufrechterhaltung seiner Depolarisation oder "Dunkelstrom", wie es gewöhnlich genannt wird. Aus Sicht der adaptiven ist eine große Herausforderung bei der Versorgung dieser Unmengen von ATP die Notwendigkeit für Organismen, visuellen Klarheit durch die optische Achse beizubehalten. Die umgekehrte Netzhaut Architektur in modernen Kreaturen gesehen ist die dominante Lösung, da hält es die dichten Kapillarnetzes Versorgung Photorezeptoren vom Weg des Lichts. Aber dieses Wunderwerk der Natur Bioengineering die Netzhaut am Abgrund in Bezug auf die metabolische Reserve. Auch kleine Beleidigungen der Netzhaut können potenziell stören das empfindliche Gleichgewicht der Energie-Angebot und Nachfrage, und visuellen Dysfunktion oder offene Blindheit kann schnell erfolgen.

Angesichts der einzigartigen energetischen Anforderungen der neuronale Netzhaut, gepaart mit seiner engen Beschränkung der Gefäßversorgung, hätte genaue Messung des ATP-Verbrauch in der Netzhaut und seine Veränderungen während der Krankheit tiefgreifende Auswirkungen bei Verständnis und Behandlung von blendende Voraussetzungen wie Retinitis Pigmentosa und diabetische Retinopathie. Traditionell, erfordern diese Messungen kostspielig, speziell angefertigte Geräte mit den meisten Studien aus einer Handvoll von Laboratorien, die ausschließlich mit Messungen der metabolische Aktivität^{2,5,6, 7,8}. Techniken umfassen einzelne Assays für die spezifischen Metaboliten, Tracer-Studien mit Radio-markierten Vorstufen, Sauerstoffverbrauch Aufnahme mit Clark Elektroden und Metabolomic Profilerstellung⁹.

Mit Fortschritten im Hochdurchsatz-Technologie und eine höhere Verfügbarkeit von kommerziellen Geräten sind Techniken zur Aufzeichnung retinalen Stoffwechsel immer zugänglich und erschwinglich. Die hier beschriebene Methode misst sowohl Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse in der Netzhaut mit isolierten Gewebe und einen handelsüblichen extrazelluläre Flussmittel Analyzer^9,10,11,12. Dieser Analysator zeichnet separat Sauerstoff-Verbrauch (OCR) und die extrazelluläre Übersäuerung Rate (ECAR), dient als indirekte Indikatoren für die Oxidative Phosphorylierung und Glykolyse, bzw.¹³. Diese Messungen erfolgt durch eine Sonde eingetaucht in ein Microchamber über das Gewebe von Interesse erstellt. Diese Anpassung der zuvor veröffentlichten Methoden verwendet eine Capture-Platte ursprünglich für Bauchspeicheldrüsenkrebs Langerhans-Inseln um metabolische Aktivität in kleinen, kreisförmigen Abschnitten der Maus Netzhaut aufzuzeichnen. Pharmakologische Mehrfachbelichtungen können geliefert werden, das Gewebe im Laufe einer einzigen Aufnahme, weil das System gut 4 Injektion Ports für jede Probe enthält. Mit diesem System mit getrennter Protokolle für ECAR und OCR-Aufnahmen optimiert, die Reaktionen der Wildtyp Netzhaut sind vergleichbar mit Netzhaut fehlen transducin (Gnat1^{- / -}), eine Ursache für kongenitale stationäre Nachtblindheit in Menschen-¹⁴.

Protokoll

Protokolle folgte der Association for Research in Vision und Augenheilkunde-Anweisung für die Nutzung von Tieren und von der Washington University angenommen wurden.

(1) tierische Vorbereitung

1. Halten Sie Tiere in Standardgehäuse mit 12 Stunden dunkel bis 12 Stunden Licht-Zyklus. Begin Experimente an standardisierten Zeiten zu vermeiden circadiane Effekte in der Regel am Morgen kurz nach Lichter eingeschaltet sind.

2. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie base Medien durch Auflösen von 8,4 mg pulverförmige Medien in bidestilliertem H₂O (DdH₂O) und pH auf 7,4 mit HCl oder NaOH einstellen, zu einem Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren diese Lösung mit einem 0,22 µm Gewebekultur Filter.
   1. Fügen Sie 1 M Glukose und 100 mM Natrium Pyruvat zu den Medien zu Endkonzentrationen von 5 mM Glucose zu erreichen und 1 mM Pyruvat.
   2. Ort eine 50 mL Aliquot der Basis Medien in einem 37 ° C-Wasserbad.
2. Quantifizierung der Gewebe am Ende der Flux-Analyse durch Zugabe von Tris-base, 10 mM, Polyethylenglykol Tert-Octylphenyl Äther auf 0,2 % (V/V) und EDTA, 1 mM, alle in DdH₂O. mischen, bis alle Komponenten vollständig aufgelöst und passen bereiten Sie Lyse Lösung vor pH bis 8.0.
3. Bereiten Sie für das Protokoll mitochondrialer Stress ein 11 µM-Lager von Oligomycin, ein ATP-Synthase-Inhibitor, aufgelöst in base Medien auf eine Endkonzentration von 1 µM im Brunnen. Bereiten Sie einen 11 µM Vorrat an Carbonyl Zyanid - 4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), ein abkoppeln Agent in base Medien, eine Endkonzentration von 1 µM im Brunnen Ziel aufgelöst. Bereiten Sie einen Cocktail der Elektronentransport-Kette-Inhibitoren, Rotenon und Antimycin A (RAA) durch Zugabe von Rotenon bis 11 µM und Antimycin A bis 22 µM, aufgelöst in base Medien auf eine Endkonzentration von 1 µM Rotenon und 2 µM Antimycin A in das gut.
4. Bereiten Sie für die Glykolyse Protokoll 220 mM Lager in base Medien, um eine Endkonzentration von 20 mM in den Brunnen Ziel gelöster Glukose. Auch bereiten Sie ein 1,1 M Lager 2-Deoxyglucose (2-DG), als kompetitiver Inhibitor von Glukose und glykolytische Antagonist, durch Auflösen in base Medien. Dies wird eine Endkonzentration von 100 mM 2-DG in der gut ausgerichtet sein.

3. Kalibrierung

1. Um die Instrumentierung für eine extrazelluläre Flux-Assay zu kalibrieren, fügen Sie 1 mL der Kalibrierlösung in jede Vertiefung der Sensorkassette (insgesamt 24 Vertiefungen) und Inkubation bei 37 ° C in einer CO₂-frei Inkubator über Nacht (oder mindestens 8 Stunden).
2. Laden Sie Additive für die mitochondriale Stress-Protokoll oder das Protokoll Glykolyse in jeder Injektor Port A bis D, auf der Sensorkassette, bereinigt um Volumenänderungen im Brunnen.
   Hinweis: Beispielsweise würde ein typische Assay gehören 45 µL eines Zusatzstoffes in der erste Injektor-Port, 49,5 µL in die zweite, 54,5 µL in der dritten und 60 µL in den letzten gut Anfangslautstärke von 450 µL vorausgesetzt.
3. Während der ersten mehrere Experimente laden Sie base Medien in Port A zu beurteilen, wie viel Gewebe Bewegung/Artefakt nach einer Port-Injektion erfolgt.
4. Lassen Sie die geladenen Sensorplatte bei 37 ° C in einem nicht-CO₂ -Inkubator für mindestens 60 min inkubieren.

4. Isolierung von Netzhautgewebe frische Maus

Hinweis: Dieser Schritt ist von der Technik von Dr. Barry Winkler¹⁵angepasst.

1. Nach der Verabreichung Tiefe Narkose mit einem standard Ketamin/Xylazin-Cocktail, einschläfern Sie Mäuse durch zervikale Dislokation.
2. Verwenden Sie ein paar mittlere gebogene Pinzetten, fassen Sie den hinteren Globus auf den Sehnerv und sanft nach vorne Druck auf Proptose des Auges (Abbildung 1A).
   1. Erstellen Sie mit einer sauberen Rasierklinge einen Limbus, Limbus-Schnitt in die Hornhaut mit einem einzigen, absichtliche Pass der Klinge.
   2. Mit feinen, Kneifen abgewinkelte McPherson-Stil Zangen den hinteren Globus, die Objektiv und vorderen hyaloid Membranen aus der Hornhaut Schnitt auszudrücken. Entsorgen Sie diese Gewebe.
   3. Wiederholen Sie das Kneifen Manöver mit der Pinzette die neuronale Netzhaut zum Ausdruck bringen.
   4. Mit der Zange wie ein Löffel auf die Netzhaut zu heben, anstatt, das Gewebe zu erfassen, die Netzhaut von der Hornhaut Schnitt und direkt in warmen Medien in einer 3-cm-Schüssel oder eine 6-Well-Zellkultur-Cluster-Platte.
3. Verwenden Sie zwei Paare von feinen, gewinkelte McPherson-Stil Zange sanft verbleibenden Glaskörpers von der Netzhaut zu sezieren. Dies geschieht am besten durch den Glaskörper an der Peripherie der Netzhaut Cup greifen und ziehen in Richtung Zentrum, mit einer endgültigen Disinsertion des Glaskörpers von der Mitte als Ganzes. Mit der Pinzette, entfernen Sie alle verbleibenden retinalen Pigmentepithels von der Oberfläche der Photorezeptoren der Netzhaut.
   1. Schneiden Sie eine P1000 Pipettieren Spitze mit einer Rasierklinge zum Erstellen einer ~ 4 mm Öffnung um unnötige Trauma auf die empfindliche Netzhaut-Gewebe während der Übertragung Manöver zu verhindern.
   2. Übertragen Sie die isolierten Netzhautgewebe in frische Medien mit einer geschnittenen P1000 Pipettieren Spitze.
   3. Schneiden Sie 1 mm Schläge der Netzhaut um den Sehnerv mit einem 1 mm-Biopsie Punsch mit einem Kolben ausgestattet, um das Gewebe zu verdrängen, für den Fall, dass sie in die Bohrung (Abbildung 1 b) erhoben wird. Legen Sie die Netzhaut Schläge beiseite in sauberen Medien auf einem Block 37 ° C gehalten oder Heizkissen.

5. Test-Protokoll

1. Übertragen Sie einzelne Schläge auf einer 24-Well Inselchen Erfassung Mikrotestplatte mit einer geschnittenen P1000 Spitze, Absaugen von 450 µL der Medien zusammen mit dem Gewebe.
2. Verwenden Sie fein, gerade Pinzette sanft Schläge in die Mitte der Mikrotestplatte manipulieren. Halten Sie die Schläge in die gleiche Richtung (z.B. Ganglion Zelle Seite nach oben) ausgerichtet.
   1. Ruhen Sie die Capture-Platte auf ein Heizkissen oder Heizung Block auf 37 ° C eingestellt, da diese Schritte für die restlichen Proben wiederholt werden.
      Hinweis: Für jedes Experiment beiseite 3-4 leere Brunnen mit 450 µL base Medien als negative Kontrollen dienen. Testen Sie in den verbleibenden 20-21-Brunnen jede biologische replizieren in dreifacher Ausfertigung. Daher wird jede 24-Well-Platte für die Aufnahme von 6-7 verschiedene Tiere oder Behandlungsbedingungen erlauben.
3. Vermeidung von Luftblasen, sanft Position die Insel Mesh-Einsätze in jeder gut mit Pinzette zu erfassen und die Einsätze zu sichern, mit einem metallischen Kolben oder mit geschnittenen P1000 Pipettieren Spitze (Abb. 1 C).
   Hinweis: Vermeiden Sie übermäßige Gewebe Bewegung während dieses Schrittes, retinale Lochposition in der Mitte der Probe Microchamber beizubehalten. Luftblasen verfälschen stark OCR Lesungen. Obwohl die Microchamber ausreichende Tiefe, typische Maus Netzhaut (Abbildung 1) unterzubringen ist, verursachen gelegentlich Bearbeitung-Fehler in der Mesh-Einsätze Gewebe zu übermäßig beim Bildschirm einfügen komprimiert werden. In diesem Fall einfach notieren Sie das zerkleinerte Gewebe und letzten Endes schließen Sie dieser Probe aus.
4. Inkubieren Sie die Gewebe-Platte in einem 37 ° C CO₂-frei Inkubator für mindestens 60 min..
5. Programm den extrazellulären Flux-Analyzer mit Mix, warten, Maßnahme, und wiederholen Sie Befehle. Als Beispiel, ein typisches Experiment mit Netzhautgewebe kann Folgendes beinhalten: Mischen Sie 2 Minuten, warten Sie 2 Minuten und 5 Minuten zu messen. Wiederholen Sie das Experiment mit diesen drei zwischen Schritten 5-8 Mal (Zyklen) für eine Aufnahme der Grundlinie und nach Injektion von jeder Verbindung getestet während des Laufs.
6. Drücken Sie die Programm-START-Taste auf der extrazellulären Flux-Analyzer und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensor-Steckmodul für Kalibrierung einfügen.
7. Am Ende der Kalibrierung befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Platte mit der Netzhaut Proben die Kalibrator Platte ersetzen.
8. Lassen Sie das Programm ausführen, wie programmiert. Am Ende des Laufs befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Gewebe-Platte auswerfen. Zeigen Sie die Ergebnisse des Laufes und speichern Sie die Datei zu.
9. Entfernen Sie mit einem gebogenen 20 Gauge-Nadel und Pinzette alle Mesh-Einsätze aus dem Brunnen, den Netzhaut Stempel hinterlassen.
10. Vorsichtig aspirieren Sie die Medien aus dem Gewebe und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 0,5 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie die PBS, nach dem Waschen.
11. Jeder Brunnen und Pipettieren rauf und runter, um Gewebe zu homogenisieren fügen Sie 100 µL der Lyse Puffer hinzu.
12. Quantitate basierend auf insgesamt doppelsträngige DNA (DsDNA) oder Gesamtproteingehalt Eingangspegel.
    Hinweis: Folgendes basiert auf einem handelsüblichen DsDNA-Assay.
13. Lysierten Proben 1:1 durch Zugabe von 100 µL Tris-EDTA (TE)-Puffer verdünnen und 100 µL der verdünnten Probe auf einer 96-well-Platte übertragen.
    1. Fügen Sie 100 µL der Detektionspuffer in jede Vertiefung. Nach dem Mischen für 2-5 Minuten, quantitate Fluoreszenz nach Anregung bei 480 nm und Emission bei 520 nm, im Vergleich zu einer standard-Kurve.
    2. Die rohen extrazelluläre Flux-Tracing auf DNA-Gehalt in den Brunnen zu normalisieren.
       Hinweis: In der hier vorgestellten Ergebnisse sind Proben auf 50 ng DsDNA - eine typische Menge in einen 1 mm retinalen Schlag normalisiert. Daher kann Absolute Werte, die hier vorgestellten Studien, die Darstellung von Daten "Pro Retina Punch" verglichen werden. Normalisieren Sie Kurven mit einem internen Standard, wie die Basislinie laufen bei einer Glukosekonzentration von 5 mM.

Ergebnisse

Netzhaut Explantaten von 8 Wochen alten Wildtyp (WT) Mäusen wurden mit den beschriebenen Techniken (zusammengefasst in Abbildung 1), im Vergleich zu Alter und Hintergrund abgestimmt transducin null Mäuse (Gnat1^{- / -}). Weil Gnat1^{- / -} Tiere die Maschinerie, in der Nähe fehlt zyklische Nukleotid gated Ionenkanäle in Reaktion auf Lichtreize, ihre Rute Photorezeptoren bleiben auch in leichten^1...

Diskussion

OCR und ECAR werden ohne weiteres in explantierten Netzhautgewebe mit einem Bioanalyzer mit den beschriebenen Techniken gemessen. Diese Methode weicht von denen anderer Gruppen in mehreren kritischen Schritten. Retinalen Gewebe sind durch einen großen Hornhaut Schnitt isoliert ohne enucleating der ganzen Welt, wie ursprünglich von Winkler¹⁵beschrieben. Diese Methode der Netzhaut Isolierung ermöglicht eine schnelle Übertragung von lebenden Auge in die Gewebe-Capture-Platte (oft innerhalb von 5 ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals