細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

要約

この手法では、酸素消費量と細胞外酸性化率 explanted マウス網膜組織細胞フラックス アナライザーを使用してリアルタイムの記録について説明します。

要約

高視力ビジョンが大きくエネルギー消費のプロセス、網膜が正確に視軸の透明性を維持しながらこのような要求を満たすためにいくつかのユニークな適応を開発しました。この微妙なバランスに摂動は、まばゆいばかりの病気、糖尿病網膜症などを引き起こします。したがって、病気中に網膜におけるエネルギー代謝の変化の理解は、ビジョンの損失の様々 な原因のための合理的な治療法の開発することが不可欠です。市販の細胞フラックス アナライザーの最近の出現より使いやすい網膜のエネルギー代謝の研究をしました。このプロトコルを記述するこのような酸素消費量 (OCR) の変化を定量化することでその 2 つの主要武器 - 酸化的リン酸化と解糖系 - を通じて網膜のエネルギー供給への貢献を測定する分析装置の使用および細胞外これらの経路のプロキシとして酸性化率 (ecar と)。この手法は、explanted 網膜組織、単一の実験で複数の薬理学的薬剤への応答の評価を促進することで容易に実行されます。棒の光受容器シグナリングに欠けている動物から網膜に代謝の署名は、このメソッドを使用して野生型コントロールと比較されます。このテクニックでの主な制限は、明順応と低エネルギー利用、網膜組織の重要な生理学的な考察を区別する能力の欠如です。

概要

網膜は中枢神経系に¹で最もエネルギー要求の厳しい組織です。同じようなほとんどの組織は、ミトコンドリアの細胞質または経由で酸化的リン酸化で解糖系によってアデノシン三リン酸 (ATP) を生成します。1 分子のグルコースから ATP を生成する解糖作用上の酸化的リン酸化のエネルギッシュな利点は明らか: 36 分子の ATP 生成から、前者と後者から生成される ATP の 2 分子。したがって、網膜神経細胞は主にエネルギーをミトコンドリア呼吸に依存して、これはミトコンドリア²の密度が高いで反映されます。しかし、網膜もに大きく依存して解糖系機械酸素が豊富な場合も。好気性解糖系のこのプロセスは、オットーウォーバーグ³、かつて指摘した網膜のみ分裂組織代謝⁴のこの形のことができる人によってがん細胞で最初に説明だった。これらの初期の観測以来多くの分裂組織を酸化的リン酸化に加え解糖作用の度合いでその ATP の要求を満たすために従事するのに記載されています。

光伝導、視覚顔料リサイクル、視細胞外側セグメントとシナプスの活性の生合成は、光受容体、網膜で優勢な神経細胞のサブクラス内のすべてのエネルギー要求の厳しいプロセスです。積極的に彼らの電気に対するイオンと濃度勾配を輸送する必要がニューロン¹で最も精力的にかかる。光受容体は、(すなわち、暗闇の中で)、刺激のない状態で脱分極が光刺激トリガー チャンネル閉鎖とその後過分極に対し意味で特異な神経細胞です。したがって、網膜は、暗闇の中は一般的に呼ばれるように、その脱分極や「暗電流」を維持するために ATP の大量を消費します。適応の観点からは、これら大量の ATP を供給の主要課題は、光軸を通して映像の明瞭さを維持するために有機体のための必要性です。モダンな生き物に見られる倒立網膜建築光のパスから視細胞を供給密な毛細血管網を保持して支配的な解決策であります。この自然なバイオ エンジニア リングの驚異は代謝の準備の面で絶壁で網膜を配置します。網膜に小さくても侮辱に需要へのエネルギー供給の微妙なバランスが中断される可能性が、視覚障害や失明のフランクはすぐに起こることがあります。

血管供給のタイトな制限と相まって、神経網膜のユニークなエネルギッシュな要求を与え病気中に網膜とその変化で ATP 消費量の正確な測定の理解と治療に大きな影響を与えますが網膜色素変性症、糖尿病網膜症などの失明状態。伝統的に、これらの測定は研究所代謝活性^{2,5,6、測定専用の握りから新たな研究のほとんどと、特注の高価な機器を必要とします。 7,8}。技術は、特定の代謝物、標識前駆体、クラーク電極とメタボローム⁹のプロファイリングを使用して録音の酸素消費量を用いたトレーサー研究個々 の試金を含んでいます。

ハイスループット技術および商業のデバイスの可用性の向上が進み、レコード レチナール代謝する技術はますます入手しやすく現実的。ここで説明したメソッドが両方酸化的リン酸化を測定し、網膜を使用して解糖系仔組織と市販の細胞フラックス アナライザー^9,10、11,12。このアナライザーは、酸素消費量 (OCR) と酸化的リン酸化と解糖系、それぞれ¹³の間接的な指標として細胞の酸性化率 (ecar と)、別々 に記録します。これらの測定は、水没して興味の組織に作成されたマイクロチャンバ内プローブによって行われます。以前に発行されたメソッドのこの適応では、膵ランゲルハンス島用に設計されたキャプチャ プレートを使用マウス網膜の小さい、円形のセクションで代謝活性を記録します。複数の薬理学的なエクスポー ジャーは、システムも各サンプルの 4 つの注入ポートが含まれるために、単一の記録の中に、組織に配信できます。Ecar と OCR の録音のために最適化された別のプロトコルでこのシステムを使用して、野生型網膜の反応 (Gnat1^-/-)、トランスデューシン欠けている網膜と比較することで先天性定常夜盲症の原因人間¹⁴。

プロトコル

プロトコルはビジョン研究会、動物の使用は、眼科の文に従い、ワシントン大学によって承認されました。

1. 動物の準備

1. 12 時間で標準的な住宅で動物を 12 時間ライト サイクルが暗い維持するには。実験開始は朝はライトが点灯直後に通常概日リズムの影響を避けるために時間を標準化します。

2. ソリューションの準備

1. 8.4 mg ダブル蒸留 H₂O の粉末メディア (ddH₂O) を溶解することにより基本メディアの準備し 7.4 塩酸または水酸化ナトリウムで pH を調整、0.22 μ m フィルターを組織培養 L. フィルター滅菌このソリューションを 1 の最終巻に。
   1. 1m グルコースと 5 mM グルコースの最終的な濃度を達成するためにメディアにピルビン酸ナトリウム 100 mM と 1 mM ピルビン酸を追加します。
   2. 場所 37 ° C の水浴の基本メディアの 50 mL の約数。
2. 10 mM、0.2% (v/v)、ポリエチレン ・ グリコール tert-オクチルフェニル エーテル、ddH₂O. ミックスすべてのコンポーネントは完全に解散し、調整まですべて 1 mm EDTA をトリス ベースを追加することによってフラックス解析の終わりに組織定量の換散ソリューションを準備します。8.0 pH。
3. ミトコンドリア ストレス プロトコルのオリゴマイシン、ATP 合成酵素の阻害剤でも 1 μ M の最終的な集中を対象とする基本メディアに溶解の 11 μ M 在庫を準備します。カルボニル シアン化物 - 4-(フッ素系低分子) の 11 μ M 在庫の準備も 1 μ M の最終的な集中を対象とする基本メディアに溶解した phenylhydrazone (FCCP)、脱共役剤。電子輸送鎖阻害剤、ロテノン、アンチマイシン A (RAA) 11 μ M、アンチマイシン A 22 μ M にロテノンを追加してのカクテルを準備最終濃度 1 μ M ロテノンと 2 μ M アンチマイシン A を対象とする基本メディアに溶解し、よく。
4. 解糖系のプロトコルの基本メディアに、井戸に 20 mM の最終的な集中をターゲットに溶解したグルコースの 220 mM の在庫を準備します。また溶解基本メディアに 1.1 M 在庫 2-デオキシグル コース (2 DG)、グルコースの解糖系拮抗薬競争阻害剤を準備します。これは井戸の 100 mM 2 DG の最終的な集中を対象します。

3. 測定器の校正

1. 細胞フラックス測定の計測器を校正するセンサー カートリッジ (24 ウェルの合計) の各ウェルに校正溶液の 1 mL を追加し、, CO₂の 37 ° C で-無料のインキュベーター一晩 (または少なくとも 8 h)。
2. ミトコンドリア ストレス プロトコルまたは解糖系の添加剤を各インジェクターのポートに、A D からの井戸での体積変化を調整するセンサー カートリッジ ロードします。
   注:例として、最初のインジェクターのポートに添加剤の 45 μ L、第二に、最後に 3 番目、および 60 μ L に 54.5 μ L 450 μ L の初期もボリュームを想定して 49.5 μ L、典型的な試金が含まれます。
3. 最初のいくつかの実験中にポート噴射後発生しますどのくらいの組織運動/アーチファクトをゲージにポート A に基本メディアを読み込みます。
4. 37 ° c 少なくとも 60 分非 CO₂インキュベーターで孵化するロード センサー プレートを許可します。

4. 新鮮なマウス網膜組織の分離

注:この手順は、博士バリー ・ ウィンクラー¹⁵のテクニックを改作したものです。

1. 標準ケタミン ・ キシラジン カクテルを使用して深い麻酔を管理するには後、頚部転位によってマウスを安楽死させます。
2. 視神経に後部のグローブをつかみ、そっと proptose 目 (図 1 a) に前方の圧力を適用するカーブタイプ鉗子の中型のペアを使用します。
   1. きれいなかみそりの刃と刃の 1 つ、意図的なパスを使用して角膜で角膜を角膜切開を作成します。
   2. 罰金を使用して、鉗子マクファーソン-スタイル ピンチ レンズと角膜の切開から前部硝子体膜を表現する後部のグローブです。これらの組織を破棄します。
   3. 神経網膜を表現するための鉗子で挟み込みの演習を繰り返します。
   4. スプーンのような鉗子を使用して組織を把握するのではなく、網膜を持ち上げること、角膜の切開からの網膜を転送し、3 cm 皿や 6 ウェル培養クラスター プレートで温かみのあるメディアに直接配置します。
3. 優しく残存硝子体網膜からを解剖するのに罰金、斜めのマクファーソン スタイル鉗子の 2 つのペアを使用します。網膜のカップの周囲に硝子体をつかんで全体としてセンターから硝子体の最終的な disinsertion で、中心に向かって引っ張るこれは最高です。鉗子を使用すると、網膜の視細胞表面から任意の残留の網膜色素上皮細胞を削除します。
   1. 転送操縦中繊細な網膜組織への過度の外傷を防ぐために 〜 4 mm の開口部を作成するかみそりの刃で P1000 のピペット先端部をカットします。
   2. 孤立した網膜組織をカット P1000 のピペット チップを使用して新鮮なメディアに転送します。
   3. カット 1 mm 生検と視神経乳頭周囲網膜の 1 mm パンチ パンチ穴 (図 1 b) に提出になることに備えて、組織を取り除くため、プランジャーを装備しました。網膜パンチ クリーン メディア 37 ° C ブロック上に保持または加熱パッドで脇を設定します。

5 試金のプロトコル

1. 個々 のパンチを吸引組織とともにメディアの 450 μ L カット P1000 チップを使用して 24 ウェル アイレット キャプチャ マイクロ プレートに転送します。
2. マイクロ プレートの中心にパンチをゆっくり操作するストレート鉗子を使用、正常。(例えば、神経節細胞の側を上向きに) 同じ方向で方向づけられるパンチを維持します。
   1. 加熱パッドまたは残りのサンプルの手順が繰り返されるにつれ、37 ° c ブロック セットを加熱でキャプチャ プレートを置きます。
      注:各実験のためのネガティブ コントロールとして提供する基本メディア 450 μ L で 3-4 空井戸置いておきます。残り 20 21 井戸で 3 通の各生物学的製剤の複製をテストします。したがって、各 24 ウェル プレート記録 6-7 さまざまな動物や処理条件から許可されます。
3. 気泡、軽く位置を回避する小島は鉗子を使用してそれぞれにメッシュインサートをキャプチャし、金属のプランジャーまたはカット P1000 ピペット先端部 (図 1 C) 挿入をセキュリティで保護します。
   注:この手順でサンプル マイクロチャンバのセンター内網膜のパンチの位置を維持するために過剰な組織の動きを避けてください。空気の泡は、深刻な OCR 読み取りを歪めます。マイクロチャンバの典型的なマウス網膜 (図 1) を対応するために十分な深さですが、時折メッシュ挿入で加工欠陥は画面挿入時に過度に圧縮になるために、組織を引き起こす可能性があります。この場合、単に押しつぶされた組織のメモし、最終的な分析から、このサンプルを除外します。
4. 37 ° C CO₂組織プレートを孵化させなさい-少なくとも 60 分無料インキュベーター。
5. ミックス、待機、メジャーを使用して細胞外フラックス アナライザーをプログラムし、コマンドを繰り返します。網膜組織の代表的な実験例として、次を含めることができます: ミックス 2 分、2 分待って、5 分測定します。これら 3 つの実験の間手順を繰り返します 5-8 回 (サイクル) ベースライン記録のため、実行中にテストされる各化合物の注入後。
6. 細胞外フラックス アナライザーのプログラム開始ボタンを押し、校正用センサー カートリッジを挿入する画面の指示に従います。
7. キャリブレーションの最後に、網膜のサンプルを含むプレート calibrant プレートを置き換えるには、画面の指示に従います。
8. プログラムは、実行するプログラムを許可します。実行の完了時に組織プレートを取り出すには、画面の指示に従います。実行の結果を表示し、データ ファイルを格納します。
9. ベントの 20 ゲージ針と鉗子、網膜のパンチを残して、井戸からすべてメッシュ挿入を削除します。
10. 慎重に組織からメディアを吸引し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 0.5 mL で 2 回組織を洗ってください。洗浄後、PBS を吸い出しなさい。
11. 換散バッファーの 100 μ L を追加各よくし、組織を均質化、上下にピペットで移しなさい。
12. 入力レベル合計二本鎖 DNA (dsDNA) または総たんぱく量に基づいて量的に表わします。
    注:次は、市販 dsDNA の分析に基づいています。
13. トリス-EDTA (TE) バッファーの 100 μ L を追加することによって分離サンプル 1:1 を希釈し、希釈試料 100 μ L を 96 well プレートに転送。
    1. 各ウェルに 100 μ L の検出バッファーを追加します。2-5 分のための混合後、480 nm 励起と 520 で放出後の蛍光量的に表わす nm の, 標準曲線と比較します。
    2. 生細胞フラックス トレース井戸内 DNA 量を正常化します。
       注:ここで示された結果、サンプルは 50 ng dsDNA - 1 mm 網膜パンチの典型的な量に正規化されます。したがって、ここに示す絶対値は、研究""網膜パンチあたりのデータを提示する比較されるかもしれない。5 mM のグルコース濃度で実行するベースラインなど内部標準にトレースを正規化します。

結果

(図 1に要約) 説明したテクニックを使用すると、8 週齢野生型 (WT) マウスから網膜外植片は年齢と背景一致トランスデューシンnull マウス (Gnat1^-/-) と比較されました。Gnat1^-/-動物を 機械がないため環状ヌクレオチド ゲート光刺激への反応のイオン チャネル、彼らの棒の光受容体の光¹⁴でも脱?...

ディスカッション

OCR と ecar とは、記載された方法を使用してバイオアナライザーを用いた explanted 網膜組織に容易に測定します。このメソッドは、いくつかの重要なステップの他のグループのそれらから出発します。網膜組織はウィンクラー¹⁵によって最初に記述されている、世界中を enucleating することがなく大規模な角膜切開に分離されます。網膜の分離のこの方法は、組織キャプチャ板?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals