Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Resumo

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Resumo

Visão de alta acuidade é um processo altamente consumidores de energia, e a retina desenvolveu várias adaptações exclusivas para atender precisamente tais demandas, mantendo a transparência do eixo visual. Perturbações para este delicado equilíbrio causam doenças cegantes, como retinopatia diabética. Portanto, a compreensão das mudanças do metabolismo de energia na retina durante a doença é fundamental para o desenvolvimento de terapias racionais para várias causas de perda de visão. O recente advento dos analisadores de fluxo extracelular comercialmente disponíveis tornou mais acessível o estudo do metabolismo energético da retina. Este protocolo descreve o uso de um analisador de medir as contribuições para o fornecimento de energia da retina através de seus braços dois princípio - fosforilação oxidativa e glicólise - através da quantificação de alterações em taxas de consumo de oxigênio (OCR) e extracelular taxas de acidificação (ECAR) como proxies para essas vias. Esta técnica é executada prontamente no tecido da retina explantado, facilitando a avaliação das respostas a vários agentes farmacológicos em uma única experiência. Assinaturas metabólicas em retinas de animais sem haste fotorreceptoras sinalização são comparadas aos controles do selvagem-tipo usando esse método. Uma limitação importante nesta técnica é a falta de capacidade de discernir entre a utilização de energia de luz-adaptado e vez, uma importante consideração fisiológica no tecido da retina.

Introdução

A retina é entre os tecidos mais exigentes de energia no sistema nervoso central¹. Como a maioria dos tecidos, gera triphosphate de adenosina (ATP) via glicólise no citosol ou via fosforilação oxidativa em mitocôndrias. A vantagem energética da fosforilação oxidativa sobre glicólise para produzir ATP a partir de uma molécula de glicose é clara: 36 moléculas de ATP gerado a partir do antigo vs 2 moléculas de ATP gerado deste último. Por conseguinte, os neurônios da retina dependem principalmente de respiração mitocondrial para fornecimento de energia e isto é refletido por sua alta densidade de mitocôndrias². Ainda, a retina também confia pesadamente na maquinaria glicolítico mesmo quando o oxigênio é abundante. Este processo de glicólise aeróbica foi originalmente descrito em células cancerosas por Otto Warburg³, que uma vez observou que a retina foi o tecido apenas pós mitótico capaz desta forma de metabolismo⁴. Desde essas observações iniciais, muitos tecidos pós mitóticos têm sido descritos para se envolver em vários graus de glicólise além de fosforilação oxidativa para atender suas demandas de ATP.

Fototransdução, pigmentos visuais, reciclagem, biossíntese de segmentos exteriores fotoreceptor e atividade sináptica são todos os processos exigentes de energia nos fotorreceptores, a subclasse neuronal predominante na retina. Mas a necessidade de transportar ativamente íons contra seus eléctricos e gradientes de concentração é de longe o processo que consumia muito mais energicamente em neurônios¹. Fotorreceptores são neurônios peculiares no sentido de que eles são despolarizados na ausência de estimulação (ou seja, no escuro), Considerando que um estímulo de luz aciona o fechamento do canal e hiperpolarização subsequente. Portanto, no escuro, a retina consome grandes quantidades de ATP para manter sua despolarização ou "corrente escura", como é comumente chamado. Do ponto de vista adaptativa, um grande desafio no fornecimento destes grandes quantidades de ATP é a necessidade dos organismos manter a clareza visual através do eixo óptico. A arquitetura da retina invertida vista em modernas criaturas é a solução dominante, como mantém a densa rede capilar fornecendo fotorreceptores longe o caminho da luz. Mas esta maravilha de bioengenharia natural coloca a retina em um precipício em termos de reserva metabólica. Mesmo pequenos insultos à retina potencialmente podem perturbar o delicado equilíbrio da oferta e a procura de energia, e disfunção visual ou cegueira franca possam decorrer rapidamente.

Dada a demanda energética única da retina neural, juntamente com sua restrição apertada de suprimento vascular, medição precisa do consumo de ATP, a retina e suas mudanças durante a doença pode ter profundas implicações na compreensão e tratamento cegando condições tais como a retinite pigmentosa e retinopatia diabética. Tradicionalmente, estas medidas exigem equipamentos caros, personalizados com a maioria dos estudos emergentes de um punhado de laboratórios inteiramente dedicado às medições da atividade metabólica^{2,5,6, 7,8}. As técnicas incluem ensaios individuais para metabolitos específicos, estudos de rastreamento usando precursores rotulado de rádio, gravação usando eletrodos de Clark e metabolómica⁹de criação de perfil de consumo de oxigênio.

Com os avanços na tecnologia de alta produtividade e aumento da disponibilidade de dispositivos comerciais, técnicas de registro metabolismo da retina são cada vez mais acessível e disponível. O método descrito aqui mede ambos fosforilação oxidativa e glicólise na retina usando explantados tecido e um analisador do fluxo extracelular comercialmente disponíveis^9,10,11,12. Este analisador separadamente registra taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação do extracelular (ECAR), servindo como indicadores indirectos de fosforilação oxidativa e glicólise, respectivamente¹³. Essas medições são feitas por uma sonda submergida dentro de um microchamber criado sobre o tecido de interesse. Esta adaptação dos métodos publicados anteriormente usa uma placa de captura, projetada originalmente para pâncreas ilhotas de Langerhans para gravar a atividade metabólica em seções pequenas, circulares da retina do rato. Várias exposições farmacológicas podem ser entregues para o tecido no decurso de uma única gravação, porque o sistema contém 4 portas de injeção para cada amostra bem. Usando este sistema com protocolos separados, otimizados para gravações ECAR e OCR, respostas do selvagem-tipo retina podem ser comparadas com as retinas falta transducina (Gnat1^{- / -}), uma causa de cegueira congênita de noite estacionária em os seres humanos¹⁴.

Protocolo

Protocolos seguiram a associação para pesquisa em visão e oftalmologia declaração sobre a utilização dos animais e foram aprovados pela Universidade de Washington.

1. preparação animal

1. Manter animais em habitação padrão com um 12 horas escuro para ciclo de luz de 12 horas. Begin experimentos no padronizado para evitar efeitos circadianos, geralmente pela manhã, logo que as luzes estão ativadas.

2. preparação da solução

1. Preparar a mídia base dissolvendo 8,4 mg de mídia em pó em bidestilada H₂O (ddH₂O) e ajustar o pH para 7,4 com HCl ou NaOH, até um volume final de 1 L. Filter esterilizar esta solução com um filtro de cultura de tecidos de 0,22 µm.
   1. Adicione 1 M glicose e piruvato de sódio de 100 mM para os meios de comunicação para atingir concentrações finais de glicose de 5 mM e 1 mM piruvato.
   2. Lugar uma alíquota de 50 mL da mídia base em banho maria a 37 ° C.
2. Preparar a solução de Lise, para quantificação de tecido no final da análise de fluxo, adicionando a base tris 10 mM, polietileno glicol éter de tert-octilfenil a 0,2% (v/v) e EDTA 1 mm, todos em ddH₂Mix O. até que todos os componentes completamente dissolvido e ajustar pH para 8,0.
3. Para o protocolo de estresse mitocondrial, prepare um estoque de 11 µM de oligomicina, um inibidor da ATP sintase, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM no poço. Preparar um estoque de 11 µM de cianeto de carbonila - 4-(trifluorometoxi) phenylhydrazone (FCCP), um agente de desacoplamento, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM no poço. Preparar um coquetel de inibidores da cadeia de transporte de elétrons, rotenona e antimycin A (RAA), adicionando a rotenona a 11 µM e antimycin A para 22 µM, dissolvido em mídia de base para atingir uma concentração final de 1 µM rotenona e 2 µM antimycin A no bem.
4. Para o protocolo da glicólise, prepare um estoque de 220 mM de glicose dissolvido em base meios de comunicação, para atingir uma concentração final de 20 mM no poço. Também prepare um estoque de 1,1 M de 2-deoxyglucose (2-DG), um inibidor competitivo da glicose e antagonista glicolítico, dissolvendo-a em base meios de comunicação. Isso será alvo de uma concentração final de 100 mM 2-DG no poço.

3. calibragem

1. Para calibrar a instrumentação para um ensaio de fluxo extracelular, adicionar 1 mL de solução de calibração para cada poço do refil do sensor (total de 24 poços) e incubar a 37 ° C em uma CO₂-livre incubadora durante a noite (ou pelo menos 8 h).
2. Carregar os aditivos para o protocolo de estresse mitocondrial ou o protocolo de glicólise em cada porta-injector, À D, no cartucho de sensor, ajuste para variações de volume no poço.
   Nota: Por exemplo, um ensaio típico incluiria 45 µ l de aditivo para a primeira porta-injector, 49,5 µ l para o segundo, 54,5 µ l para o terceiro e 60 µ l para o último, assumindo um volume bem inicial de 450 µ l.
3. Durante as primeiras experiências diversas, carrega mídia base no Porto A medir quanto movimento/artefato de tecido ocorre depois de uma injecção.
4. Deixe a placa de sensor carregado incubar a 37 ° C numa incubadora de CO não₂ pelo menos 60 min.

4. isolamento do tecido Retinal Mouse fresco

Nota: Esta etapa é adaptada à técnica da Dr. Barry Winkler¹⁵.

1. Após administrar anestesia profunda, usando um padrão cocktail de xilazina/cetamina, eutanásia em ratos por deslocamento cervical.
2. Use um par de pinças curvas médias para agarrar o globo posterior no nervo óptico e aplicar suavemente a pressão para a frente de proptose do olho (figura 1A).
   1. Com uma lâmina de barbear limpa, crie uma incisão do limbo ao limbo entre a córnea usando um passe único, preciso da lâmina.
   2. Usando bem, fórceps de estilo McPherson angulado, beliscar o globo posterior para expressar a lente e membranas hialoide anteriores fora da incisão da córnea. Descarte desses tecidos.
   3. Repita a manobra beliscar com fórceps para expressar a retina neural.
   4. Para levantar a retina, ao invés de agarrar o tecido, usando a pinça como uma colher, transfira a retina longe da incisão da córnea e diretamente em uma mídia quente em um prato de 3cm ou uma placa de aglomerado de cultura de tecidos de 6-poços.
3. Use dois pares de pinças de McPherson-estilo fina, angulares para dissecar cuidadosamente restante vítreo da retina. Este é o melhor feito segurando o vítreo na periferia da Copa da retina e puxando em direção ao centro, com um final desinserção do corpo vítreo do centro como um todo. Usando a pinça, remova qualquer residual epithelium retinal do pigment da superfície fotorreceptoras da retina.
   1. Corte a ponta da pipeta P1000 com uma lâmina de barbear para criar uma abertura de ~ 4 mm para evitar trauma indevida para o delicado tecido da retina durante manobras de transferência.
   2. Transferi o tecido da retina isolado em fresca mídia usando uma corte ponta da pipeta P1000.
   3. Corte socos de 1 mm da retina ao redor do nervo óptico com uma biópsia de 1mm soco equipado com um êmbolo para desalojar o tecido, no caso de ele fica alojado na perfuração (figura 1B). Defina os socos da retina lado na mídia limpa mantido em um bloco de 37 ° C ou almofada de aquecimento.

5. protocolo do ensaio

1. Transferência individuais socos para microplacas de captura um ilhéu 24-bem usando uma corte ponta P1000, aspirando a 450 µ l de mídia juntamente com o tecido.
2. Use bem, pinça reta para manipular suavemente socos no centro do microplate. Mantenha socos orientados na mesma direção (por exemplo, gânglio célula lado para cima).
   1. Descanse a placa de captura em uma almofada de aquecimento ou aquecimento bloco conjunto a 37 ° C, como essas etapas são repetidas para as restantes amostras.
      Nota: Para cada experimento, Reserve 3-4 poços em branco com 450 µ l de mídia base para servir como controles negativos. Nos restantes 20-21 poços, teste cada biológico replicar em triplicado. Portanto, cada placa de 24 permitirá gravação de 6-7 diferentes animais ou condições de tratamento.
3. Evitando as bolhas de ar, delicadamente posição o ilhéu capturar malha inserções em cada poço usando fórceps e fixe as inserções com uma haste de metal, ou com uma ponta da pipeta P1000 corte (Figura 1 C).
   Nota: Evite o movimento excessivo tecido durante esta etapa para manter a posição da retina soco dentro do centro de microchamber a amostra. Bolhas de ar severamente distorcem leituras de OCR. Embora o microchamber tem profundidade suficiente para acomodar a retina típico do mouse (Figura 1), ocasionalmente, usinagem-defeitos nas inserções malha podem causar tecidos tornar-se excessivamente compactados durante a inserção de tela. Se isso acontecer, basta fazer uma nota do tecido esmagado e excluir essa amostra de análise final.
4. Incubar a placa de tecido em um de 37 ° C CO₂-incubadora livre pelo menos 60 min.
5. O analisador de fluxo extracelular usando Mix, espera, medida do programa e repita os comandos. Por exemplo, um experimento típico com tecido da retina pode incluir o seguinte: Misture 2 minutos, esperar 2 minutos e 5 minutos de medir. Repetir o experimento com estes três passos entre 5 - 8 vezes (ciclos) para uma gravação de base e após a injeção de cada composto sendo testado durante a execução.
6. Pressione o botão de arranque do programa sobre o analisador de fluxo extracelular e siga as instruções na tela para inserir o cartucho de sensor para calibração.
7. No final da calibração, siga as instruções na tela para substituir a placa de calibrant com a placa contendo as amostras da retina.
8. Permitir que o programa seja executado, conforme programado. Após a conclusão da execução, siga as instruções na tela para ejetar a placa de tecido. Exibir os resultados da execução e armazenar o arquivo de dados.
9. Com uma agulha de calibre 20 torta e fórceps, remova todas as inserções de malha dos poços, deixando o soco da retina.
10. Cuidadosamente Aspire a mídia no tecido e lave o tecido duas vezes com 0,5 mL de frio fosfato salino (PBS). Aspire a PBS após a lavagem.
11. Adicione 100 µ l de tampão de lise de cada poço e pipetar acima e para baixo para homogeneizar o tecido.
12. Dose os níveis de entrada com base no total DNA de cadeia dupla (dsDNA) ou conteúdo de proteína total.
    Nota: A seguir é baseada em um ensaio de dsDNA comercialmente disponível.
13. Diluir as amostras lisadas 1:1 adicionando-se 100 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) e transferir 100 µ l da amostra diluída para um prato bem 96.
    1. Adicione 100 µ l de tampão de deteção para cada poço. Após a mistura para 2-5 minutos, dosar fluorescência após excitação a 480 nm e emissão em 520 nm, comparando com uma curva padrão.
    2. Normalize o rastreamento de fluxo extracelular cru para conteúdo de DNA dentro do poço.
       Nota: Os resultados aqui apresentados, as amostras são normalizadas para 50 ng dsDNA - uma quantidade típica em um soco de 1 mm da retina. Portanto, valores absolutos apresentados aqui podem ser comparados aos estudos apresentando dados "por soco da retina". Normalize os traçados de um padrão interno, tais como a linha de base executar em uma concentração de glicose de 5 mM.

Resultados

Usando as técnicas descritas (resumidas na Figura 1), retinais explantes de 8 semanas de idade selvagem tipo (WT) de ratos foram comparados a idade - e fundo-combinada transducina nula ratos (Gnat1^{- / -}). Porque Gnat1^{- / -} animais não possuem a maquinaria para fechar nucleotídeo cíclico condomínio fechado de canais iônicos em resposta a estímulos de luz, os fotorreceptores haste permanecem despolarizadas...

Discussão

OCR e ECAR prontamente são medidos em explantados tecido retinal usando um bioanalyzer usando as técnicas descritas. Este método parte das de outros grupos em várias etapas críticas. Tecidos da retina são isolados por meio de uma grande incisão da córnea sem enucleating do globo, como foi originalmente descrito por Winkler¹⁵. Este método de isolamento da retina permite uma rápida transferência do olho vivo para a placa de captura de tecido (muitas vezes dentro de 5 minutos). Os tecidos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals