تصنيع السقالات مصفوفة ديسيلولاريزيد المستمدة من الغضروف

Summary

يمكن استخدام ديسيلولاريزيد السقالات المستمدة من الغضروف سقالة لإصلاح الغضروف دليل وكوسيلة لتجديد الأنسجة أوستيوتشوندرال. هذا الكتاب يصف عملية ديسيلولاريزيشن بالتفصيل ويوفر اقتراحات لاستخدام هذه السقالات في الإعدادات في المختبر.

Abstract

عيوب Osteochondral تفتقر إلى القدرة الكافية على إصلاح جوهري لتجديد أنسجة العظام والغضاريف السليمة وظيفيا. وإلى هذا الحد، قد ركزت البحوث الغضروف على تطوير السقالات التجدد. توضح هذه المقالة تطوير السقالات تماما المستمدة من المصفوفة خارج الخلية الغضروف الطبيعي، قادمة من جهة مانحة الخيول. وتشمل التطبيقات المحتملة للسقالات إنتاج اللوجرافتس لإصلاح الغضاريف، وصفه سقالة للأنسجة أوستيوتشوندرال الهندسية، وتوفير نماذج في المختبر لدراسة تشكيل النسيج. قبل ديسيلولاريزينج الأنسجة، تتم إزالة الخلايا المانحين، ولكن العديد من الرموز النشطة بيولوجيا الطبيعية ويعتقد أن الإبقاء على. والميزة الرئيسية لاستخدام هذه سقالة طبيعية بالمقارنة مع سقالة منتجة صناعيا أن لا الروغان المزيد من البوليمرات المطلوبة لتجديد الأنسجة أوستيوتشوندرال بالسيارة. يمكن استخدام السقالات المستمدة من الغضروف مصفوفة لتجديد أنسجة العظام والغضاريف في إعدادات المجراة في سواء في المختبر.

Introduction

عيوب غضروف مفصلي في الركبة بسبب الأحداث المؤلمة التي يمكن أن تؤدي إلى عدم الراحة، وقبل كل شيء يمكن أن يكون لها تأثير كبير على حياة السكان الشباب والنشطة^1،2،3. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي تلف الغضروف في سن مبكرة إلى ظهور أكثر سرعة من هشاشة العظام في وقت لاحق في الحياة⁴. حاليا، يتم العلاج الإنقاذ الوحيد لهشاشة العظام المعمم في الركبة جراحة استبدال المفاصل. كما غضروف هيبوسيلولار، أنيورال، والأنسجة أفاسكولار، محدودة جداً قدرتها على التجدد. ولذلك، يتم التماس نهج الطب التجديدي بعد المعونة وحفز التجدد قدرة الأنسجة الأصلية. ولهذا الغرض، تصمم السقالات ويستخدمها الجسم للخلايا الأصلية⁵أما خلية ناقل أو مادة استقرائية التي تحرض على التفرقة وتجديد الأنسجة.

وقد درست السقالات ديسيلولاريزيد على نطاق واسع في الطب التجديدي⁶. قد حققت بعض النجاح، على سبيل المثال، في المساعدة على تجديد الجلد⁷وهياكل البطن⁸الأوتار⁹. وميزة استخدام السقالات ديسيلولاريزيد هو أصلهم الطبيعية وقدرتها على الاحتفاظ بالرموز النشطة بيولوجيا أن كلا من جذب والحث على تمايز الخلايا إلى النسب الملائمة اللازمة لإصلاح الأنسجة^6،10. وعلاوة على ذلك، نظراً للمصفوفة خارج الخلية (ECM) مادة بيولوجية طبيعية، ويمنع ديسيلولاريزيشن استجابة المناعية محتملة عن طريق إزالة المحتوى الخلوية أو الوراثية، هي التغلب على المسائل المتعلقة بتوافق مع الحياة وتحلل الأحيائي.

السقالات مصفوفة المستمدة من الغضروف (إليه التنمية النظيفة) أظهرت تشوندروجينيك كبيرة محتملة في تجارب في المختبر عندما تبذر مع الخلايا اللحمية الوسيطة¹¹. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت هذه السقالات إمكانات لنسيج العظام النموذج عن طريق التحجر endochondral في مواقع خارج الرحم في إعدادات المجراة في¹². كما توجه إليه التنمية النظيفة السقالات التشكيل كل العظام وأنسجة الغضاريف، ويجوز عقد هذه السقالات المحتملة لإصلاح العيب أوستيوتشوندرال بالإضافة إلى إصلاح الغضاريف.

توضح هذه المقالة بروتوكول مقتبس من يانغ et al. (2010)¹³ لإنتاج ديسيلولاريزيد السقالات إليه التنمية النظيفة من الخيول خنق الغضروف. هذه السقالات غنية بالكولاجين من النوع الثاني، ويخلو من الخلايا، ولا تحتوي على أي الجليكوزامينوجليكان (الكمامات) بعد ديسيلولاريزيشن. يمكن إجراء تجارب في المختبر والمجراه في على حد سواء على إصلاح الخلل تشوندرال (osteo) باستخدام هذه السقالات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

لهذا البروتوكول، تم الحصول على خنق الخيلي الغضروف من الخيول التي قد توفي نتيجة لأسباب أخرى من هشاشة العظام. تم الحصول على الأنسجة بإذن أصحابها، وتمشيا مع القواعد الأخلاقية المؤسسية.

ملاحظة: ويصف هذا البروتوكول تصنيع السقالات من الغضروف الخيلي ديسيلولاريزيد، التي يمكن أن تستخدم للتطبيقات مثل أنظمة زراعة الأنسجة في المختبر أو في فيفو غرس في استراتيجيات الطب التجديدي. يجب تنفيذ الخطوات الانزيمية المعاملة حسب الترتيب الزمني المبين.

1-حصاد غضروف مفصلي من الجهات المانحة (المأخوذة) المفاصل

1. قدما خطوة الحصاد، إعداد 1 لتر غضروف الغسيل الحل، وتتألف من العقيمة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، وتستكمل مع 100 البنسلين يو/مليلتر، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 1% (v/v) باء الامفوتريسين
2. ارتداء القفازات ومعطف معمل أثناء إجراء الحصاد الكامل، حيث يمكن أن تحمل الجهة المانحة مسببات الأمراض.
3. الحصول مشترك (المأخوذة) سليمة لعزل الغضروف.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، الجلد حول المشترك لا تزال سليمة. غضروف خنق الخيول التي تم الحصول عليها من الحصان واستخدمت في هذا البروتوكول، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم المفاصل الأخرى من الأنواع الأخرى.
4. قم بإزالة الجلد الموجود حول مجال اهتمام مشترك باستخدام مشرط وملقط جراحي. وبالإضافة إلى ذلك، قم بإزالة أنسجة العضلات والدهون المفرطة إذا لزم الأمر، دون الأضرار المشتركة الكامنة. بشكل اختياري، نقل الجثث معدّة لسلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
5. لأداء أرثروتومي، أي، انفصالاً المشترك، أولاً بتحديد موقع حيث يحدد المشترك عن طريق إجراء التمديد والانحناء للمشترك.
6. بعناية إزالة طبقات أكثر من الدهون، والعضلات، والاوتار بدون مشرط وملقط الجراحة لفتح المنطقة المشتركة.
7. جعل شق للوصول إلى تجويف المشتركة.
   ملاحظة: تجويف مشترك مليء بالسائل الزليلي، الذي يمكن بالتنقيط من التجويف عند تنفيذ شق صحيح.
8. الاستمرار في فتح المشترك تماما بالقطع عن طريق الأوتار التي تبقى المشترك معا.
9. فحص الغضروف عن أي ضرر العيانية.
   ملاحظة: إذا لم يكن لدى غضروف مفصلي مظهر لامع وسلس أو إذا كان عنيفا واضحا أو الشقوق أو عيوب موجودة، تجاهل الغضروف.
10. استخدام مشرط معقم لإزالة الغضروف من عظم سوبتشوندرال. قطع كل الطريق وصولاً إلى عظم سوبتشوندرال لإزالة أيضا عميق منطقة الغضروف (الشكل 1). لمنع جفاف الغضروف، بانتظام بالتنقيط الغضروف الغسيل الحل في الغضروف.
    ملاحظة: وفي هذا الوقت، لا يهم حجم شرائح الغضروف.
11. جمع الشرائح غضروف في أنابيب 50 مل يحتوي على غضروف المجهز سابقا الغسيل الحل (الشكل 2A).
12. بعد جمع الغضروف من جميع المجالات التي تهم، تجميد الأداة شرائح غضروف في النتروجين السائل لمدة 5 دقائق.
13. نقل الشرائح غضروف في أنابيب 50 مل وفورا ليوفيليزي الشرائح ح 24 من غضروف في تجميد مجفف. تعيين التجميد مجفف في 0.090 تقريبا [مبر] بينما يكون مكثف الجليد-51 درجة مئوية (الشكل 2).
14. تخزين الشرائح غضروف في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها مرة أخرى.
    ملاحظة: تصل إلى نقطة تشكيل سقالة، الحلول والغضاريف لم يكن لديك يجب إعداد ومعاملتهم بطريقة عقيمة.

2. إنشاء ديسيلولاريزيد جسيمات الغضروف

1. سوبميرسي شرائح الغضروف المجففة بالتبريد بالنتروجين السائل.
2. طحن العينات مباشرة أما يدوياً أو بواسطة آلة طحن. عند طحن شرائح الغضروف من جهة، استخدام مدافع الهاون والمدقة وطحن الشرائح لحوالي 45 دقيقة حتى أنهم المسحوق (الشكل 2 و 2D). عند طحن تلقائياً، استخدم آلة طحن في سرعته المحددة مسبقاً لبضع ثوان حتى دقيقة، حتى يتم المسحوق شرائح الغضروف مجمدة في الأداة الإضافية.
   ملاحظة: قبل بارد الهاون أو حجرة طحن آلة طحن بإضافة النيتروجين السائل. عند استخدام ماكينة طحن، تأكد من أن جميع الجزيئات هي الأرض، وأن لا جزيئات البقاء في الجزء السفلي من حجرة الطحن.
3. منخل الجسيمات الغضروف للتخلص من أجزاء أكبر باستخدام غربال بحجم فتحات الشباك مم 0.71.
4. تخزين الجسيمات في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة.

3-الانزيمية ديسيلولاريزيشن مع التربسين 0.25%-EDTA

1. إعداد الحل الهضم، تتألف من التربسين 0.25% مع يدتا تستكمل مع 100 البنسلين U/mL، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و 1% (v/v) الامفوتريسين باء مخزن الحل عند 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: تريبين هو حوزتي التي تحط من البروتينات المقيمين في أنسجة الغضروف. سوف تفتح هذه الخطوة الانزيمية بنية الغضروف كثيفة.
2. ملء الأنابيب 50 مل مع الجسيمات الغضروف المسحوق حتى حجم حوالي 7.5 مل في الأنبوب.
3. احتضان الجسيمات الغضروف مع الحل الهضم المعدة في 37 درجة مئوية ح 24 في المجموع، أثناء تحديث الحل الهضم كل ح 4.
   1. أولاً، إضافة 30 مل الحل الهضم لكل أنبوب 50 مل يحتوي على جزيئات الغضروف.
   2. ثم، ريسوسبيند الجسيمات باستخدام دوامة أو بيبيت حيث أن جميع الجزيئات يتعرض للحل الانزيمية.
   3. العينات ح 4 في 37 درجة مئوية على اسطوانة احتضانها.
   4. لتحديث الحل الهضم، الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 3113 x ز يسبب ترسب الجسيمات الغضروف. تجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: المادة طافية سيصبح أكثر وضوحاً مع كل فترة الحضانة التربسين.
   5. كرر الخطوة 3.3.1–3.3.4 حتى الجسيمات قد تم المحتضنة مع الحل الهضم لدورات 6 ح 4.
4. بعد دورة النهائي، إزالة المادة طافية بعد سينتريفوجينج وتغسل الجسيمات في 30 مل غضروف الغسيل الحل مرتين. الطرد المركزي الجسيمات لمدة 20 دقيقة في 3113 x ز بين كل من يغسل.

4-الانزيمية ديسيلولاريزيشن مع العلاج نوكلاس

1. إعداد 10 ملم حل HCl تريس في درجة الحموضة 7.5 في المياه..
2. إضافة 50 يو/مليلتر deoxyribonuclease و ribonuclease يو/مليلتر 1 A إلى المخزن المؤقت تريس-HCl، للحصول على الحل نوكلياسي.
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتحط على وجه التحديد ديوكسيريبونوكليسيس وريبونوكليسيس.
3. لإزالة غضروف الغسيل الحل من الجسيمات الغضروف (الخطوة 3، 4)، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز، وإزالة المادة طافية.
4. إضافة 30 مل الحل نوكلاس للجسيمات الغضاريف وآثاره الجسيمات من خلال الحل، مع التأكد من أن جميع الجزيئات معرضون لحل نوكلاس.
5. احتضان هذه العينات على اسطوانة أجل ح 4 في 37 درجة مئوية.
6. إزالة الحل نوكلاس بالجسيمات الغضروف لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز سينتريفوجينج وتجاهل المادة طافية.
7. تغسل العينات بإضافة 30 مل 10 مم حل HCl تريس دون ديوكسيريبونوكليسي وريبونوكليسي أ للجسيمات الغضروف. ريسوسبيند الجسيمات وترك العينات اسطوانة ح 20 في درجة حرارة الغرفة.

5-المنظفات ديسيلولاريزيشن

1. جعل الحل المنظفات بإذابة 1% (v/v) أوكتوكسينول-1 في برنامج تلفزيوني.
2. إزالة الحل تريس-HCl من الجسيمات غضروف سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز وتجاهل المادة طافية.
3. إضافة 30 مل الحل المنظفات 1% مستعدة للجسيمات الغضروف. ريسوسبيند الجسيمات الغضروف برفق لتجنب الإرغاء من الحل.
   ملاحظة: هذه الخطوة ينهار الأغشية الخلوية.
4. العينات على اسطوانة أجل 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة على اسطوانة احتضانها.
5. إزالة الحل المنظفات بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3,113 س ز وتجاهل المادة طافية.
6. لإزالة كل بقايا الحلول ديسيلولاريزيشن، تغسل الجسيمات غضروف في 6 دورات ح 8 في 30 مل غضروف الغسيل الحل. أداء الغسيل على اسطوانة في درجة حرارة الغرفة.
   1. للتغيير إلى الغسيل القادمة، الطرد المركزي من تعليق لمدة 20 دقيقة في س 3,113 زوتجاهل المادة طافية وإضافة غضروف الطازجة الغسيل الحل.
7. ترك الغسيل الأخير في الأنابيب وتخزين الجسيمات غضروف ديسيلولاريزيد في-80 درجة مئوية.

6-إقامة السقالات من الجسيمات ديسيلولاريزيد

1. إذا تم تخزين الجسيمات في-80 درجة مئوية، ذوبان الجليد الأنابيب المغلقة التي تحتوي على جزيئات غضروف في الماء الدافئ قبل إنشاء السقالات.
2. نقل الجسيمات الغضروف مع مغرفة صغيرة إلى قالب أسطواني، على سبيل المثال، قنينة بلاستيكية مع قطرها 8 مم وارتفاعه 2 سم.
3. عند وضع الجسيمات الغضروف إلى العفن البلاستيك، اضغط جميع الهواء-الفقاعات بها لتجنب تسوس الأسنان في السقالة، وملء القالب حتى الحافة.
   ملاحظة: فإنه سيكون أكثر صعوبة لأن السقالات من العفن معدنية بعد تكوين سقالة، والذي يمكن أن يؤدي إلى تصدعات في السقالة.
4. تجميد القوالب مع جزيئات الغضروف لمدة 10 دقائق في-20 درجة مئوية.
5. ليوفيليزي السقالات الغضروف داخل على قوالب ح 24 في تجميد مجفف.
6. بعد lyophilization، تأخذ السقالة من العفن (الشكل 3) وتشابك لهم مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء على مسافة 30 سم و 365 نيوتن متر بين عشية وضحاها.
7. من أجل استخدام السقالات لزراعة الخلايا في المختبر أو غرس المجراة في، تعقيم السقالات مع، على سبيل المثال، الإثيلين أوكسيد (إيتو) الغاز.
   ملاحظة: إيتو التعقيم على طرف خارجي.

7-توصيف السقالات ديسيلولاريزيد مع ستينينجس النسيجي

ملاحظة: لضمان ديسيلولاريزيشن كاملة وتصور الحرف الطبيعية المتبقية من الغضروف، تنفيذ عدة ستينينجس النسيجي قبل استخدام السقالات في أي تجربة، بما في ذلك الهيماتوكسيلين وتلطيخ ويوزين (H & E) لضمان ديسيلولاريزيشن، سافرانين-O تلطيخ لتصور الوجود المتبقي لهفوة، الكولاجين النوع الأول إيمونوهيستوتشيميستري للتفريق بين المحتوى الكولاجين، والكولاجين النوع الثاني إيمونوهيستوتشيميستري للتفريق بين المحتوى الكولاجين.

1. قص السقالات في شرائح رقيقة حوالي 3 مم مع مشرط.
   ملاحظة: إذا قطعت السقالات في أحجام أكبر أو أصغر، مدد دورات الجفاف تحتاج إلى تكييف.
2. تضمين السقالات في قطره من 4% (w/v) الجينات وحمل العابرة للربط عن طريق إضافة كمية مماثلة من 3.7% فورمالين غير مخزنة يحتوي على 20 مم كاكل₂.
   ملاحظة: تضمين الجينات يجعل شرائح السقالة أكثر تشدداً مقارنة بخطوات الغسيل قبل تضمين البارافين. في حالة السقالات قد تم خلية المصنفة أو في فيفو مزروع، تضمين الجينات ليس من الضروري، كما سيتم تشكيل السقالات مقاومة كافية نظراً لإدماج إدارة المحتوى في المؤسسة بالخلايا.
3. يذوي العينات قبل وضعها في سلسلة متدرجة من إيثانول، بدءاً من دورات ساعة واحدة من 70%، 96%، 96%، 100%، و 100 ٪ الإيثانول، تليها دورتين ح 1 من زيلين نفط، وانتهاء بدورتين ح 1 من البارافين في 60 درجة مئوية.
4. بعد الجفاف، البارافين--تضمين العينات في العفن وتبريد العينات.
5. قطع العينات مع مبضع في شرائح من 5 ميكرومترات سميكة.
6. قبل التلوين، ترطيب العينات بوضعها في سلسلة إيثانول متدرج يتم إرجاعها. بدء تشغيل مع يغسل اثنين من زيلين نفط لمدة 5 دقائق، تليها يغسل 2 من الإيثانول 100%، 95%، و 70% لمدة 3 دقيقة للمياه والصرف الصحي. وأخيراً، غسل العينات 3 مرات في الماء لمدة 2 دقيقة.
   ملاحظة: في حالة استخدام الجينات لتجهيز العينات لتضمين البارافين، تأكد من يغسل الجينات مع حمض الستريك 10 ملم قبل الإماهة المقاطع البارافين.
7. وصمة عار العينات والهيماتوكسيلين ويوزين، سافرانين-س، الكولاجين أنا، والكولاجين الثاني كما هو موضح السابق¹¹.

8-توصيف السقالات ديسيلولاريزيد مع التحليلات الكمية

1. الحصول على الملخصات غراء من السقالات كما هو موضح سابقا¹¹.
2. القيام فحص مع مجموعة أدوات القياس الكمي الحمض النووي القائم على الأسفار لقياس محتوى الحمض النووي المزدوج-حبلا السقالات لضمان ديسيلولاريزيشن كاملة. يتبع البروتوكول توفيرها من قبل الشركة المصنعة. التعبير عن كمية الحمض النووي كل الوزن الجاف من السقالة.
3. القيام مقايسة ديميثيلميثيليني أزرق لتحديد ما تبقى الكمامات داخل السقالة، كما هو موضح سابقا¹¹. التعبير عن المبلغ في هفوة في الحمض النووي.

9-البذر للسقالات ديسيلولاريزيد

1. قص السقالات معقمة من الخطوة 6.7 في ملم 3 شرائح سميكة.
2. نقل السقالات في آبار منفصلة من لوحة 6-جيدا.
3. ترطيب السقالات مع خلية الثقافة المتوسطة التي بيبيتينج 1 مل من متوسطة فوق السقالة والسماح لها نقع 30 دقيقة لاستخدام تشوندروسيتي أو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) التوسع في المتوسط.
   ملاحظة: استخدام الوسيلة نفسها الإماهة سقالة أما بالنسبة للثقافة خلية من الخلايا التي سوف تكون المصنف. تشوندروسيتي توسيع المتوسطة يتكون من وسائل الإعلام دولبيكو تم التعديل (دميم) مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين 10 نانوغرام/مل تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو 2 (صندوق الأجيال القادمة-2). ماجستير التوسع متوسطة تتألف من الحد الأدنى ألفا المتوسطة الأساسية (-الفنزويلية) مع 10% الحرارة-إبطال FBS، 0.2 مم 2 فوسفات حمض الأسكوربيك L، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، و 10 نانوغرام/مل صندوق الأجيال القادمة-2.
4. إعداد 3 × 10⁶ خلايا في 100 ميكروليتر من المتوسطة، وهي وحدة التخزين المطلوبة لكل سقالة مع قطرها 8 مم وارتفاعه 3 مم.
   ملاحظة: يمكن استخدام العديد من أنواع الخلايا من مختلف الأنواع للبذر. عند استخدام تشوندروسيتيس أو الخلايا اللحمية الوسيطة، عزل الخلايا كما هو موضح سابقا¹¹. عند استخدام تشوندروسيتيس، تأكد من أن أنها لا تم توسيع الماضي مرور P1 بغية التقليل من عدد تشوندروسيتيس ديديفيرينتياتيد. عند استخدام الخلايا اللحمية الوسيطة، يجب اختبار قدرتها على التفريق بين نسب متعددة، كما هو موضح سابقا¹⁴.
5. بيبيت 50 ميكروليتر من إعداد تعليق خلية فوق سقالة غارقة قبل واحتضان السقالة ح 1 في 37 درجة مئوية.
6. تشغيل سقالة رأسا على عقب أسفل، ميكروليتر بيبيت 50 المتبقية من تعليق خلية في هذا الجانب من السقالة بعناية واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية.
7. بعد الحضانة، أضف 3 مل متوسطة إلى الآبار، وثقافة السقالات المصنف الخلية عند 37 درجة مئوية. التعامل مع لوحة الثقافة برفق لتجنب المفرزة من الخلايا.
8. الثقافة السقالات للفترة الوقت المطلوب للتجربة وتغيير المتوسطة 2 – 3 مرات في أسبوع. بيبيت بعيداً ببطء وإلى أقصى حد من السقالة قدر الإمكان.
9. بعد استزراع من السقالة المصنف الخلية، قص السقالات في النصف ومعالجتها للأنسجة والتحاليل البيوكيميائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يجب دائماً تأكيد ديسيلولاريزيشن سقالات إليه التنمية النظيفة باستخدام ستينينجس النسيجي، فضلا عن استخدام الحمض النووي التحديد الكمي لقياس كمية مخلفات الحمض النووي. ديسيلولاريزيشن غير كافية تؤدي إلى الاستجابات المناعية غير المرغوب فيها التي تؤثر على النتائج في إعدادات ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

إدارة المحتوى المؤسسي غضروف مفصلي كثيفة جداً ومرنة جداً للعلاجات الانزيمية المختلفة. بروتوكول ديسيلولاريزيشن متعددة الخطوات الموضحة في هذه المقالة يعالج هذه المقاومة وينشئ مصفوفات ديسيلولاريزيد بنجاح. ولتحقيق ذلك، العملية تمتد على مدى عدة أيام. تم اقتراح العديد من العمليات ديسيلولاري?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cadaveric joint			This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Amphotericin B	Thermo Fischer Scientific	15290026
Liquid nitrogen
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513
Triton X-100 (octoxynol-1)	Sigma-Aldrich	X100
Papain	Sigma-Aldrich	P3125
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Alginate	Sigma-Aldrich	180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylene
Paraffin
Ethylene oxide sterilization	Synergy Health, Venlo, the Netherlands
Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors			MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.
MEM alpha	Thermo Fischer Scientific	22561
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
Heat inactivated bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	10735086001
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)	R & D Systems	233-FB
DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
Freeze-dryer	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Analytical mill	IKA	A 11 basic
mortar/pestle	Haldenwanger 55/0A
Roller plate	CAT	RM5
Centrifuge (for 50 mL tubes)	Eppendorf	5810R
Capsule (cylindric mold)	TAAB	8 mm flat
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
Incubator
Microtome
Sieve (mesh size 0.71 mm)	VWR	34111229
Scalpel
Scalpel holder
Small laddle