Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Zusammenfassung

Decellularized Knorpel stammenden Gerüste als ein Gerüst, um Führer Knorpelreparatur sowie ein Mittel lässt sich um osteochondrale Gewebe zu regenerieren. Dieses Papier beschreibt den Decellularization Prozess im Detail und enthält Vorschläge, diese Gerüste in in-vitro-Einstellungen zu verwenden.

Zusammenfassung

Osteochondrale Defekte fehlen ausreichende intrinsische Reparatur Kapazität, funktionell gesunde Knochen und Knorpel Gewebe zu regenerieren. Insofern hat Knorpel Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung der regenerativen Gerüste. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Gerüsten, die vollständig aus natürlichen Knorpel extrazelluläre Matrix, aus einem equine Spender stammen. Mögliche Anwendungen der Gerüste sind produzieren Allografts für Knorpelreparatur, dienen als Gerüst für osteochondrale Tissue engineering und Bereitstellung von in-vitro-Modellen um Gewebeanordnung zu studieren. Von einem Gewebe, die Spenderzellen werden entfernt, aber viele der natürlichen bioaktiven Cues werden gedacht, um beibehalten werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer natürlichen Gerüst im Vergleich zu einem synthetisch hergestellten Gerüst ist, dass keine weiteren Funktionalisierung von Polymeren Laufwerk osteochondrale Geweberegeneration erforderlich ist. Die Knorpel-abgeleitete Matrix-Gerüste können für Knochen und Knorpel Geweberegeneration in in vivo und in vitro-Einstellungen verwendet werden.

Einleitung

Mängel der Gelenkknorpel im Knie verursacht durch traumatische Ereignisse können zu Unbehagen führen, und vor allem können haben einen großen Einfluss auf das Leben der jungen und aktiven Bevölkerung^1,2,3. Darüber hinaus kann Knorpelschäden an einem jungen Alter zu einen schnelleren Wirkungseintritt Arthrose später im Leben⁴führen. Derzeit ist die einzige Salvage-Therapie für generalisierte Osteoarthritis des Knies Gelenkersatz. Knorpel ist ein Hypocellular, Aneural und avaskuläre Gewebe, ist seine Regenerationsfähigkeit stark eingeschränkt. Regenerative Medizin Ansätze sind daher begehrt zu helfen und die Regenerationsfähigkeit der nativen Gewebe zu stimulieren. Zu diesem Zweck sind Gerüste entwickelt und verwendet als entweder Zellträger oder als eine induktive Material, die stachelt Differenzierung und Regeneration des Gewebes durch den Körper native Zellen⁵.

Decellularized Gerüste sind weit verbreitet in der regenerativen Medizin⁶untersucht worden. Es hatte einige Erfolge, beispielsweise bei der Unterstützung der Regeneration der Haut⁷, Abdominal-Strukturen⁸und Sehnen⁹. Der Vorteil der Verwendung decellularized Gerüste ist ihre natürlichen Ursprungs und ihre Fähigkeit, bioaktive Hinweise zu behalten, die sowohl anziehen und Zelldifferenzierung in der entsprechenden Linie für Gewebe-Reparatur-^6,-¹⁰erforderlich induzieren. Darüber hinaus sind da extrazellulärer Matrix (ECM) eine natürliche Biomaterialien ist und Decellularization eine mögliche Immunantwort verhindert durch Entfernen von zellulären oder genetischen Inhalten, Fragen der Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit überwinden.

Knorpel-abgeleitete Matrix (CDM) Gerüste haben große Chondrogenic im in-vitro-Experimente, wenn mit mesenchymaler Stromazellen Zellen¹¹ausgesät gezeigt. Darüber hinaus haben diese Gerüste das Potenzial, Form Knochengewebe durch Endochondral Verknöcherung auf ektopische Standorte in in-vivo Einstellungen¹²gezeigt. CDM-Gerüste führt die Bildung von beide Knochen und Knorpelgewebe, diese Gerüste Potenzial für osteochondrale defekt Reparatur neben Knorpelreparatur halten können.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll adaptiert von Yang Et Al. (2010)¹³ für die Herstellung von decellularized CDM-Gerüste von Equine ersticken Knorpel. Diese Gerüste sind reich an Kollagen Typ II und frei von Zellen und enthalten Glykosaminoglykane (GAGs) nach Decellularization. In vitro und in vivo Experimente an (Osteo) Chondral defekt Reparatur können mit diesen Gerüsten durchgeführt werden.

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Protokoll

Für dieses Protokoll wurde Pferde equine Knie Knorpel entnommen, die aus anderen Ursachen als Arthrose gestorben war. Gewebe wurde mit Erlaubnis der Besitzer, im Einklang mit den institutionellen ethischen Regelungen erhalten.

Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gerüsten aus decellularized equine Knorpel, die für Anwendungen wie in Vitro Zellkultur-Plattformen oder in Vivo Implantation in regenerative Medizin Strategien verwendet werden können. Die enzymatische Behandlungsschritte müssen in der beschriebenen Reihenfolge durchgeführt werden.

1. Gewinnung von Gelenkknorpel aus Spender (Cadaveric) Gelenke

1. Vor der Ernte Schritt bereiten Sie 1 L des Knorpels Waschlösung, bestehend aus sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 1 % (V/V) Amphotericin b.
2. Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel während der gesamten Ernteverfahren, da der Spender Krankheitserreger in sich tragen kann.
3. Erhalten Sie ein intakt (cadaveric) Gelenk Knorpel isoliert.
   Hinweis: An dieser Stelle ist die Haut um das Gelenk noch intakt. Equine Knie Knorpel entnommen Pferd wurde in dieses Protokoll verwendet, aber andere Gelenke von anderen Tierarten können auch verwendet werden.
4. Entfernen Sie die Haut, die rund um den gemeinsamen Bereich befindet, mit einem Skalpell und eine chirurgische Pinzette. Darüber hinaus entfernen Sie übermäßiges Fett und Muskel Gewebe bei Bedarf ohne Beschädigung der zugrunde liegenden gemeinsamen. Übertragen Sie die vorbereiteten Kadaver optional zum biologischen Sicherheitsschrank
5. Ausführen einer Arthrotomie, d.h., eine Trennung des Gelenks, definieren Sie zunächst den Speicherort, wo das Gelenk artikuliert durch Erweiterung und Beugung des Gelenks.
6. Entfernen Sie vorsichtig mehrere Schichten von Fett, Muskeln und Sehnen mit einem Skalpell und chirurgische Pinzette, die Lötstelle zu öffnen.
7. Machen Sie einen Schnitt, der Gelenkspalt zu erreichen.
   Hinweis: Der Gelenkspalt ist mit Gelenkflüssigkeit, die aus dem Hohlraum abtropft, bei der Durchführung eines korrekten Schnitt gefüllt.
8. Weiterhin geöffnet, das Gelenk vollständig durch Durchtrennung der Sehnen, die das Gelenk zusammenhalten.
9. Den Knorpel für makroskopische Schäden zu überprüfen.
   Hinweis: Verwerfen Sie wenn der Gelenkknorpel nicht über ein glänzend und glatt aussehen oder offensichtlich Blasenbildung, Risse oder Mängel vorhanden sind, den Knorpel.
10. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Knorpel aus dem subchondralen Knochen zu entfernen. Schneiden Sie hinunter den subchondralen Knochen, auch die tiefen Zone des Knorpels (Abbildung 1) zu entfernen. Damit den Knorpel nicht austrocknen, regelmäßig Tropfen Sie Knorpel Waschlösung auf den Knorpel.
    Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt spielt die Größe der Knorpel Scheiben keine Rolle.
11. Sammeln Sie die Knorpel-Scheiben in 50 mL Röhrchen mit vorbereiteten Knorpel Waschlösung (Abbildung 2A).
12. Nach dem Sammeln des Knorpels aus allen Bereichen des Interesses, Snap freeze Knorpel Scheiben in flüssigem Stickstoff für 5 min.
13. Die Knorpel-Scheiben in 50 mL Röhrchen übertragen und sofort lyophilize die Knorpel-Scheiben für 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage. Stellen Sie das Einfrieren Trockner auf ca. 0,090 Mbar während der Eis-Kondensator-51 ° C (Abb. 2 b) ist.
14. Lagern Sie die Knorpel-Scheiben bis zur Weiterverwendung an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Bis zu dem Punkt der Gerüst-Formation haben die Lösungen und Knorpel nicht vorbereitet und in eine sterile Weise behandelt werden.

2. Erstellen von Decellularized Knorpel Partikel

1. Eintauchen der lyophilisierter Knorpel Scheiben in flüssigem Stickstoff.
2. Schleifen Sie direkt die Proben entweder manuell oder durch eine Fräsmaschine. Wenn der Knorpel Scheiben von hand Schleifen, verwenden Sie einen Mörser und Stößel und Schleifen Sie die Scheiben ca. 45 Minuten, bis sie pulverisiert (Abbildung 2 und 2D) sind. Beim Schleifen von automatisch verwenden Sie eine Fräsmaschine mit der voreingestellten Geschwindigkeit für ein paar Sekunden bis zu einer Minute, bis die Snap eingefroren Knorpel Scheiben pulverisiert werden.
   Hinweis: Kühlen Sie durch Zugabe von flüssigem Stickstoff es zum Mörtel oder das Mahlfach der Fräsmaschine vor. Wenn eine Fräsmaschine verwenden, stellen Sie sicher, dass alle Partikel sind Boden und keine Partikel im unteren Teil das Mahlfach bleiben.
3. Die Knorpel-Partikel get rid of größere Teile durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,71 mm Sieb.
4. Lagern Sie die Partikel an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur.

(3) enzymatische Decellularization mit Trypsin 0.25%-EDTA

1. Bereiten Sie die Verdauung-Lösung, bestehend aus 0,25 % Trypsin mit EDTA ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 1 % (V/V) Amphotericin b Store die Lösung bei 4 ° C.
   Hinweis: Trypin ist eine Protease, die Proteine, die in das Knorpelgewebe degradiert. Diese enzymatische Schritt öffnet sich die dichten Knorpel Struktur.
2. Die pulverisierte Knorpel Partikel bis zu einem Volumen von etwa 7,5 mL pro Tube 50 mL Röhrchen einfüllen.
3. Inkubieren Sie die Knorpel-Partikel mit der vorbereiteten Verdauung-Lösung bei 37 ° C für 24 h insgesamt, während der Aktualisierung der Aufschlusslösung alle 4 h.
   1. Fügen Sie zunächst 30 mL der Lösung Verdauung zu jeweils 50 mL-Tube, die Knorpel Partikel enthält.
   2. Dann erneut die Partikel mithilfe eines Wirbel oder pipettieren, so dass alle Partikel, die enzymatische Lösung ausgesetzt sind.
   3. Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei 37 ° C auf einer Walze.
   4. Zum Aktualisieren der Aufschlusslösung Zentrifugieren der Rohre für 20 min bei 3113 X g Sedimentation der Knorpel Partikel verursachen. Verwerfen Sie den überstand.
      Hinweis: Der Überstand wird mit jedem Trypsin Inkubationszeit klarer.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.3.1–3.3.4, bis die Teilchen mit der Verdauung-Lösung für 6 Zyklen von 4 h inkubiert worden sind.
4. Nach dem letzten Zyklus den Überstand nach Zentrifugieren entfernen und die Partikel in 30 mL des Knorpels Waschlösung zweimal waschen. Zentrifugieren Sie die Partikel für 20 min bei 3113 X g zwischen den einzelnen Waschungen.

(4) enzymatische Decellularization mit Nuklease Behandlung

1. Bereiten Sie eine 10 mM Tris-HCl-Lösung bei pH 7,5 in entionisiertem Wasser.
2. Der Tris-HCl-Puffer, der Nuklease-Lösung zu erhalten fügen Sie 50 U/mL Deoxyribonuclease und 1 U/mL Ribonuklease A hinzu.
   Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um insbesondere Deoxyribonucleases und Ribonuclease verschlechtern.
3. Um den Knorpel Waschlösung aus Knorpel Partikel (Schritt 3.4) zu entfernen, für 20 min bei 3.113 X gZentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
4. Die Knorpel-Partikel 30 mL der Nuklease-Lösung hinzu und rühren Sie die Partikel durch die Lösung, um sicherzustellen, dass alle Partikel die Nuklease-Lösung ausgesetzt sind.
5. Inkubieren Sie die Proben auf einer Walze für 4 h bei 37 ° c
6. Die Nuklease-Lösung durch die Knorpel-Partikel für 20 min bei 3.113 X g Zentrifugieren entfernen und entsorgen des Überstands.
7. Waschen Sie die Proben durch Zugabe von 30 mL 10 mM Tris-HCl-Lösung ohne die Deoxyribonuclease und Ribonuklease A auf die Knorpel-Partikel. Aufschwemmen Sie die Partikel und lassen Sie die Proben auf einer Walze für 20 h bei Raumtemperatur.

5. Reinigungsmittel Decellularization

1. Machen Sie die Reinigungslösung durch Auflösen von 1 % (V/V) Octoxynol-1 mit PBS-Puffer.
2. Entfernen Sie die Tris-HCl-Lösung von den Knorpel-Teilchen indem für 20 min bei 3.113 X g Zentrifugieren und den Überstand verworfen.
3. 30 mL die vorbereitete Reinigungslösung von 1 % auf die Knorpel-Partikel hinzugeben. Aufschwemmen der Knorpel Partikel vorsichtig, um zu vermeiden, Schäumen der Lösung.
   Hinweis: Dieser Schritt bricht Zellmembranen.
4. Inkubieren Sie die Proben auf einer Walze für 24 h bei Raumtemperatur auf einer Walze.
5. Die Reinigungslösung durch Zentrifugation für 20 min bei 3.113 X g entfernen und entsorgen des Überstands.
6. Entfernen Sie alle Reste der Decellularization Lösungen gewaschen Sie die Knorpel-Partikel in 6 Zyklen von 8 h 30 ml des Knorpels Waschlösung werden. Durchführen Sie waschen auf einer Walze bei Raumtemperatur.
   1. Um in der nächsten Wäsche zu ändern, die Aufhängung für 20 min bei 3.113 X gZentrifugieren, überstand verwerfen und frischen Knorpel Waschlösung hinzufügen.
7. Verlassen der letzten Wäsche in den Rohren und speichern die decellularized Knorpel Partikel bei-80 ° C.

6. erstellen Gerüste von den Decellularized Partikeln

1. Wenn die Partikel bei-80 ° C gelagert worden, tauen Sie die geschlossenen Röhren, die den Knorpel Partikel in warmem Wasser enthalten, vor dem Erstellen der Gerüste.
2. Übertragen Sie die Knorpel-Partikel mit einer kleinen Kelle auf eine zylindrische Form, z. B. ein Kunststoff Fläschchen mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 2 cm.
3. Beim Platzieren von Knorpel-Partikel in der Kunststoff-Formenbau, drücken Sie alle Luftblasen, um Hohlräume in das Gerüst zu vermeiden, und füllen Sie die Form bis zum Rand zu.
   Hinweis: Es wird immer schwieriger, die Gerüste aus einer Metallform nach Gerüst Bildung nehmen, die zu Rissen in dem Schafott führen kann.
4. Frieren Sie die Formen mit Knorpel Partikel für 10 min bei-20 ° C.
5. Lyophilize der Knorpel Gerüste innerhalb ihrer Formen für 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage.
6. Nach der Gefriertrocknung, nehmen das Gerüst aus der Form (Abbildung 3) und vernetzen sie mit Ultraviolett (UV) Licht im Abstand von 30 cm und 365 nm über Nacht.
7. Um die Gerüste für in-vitro-Zellkultur oder in-vivo Implantation verwenden, Sterilisieren Sie die Gerüste mit, zum Beispiel Ethylen Oxid (EtO) Gas.
   Hinweis: EtO Sterilisation erfolgt durch eine externe Partei.

(7) Charakterisierung der Decellularized Gerüste mit histologischen Färbungen

Hinweis: Komplette Decellularization zu gewährleisten und den verbleibenden natürlichen Charakter des Knorpels zu visualisieren, führen Sie mehrere histologische Färbungen vor der Verwendung der Gerüste in jedem Experiment, einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung, um sicherzustellen Decellularization, Safranin-O Färbung um GAG Restpräsenz zu visualisieren, Kollagen Typ I Immunohistochemistry Unterscheidung zwischen Kollagengehalt und Kollagen Typ II Immunohistochemistry zwischen Kollagengehalt unterscheiden.

1. Schneiden Sie die Gerüste in dünne Scheiben von ca. 3 mm mit einem Skalpell.
   Hinweis: Die Gerüste in größeren oder kleineren Größen geschnitten werden, wenn die Dauer der Austrocknung Zyklen angepasst werden.
2. Betten Sie die Gerüste in einem Rückgang von 4 % (w/V) Alginat ein und induzieren Sie Vernetzung durch Zugabe von einem ähnlichen Volumen von 3,7 % nicht gepuffert Formalin, die 20 mM CaCl₂enthält.
   Hinweis: Einbetten von Alginat macht die Gerüst Scheiben mehr starr im Vergleich zu den Waschschritten vor Paraffin einbetten. Im Fall, dass die Gerüste Zelle ausgesät haben wurden oder in Vivo implantiert, ist die Einbettung von Alginat nicht erforderlich, da die Zusammensetzung der Gerüste resistent genug durch ECM-Aufnahme durch die Zellen werden.
3. Austrocknen der Proben durch Einlagerung in eine abgestufte Ethanol-Reihe, beginnend mit einer einstündigen Zyklen von 70 %, 96 %, 96 %, 100 % und 100 % Ethanol, gefolgt von zwei 1 h-Zyklen von Xylol und endend mit zwei 1 h-Zyklen von Paraffin bei 60 ° C.
4. Nach Austrocknung Paraffin-Einbetten der Proben in einer Form und kühlen die Proben ab.
5. Schneiden Sie die Proben mit ein Mikrotom in 5 μm dicke Scheiben.
6. Rehydrieren Sie vor der Färbung die Proben werden, indem sie in einer Reihe zurückgegebene abgestufte Ethanol. Beginnen Sie mit zwei Wäschen von Xylol für 5 min, gefolgt von 2 Wäschen von 100 %, 95 % und 70 % Ethanol für 3 min pro Waschgang. Schließlich waschen Sie die Proben 3 Mal in Wasser 2 min. lang.
   Hinweis: Stellen Sie bei der Verwendung von Alginat, um Proben für Paraffin einbetten zu verarbeiten sicher, das Alginat mit 10 mM Zitronensäure vor Rehydratation von Paraffin Abschnitte abwaschen.
7. Färben Sie die Proben mit Hämatoxylin und Eosin, Safranin-O, Kollagen I und Kollagen II als vorherigen beschriebenen¹¹.

(8) Charakterisierung der Decellularized Gerüste mit quantitativen Analysen

1. Erhalten Sie Papain verdaut die Gerüste wie oben beschrieben¹¹.
2. Führen Sie einen Test mit einem Fluoreszenz-basierte DNA Quantifizierung Kit zur Messung der Doppel-Strang DNA-Gehalt von Gerüsten, vollständige Decellularization zu gewährleisten. Das Protokoll des Herstellers zu folgen. Drücken Sie die Menge an DNA pro Trockengewicht des Gerüstes.
3. Führen Sie einen blauen Dimethylmethylene-Assay um den Rest der GAGs in das Gerüst zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben¹¹. Den Betrag in GAG pro DNA ausdrücken.

9. Aussaat Decellularized Gerüste

1. Schneiden Sie sterilisierte Gerüste aus Schritt 6,7 in 3 mm dicke Scheiben.
2. Die Gerüste in separaten Brunnen von einem 6-Well-Platte zu übertragen.
3. Gerüste mit Zellkulturmedium durch Pipettieren 1 mL des Mediums auf dem Schafott rehydrieren und lassen Sie es für 30 min. Einweichen Knorpelzelltransplantation oder mesenchymalen Stammzellen (MSC) Ausbau Medium verwenden.
   Hinweis: Verwenden Sie das gleiche Medium für Gerüst Rehydratation für Zellkultur der Zellen, die ausgesät werden. Knorpelzelltransplantation Erweiterung Medium besteht aus Dulbeccos veränderten Medien (DMEM) mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 10 ng/mL Fibroblasten Wachstumsfaktor-2 (FGF-2). MSC Erweiterung Medium besteht aus mindestens wesentliche mittlere Alpha (MEM) mit 10 % Hitze-inaktivierten FBS, 0,2 mM L-Ascorbinsäure Säure 2-Phosphat, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 10 ng/mL FGF-2.
4. Bereiten Sie 3 x 10⁶ Zellen in 100 μl Medium, welches das erforderliche Volumen für jedes Gerüst mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 3 mm ist.
   Hinweis: Für die Aussaat können mehrere Zelltypen aus verschiedenen Arten verwendet werden. Bei Verwendung von Chondrozyten oder mesenchymaler Stromazellen Zellen Isolieren Sie die Zellen wie oben beschrieben¹¹. Bei der Verwendung von Chondrozyten stellen Sie sicher, dass sie nicht hinter der P1-Passage um Minimierung der Anzahl von entdifferenzierten Chondrozyten erweitert wurden. Wenn Sie mesenchymale Stromazellen Zellen verwenden, müssen sie auf ihre Fähigkeit zur Differenzierung der Multi-Linie, wie zuvor beschrieben¹⁴getestet werden.
5. Pipettieren 50 μL der Zellsuspension auf dem eingeweichter Gerüst vorbereitet und das Gerüst für 1 h bei 37 ° c inkubieren
6. Vorsichtig drehen Sie das Gerüst auf den Kopf nach unten, pipettieren die restlichen 50 μL der Zellsuspension auf dieser Seite des Gerüstes und 1 h bei 37 ° c inkubieren
7. Nach der Inkubation der Brunnen 3 mL Medium hinzu, und Kultur der Zelle ausgesät Gerüste bei 37 ° C. Behandeln Sie die Kultur-Platte sanft um die Loslösung der Zellen zu vermeiden.
8. Kultur der Gerüste für die Zeit, die für das Experiment benötigt und das Medium 2 – 3 Mal pro Woche zu verändern. Pipettieren langsam und so weit weg von dem Gerüst wie möglich.
9. Nach der Kultivierung von Zellen ausgesät Gerüst, Halbierung der Gerüste und für Histologie und biochemische Analysen zu verarbeiten.

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Ergebnisse

Decellularization CDM Gerüste muss immer bestätigt werden, mit histologischen Färbungen sowie die Verwendung von DNA-Quantifizierung, um die Menge an DNA-Reste zu messen. Unzureichende Decellularization kann zu unerwünschten Immunreaktionen führen, die Einfluss auf die Ergebnisse in in-vivo Einstellungen^15,16,17. Für diese spezifische Decellularization-Methode, DNA war unter den Erfassungsb...

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Diskussion

Das ECM des Gelenkknorpels ist sehr dicht und sehr widerstandsfähig gegenüber verschiedenen enzymatischen Behandlungen. In diesem Artikel beschriebenen mehrstufigen Decellularization-Protokoll befasst sich mit solchen Widerstand und erfolgreich erzeugt decellularized Matrizen. Um dies zu erreichen, erstreckt sich der Prozess über mehrere Tage. Viele Decellularization Prozesse sind für verschiedene Arten von Gewebe¹⁸vorgeschlagen worden, und dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Dece...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cadaveric joint			This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Amphotericin B	Thermo Fischer Scientific	15290026
Liquid nitrogen
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513
Triton X-100 (octoxynol-1)	Sigma-Aldrich	X100
Papain	Sigma-Aldrich	P3125
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Alginate	Sigma-Aldrich	180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylene
Paraffin
Ethylene oxide sterilization	Synergy Health, Venlo, the Netherlands
Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors			MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.
MEM alpha	Thermo Fischer Scientific	22561
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
Heat inactivated bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	10735086001
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)	R & D Systems	233-FB
DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
Freeze-dryer	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Analytical mill	IKA	A 11 basic
mortar/pestle	Haldenwanger 55/0A
Roller plate	CAT	RM5
Centrifuge (for 50 mL tubes)	Eppendorf	5810R
Capsule (cylindric mold)	TAAB	8 mm flat
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
Incubator
Microtome
Sieve (mesh size 0.71 mm)	VWR	34111229
Scalpel
Scalpel holder
Small laddle