Изготовление подмостей Decellularized хряща производные матрица

Резюме

Decellularized хряща производные леса может использоваться как леска для восстановления хряща руководство и средства для регенерации ткани остеохондральные. Этот документ описывает процесс decellularization в деталях и предоставляет предложения использовать эти леса в настройках в пробирке.

Аннотация

Остеохондральные дефекты отсутствие достаточного потенциала внутреннего ремонта для регенерации функционально звук костной и хрящевой ткани. В этой степени хряща исследования были направлены на развитие регенеративные подмостей. Эта статья описывает развитие лесов, которые полностью являются производными от природных хряща внеклеточного матрикса, приходя от лошадиного донора. Потенциальные приложения подмостей включают производство аллотрансплантация тканей для ремонта хряща, выступающей в качестве лески для ткани остеохондральные инженерии и предоставление в пробирке модели для изучения формирования тканей. Decellularizing ткани, клеток донора будут удалены, но многие из натуральных биоактивных подсказки, мысли будет сохранена. Главное преимущество использования такого природного леса по сравнению с синтетическим леску является для регенерации тканей остеохондральные диска без дальнейших функционализации полимеров. Подмости хряща производные матрица может использоваться для регенерации костной и хрящевой ткани в настройках и в естественных условиях, так и in vitro.

Введение

Дефектов суставного хряща в колене, вызванные травматического события может привести к дискомфорту и прежде всего, могут иметь большое влияние на жизнь молодых и активного населения^1,2,3. Кроме того повреждение хряща в молодом возрасте может привести к более быстрым началом остеоартрита позднее в жизни⁴. В настоящее время только бабло терапия для обобщенных Артроз коленного сустава является эндопротезирование хирургия. Как гипоклеточные, aneural и аваскулярный ткани хряща, его регенеративные способности крайне ограничена. Таким образом регенеративной медицины подходы стремились после помощи и стимулировать регенеративные способности родной ткани. Для этой цели подмости разработаны и используются как либо клетки перевозчика или индуктивный материал, который подстрекает к дифференциации и регенерации тканей родной клетки тела⁵.

Decellularized леса были широко изучены в регенеративной медицине⁶. Она имела некоторый успех, например, в пособничестве регенерации кожи⁷, брюшной структуры⁸и⁹сухожилий. Преимущество использования decellularized лесов является их естественного происхождения и их способность сохранить биологически активные сигналы, которые привлекают и побудить клеточная дифференцировка в соответствующие линии, необходимые для ткани ремонт^6,10. Кроме того поскольку внеклеточного матрикса (ECM) является естественным биоматериала и decellularization предотвращает потенциальных иммунный ответ, удаляя содержимое сотовой или генетические, вопросы, касающиеся биосовместимость и способность к биологическому разложению преодолеваются.

Подмости хряща производные матрица (МЧР) показали большую хондрогенном потенциал в пробирке эксперименты, когда семенами с Мезенхимальные стромальные клетки¹¹. Кроме того эти леса показали потенциал для формы костной ткани через endochondral окостенение на внематочная мест в в естественных условиях настройки¹². Как руководство МЧР подмостей формирования обеих костей и хрящевой ткани, эти леса могут иметь потенциал для ремонта дефектов остеохондральные помимо хрящевой ткани.

Эта статья описывает протокол адаптированный Ян ¹³ et al. (2010) для производства decellularized МЧР подмости от лошадей задушить хряща. Эти леса богаты, коллаген типа II и лишенный клетки и не содержат каких-либо гликозаминогликанов (GAGs) после decellularization. В vitro и in vivo эксперименты по ремонту дефектов хондральные (Остео) может проводиться с использованием этих лесов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Для этого протокола Коневодство задушить хряща был получен от лошадей, которые умерли от других причин, чем остеоартрита. Ткань была получена с разрешения владельцев, в соответствии с институциональной этических правил.

Примечание: Этот протокол описывает изготовление подмостей от decellularized лошадей хряща, который может использоваться для приложений, таких как платформы тканевой культуры в vitro или в естественных условиях имплантации в регенеративной медицине стратегии. Ферментативная обработка шаги должны выполняться в хронологическом порядке, описанные.

1. заготовка суставного хряща от доноров (трупных) суставов

1. Впереди уборочной шага, подготовьте 1 Л хряща моющего раствора, состоящий из стерильных фосфат амортизированное saline (PBS), дополнены 100 ед/мл пенициллин 100 мкг/мл стрептомицина и 1% (v/v) амфотерицин B.
2. Надевайте перчатки и пальто лаборатории в течение всей процедуры сбора урожая, так как донор может снести патогены.
3. Получите нетронутыми (трупных) совместное для изоляции хряща.
   Примечание: На данный момент кожа вокруг сустава до сих пор нетронутыми. Лошадиный задушить хряща, полученные от лошади использовался в настоящем Протоколе, но могут также использоваться другие суставы от других видов.
4. Удаление кожи, который расположен вокруг области совместных интересов с помощью скальпеля и хирургический пинцет. Кроме того удаление излишней жировой и мышечной ткани, при необходимости, без повреждения основной совместной. При необходимости передачи подготовленных труп биологической безопасности кабинета.
5. Чтобы выполнить артротомии, т.е., разделение сустава, сначала определить местоположение, где совместное формулирует, выполняя расширение и сгибании сустава.
6. Осторожно удалите более слои жира, мышц и сухожилий с скальпель и хирургический пинцет открыть совместный области.
7. Сделайте надрез достичь полости сустава.
   Примечание: Совместная полость заполняется с синовиальной жидкости, которая может капать из полости при выполнении правильный разрез.
8. Далее открыть совместное полностью, проходящем через сухожилий, которые держать совместных вместе.
9. Осмотрите хряща для любой макроскопических ущерб.
   Примечание: Если суставного хряща не имеют глянцевый и гладкий внешний вид, или если видно вздутий, щели или дефекты присутствуют, отбросить хряща.
10. Для удаления хряща из субхондральной кости используйте стерильным скальпель. Вырежьте все, вплоть до субхондральной кости также удалить глубокие зоны хряща (рис. 1). Чтобы предотвратить хряща от высыхания, регулярно капать хряща моющего раствора на хрящ.
    Примечание: В это время не имеет значения размер кусочков хрящей.
11. Соберите фрагменты хряща в 50 мл пробирки, содержащие ранее подготовленных хряща моющего раствора (рис. 2A).
12. После сбора хряща от всех представляющих интерес областях, оснастки заморозить фрагменты хряща в жидком азоте за 5 мин.
13. Перенесите ломтики хряща в 50 мл трубки и сразу lyophilize фрагменты хряща для 24 h в заморозки сушка. Заход Замораживание сушки приблизительно 0.090 мбар а конденсатор льда-51 ° C (рис. 2B).
14. Храните фрагменты хряща в сухом месте при комнатной температуре до дальнейшего использования.
    Примечание: Вплоть до формирования эшафот решения и хряща, не должен быть подготовлен и стерильные обращение.

2. Создание Decellularized хряща частиц

1. Погружайте лиофилизированные хряща ломтики в жидком азоте.
2. Прямо шлифуют образцы вручную или путем фрезерный станок. При шлифовании фрагменты хряща вручную, используйте ступку и пестик и шлифуют ломтиками примерно 45 минут до тех пор, пока они являются вдувания (рис. 2 c и 2D). При шлифовании автоматически, используйте фрезерный станок с заданной скоростью в течение нескольких секунд до минуты, до тех пор, пока пылевидного хряща оснастки замороженные срезы.
   Примечание: Предварительно охлаждения раствора или отсеке шлифовальных фрезерного станка, добавив жидкого азота. При использовании фрезы, убедитесь, что все частицы являются земли, и что без частицы остаются в нижней части секции измельчения.
3. Сито хряща частицы избавиться от больших частей, используя сито с размером ячейки 0,71 мм.
4. Храните в сухом месте при комнатной температуре частицы.

3. ферментативный Decellularization с трипсином 0.25%-EDTA

1. Подготовить раствор пищеварение, состоящий из трипсин 0.25% с ЭДТА, дополняется 100 ед/мл пенициллин 100 мкг/мл стрептомицина и 1% (v/v) амфотерицин B. магазина решение при 4 ° C.
   Примечание: Trypin является протеазы, что ухудшает белки, проживающих в хрящевой ткани. Это ферментативный шаг откроет плотной хрящевой структуры.
2. Заполните трубы 50 мл с частицами вдувания хряща до объема приблизительно 7,5 мл трубки.
3. Инкубируйте хряща частиц с подготовленной пищеварение решения при 37 ° C для 24 часа в общей сложности, при обновлении пищеварение решение каждые 4 ч.
   1. Во-первых добавьте 30 мл раствора пищеварения каждый Тюбик 50 мл, содержащего частицы хряща.
   2. Затем Ресуспензируйте частицы с помощью вихревого или пипетки так, что все частицы подвергаются ферментативной решения.
   3. Проинкубируйте образцы для 4 ч при 37 ° C на ролике.
   4. Чтобы обновить решение пищеварение, центрифуга трубы для 20 минут 3113 x g вызывать оседания частиц хряща. Выбросите супернатант.
      Примечание: Супернатант станет яснее с каждый трипсина инкубационный период.
   5. Повторите шаг 3.3.1–3.3.4 до тех пор, пока частицы были инкубировали с пищеварением решения для 6 циклов 4 ч.
4. После окончательной цикла удалить супернатант после центрифугирования и мыть частицы в 30 мл моющего раствора дважды хряща. Центрифуга частиц для 20 минут 3113 x g между каждым из стирок.

4. ферментативный Decellularization с лечением Нуклеаза

1. Подготовка 10 мм трис-HCl решение при pH 7.5 в деионизированной воде.
2. Добавьте 50 дезоксирибонуклеаза ед/мл и 1 ед/мл рибонуклеазы А в буфер Tris-HCl, чтобы получить решение нуклеиназы.
   Примечание: Этот шаг выполняется специально деградировать deoxyribonucleases и рибонуклеаз.
3. Чтобы удалить хряща, моющего раствора из хряща частиц (шаг 3.4), центрифуги для 20 минут, 3 113 x gи удалить супернатант.
4. Добавить 30 мл раствора нуклеиназы частиц хряща и размешать частицы через решение, убедившись, что все частицы подвергаются к решению нуклеиназы.
5. Проинкубируйте образцы на ролике за 4 ч при 37 ° C.
6. Удаление решения нуклеиназы центрифугированием хряща частиц для 20 минут, 3 113 x g и удалить супернатант.
7. Стирать образцы, добавив 30 мл 10 мм трис-HCl решение без дезоксирибонуклеаза и рибонуклеазы А частицы хряща. Ресуспензируйте частицы и оставить образцы на рольганг для 20 ч при комнатной температуре.

5. стиральный порошок Decellularization

1. Сделать стиральный раствор, растворяя 1% (v/v) octoxynol-1 в PBS.
2. Удаление решения трис-HCl из хряща частиц, центрифугирование для 20 минут, 3 113 x g и отменяя супернатант.
3. Добавьте 30 мл приготовленного раствора моющего средства 1% частиц хряща. Ресуспензируйте хряща частицы осторожно, чтобы избежать пенообразования решения.
   Примечание: Этот шаг разрушает клеточные мембраны.
4. Проинкубируйте образцы на ролике за 24 ч при комнатной температуре на ролике.
5. Удалить моющим центрифугированием для 20 минут, 3 113 x g и удалить супернатант.
6. Чтобы удалить все остатки decellularization решений, мыть хряща частиц в 6 циклов 8 h 30 мл моющего раствора хряща. Выполните Стиральная ролика при комнатной температуре.
   1. Чтобы изменить следующий мыть, центрифуга подвеска для 20 минут, 3 113 x g, удалить супернатант и добавить свежие хряща моющего раствора.
7. Оставьте последний мыть в трубах и хранить decellularized хряща частицы-80 ° c.

6. Создание леса из Decellularized частиц

1. Если частицы были сохранены при температуре-80 ° C, оттепель закрытые трубы, которые содержат частицы хряща в теплой воде перед созданием подмостей.
2. Передать хряща частиц с ковшик цилиндрической формы, например, пластиковый флакон с диаметром 8 мм и высотой 2 см.
3. При размещении хряща частиц в пластиковые плесень, нажмите все-пузырьки воздуха, чтобы избежать пустот в леса и заполнить форму до края.
   Примечание: Это будет более трудно принять леса из металлической формы после формирования эшафот, что может привести к трещинам в эшафот.
4. Замораживание формы с частицами хряща для 10 мин при-20 ° C.
5. Lyophilize хряща леса в пределах их формы для 24 h в заморозки сушка.
6. После лиофилизации, возьмите леска из формы (рис. 3) и перекрестные ссылки их с ультрафиолетового (УФ) света на расстоянии 30 см и 365 Нм на ночь.
7. Чтобы использовать подмости для культуры в пробирке клеток или в естественных условиях имплантации, стерилизуйте подмости с, например, этилен оксид (ВЭТО).
   Примечание: EtO стерилизации производится с внешней стороны.

7. характеристика Decellularized леса с гистологическим Stainings

Примечание: Для обеспечения полной decellularization и визуализировать оставшиеся естественный характер хряща, выполните несколько гистологические stainings перед использованием подмости в любом эксперименте, включая гематоксилином и эозином (H & E) пятная для обеспечения decellularization, Safranin-O пятнать визуализировать остаточного присутствия кляп, коллаген типа I иммуногистохимия различать содержание коллагена и коллаген типа II иммуногистохимия различать содержание коллагена.

1. Вырежьте подмости в тонкими ломтиками примерно в 3 мм с помощью скальпеля.
   Примечание: Если подмости вырезаны в больших или меньших размеров, длительности циклов обезвоживания должны быть адаптированы.
2. Внедрить подмости в капле 4% (w/v) Альгинатные и побудить cross-linking путем добавления аналогичный объем 3,7% без буферизации формалин, содержащий 20 мм CaCl₂.
   Примечание: Альгинат Встраивание делает эшафот ломтики более жесткие по сравнению с стиральная шаги до внедрения парафина. В случае подмости были клетки семенами или в vivo имплантируются альгинат встраивание не является необходимым, как состав подмостей будет достаточно устойчивы, за счет включения ECM клетками.
3. Обезвоживает образцы, поместив их в серии градуированных этанола, начиная с циклами один час, 70%, 96%, 96%, 100% и 100% этанола, следуют два цикла 1 h ксилол и заканчивая двух циклов 1 h парафина на 60 ° C.
4. После обезвоживания парафин внедрить образцы в плесень и охлаждения образцов.
5. Вырежьте образцы с микротом ломтиками толщиной 5 мкм.
6. До окрашивания, увлажняет образцы, помещая их в серии возвращенные градуированных этанола. Начните с двумя моет ксилоле на 5 мин, следуют 2 моет 100%, 95% и 70% этанола 3 мин в мыть. Наконец стирайте образцы 3 раза в воде в течение 2 мин.
   Примечание: В случае использования альгината для обработки образцов для встраивания парафин, убедитесь, что смывать альгината с лимонной кислотой 10 мм до регидратации парафиновых срезах.
7. Пятно образцы с гематоксилином и эозином, Safranin-O, коллаген I и коллаген II как предыдущий описано¹¹.

8. характеристика Decellularized леса с количественного анализа

1. Получите папаин дайджесты подмостей, как описано выше¹¹.
2. Выполните assay с комплектом количественного определения ДНК на основе флуоресценции, измерить содержание ДНК двухручьевой лесов для обеспечения полной decellularization. Следуйте протокола, предусмотренного заводом-изготовителем. Экспресс количество ДНК в сухой вес эшафот.
3. Выполните dimethylmethylene синий пробирного для количественного определения оставшуюся часть приколов в пределах леса, как описано выше¹¹. Экспресс сумма в кляп в ДНК.

9. посев Decellularized подмостей

1. Вырежьте стерилизованные подмости от шага 6.7 в 3 мм толщиной ломтиками.
2. Передача лесов в отдельных скважинах 6-ну плиты.
3. Увлажняет подмости с клетки культуры среднего дозирования 1 мл среды на вершине эшафот и дайте ему впитаться в течение 30 мин использовать хондроцитов или расширение среды мезенхимальных стволовых клеток (МСК).
   Примечание: Используйте той же среде для регидратации леску для клеточной культуры клеток, которые будет заполнена. Расширение среднего хондроцитов состоит из Дульбекко изменение средств массовой информации (DMEM) с 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и 10 нг/мл фибробластический фактор роста-2 (FGF-2). MSC расширения среды состоит из минимум основных средних альфа (MEM) с 10% тепло инактивированная FBS, 0,2 мм L-Аскорбиновая кислота 2-фосфат, пенициллин 100 ед/мл, 100 мкг/мл стрептомицина и 10 нг/мл ФБП-2.
4. Подготовка 3 х 10⁶ клеток в 100 мкл среды, которая является требуемый объем для каждого леса с диаметром 8 мм и высотой 3 мм.
   Примечание: Несколько типов клеток из разных видов могут использоваться для заполнения. При использовании хондроцитов или Мезенхимальные стромальные клетки, изолируйте клетки как описано¹¹. При использовании хондроцитов, убедитесь, что они не были расширены мимо P1 проход для того, чтобы свести к минимуму количество Дедифференцированная хондроцитов. При использовании мезенхимальных стромальных клеток, они должны испытываться на их способности для дифференциации мульти линии, как описано выше¹⁴.
5. Накапайте 50 мкл готовую суспензию клеток на вершине предварительно замоченные эшафот и инкубировать леска для 1 ч при 37 ° C.
6. Осторожно поверните леску вверх вниз, накапайте оставшиеся 50 мкл суспензии клеток на этой стороне леса и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C.
7. После инкубации добавить 3 мл среды скважин и культура клетки посеян подмости на 37 ° C. Обработайте пластину культуры осторожно, чтобы избежать отряд клеток.
8. Культура подмости для периода времени, необходимого для выполнения эксперимента и изменить среднего 2 – 3 раза в неделю. Накапайте медленно и насколько далеко от леса как можно скорее.
9. После культивирования клеток посеян эшафот, разрезать пополам подмостей и обрабатывать их для гистологии и биохимические анализы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Decellularization МЧР подмостей всегда должна быть подтверждена с помощью гистологические stainings, а также с помощью ДНК количественной оценки для измерения количества ДНК останков. Недостаточная decellularization может привести к нежелательным иммунологических ответов, которые влия?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ECM суставного хряща, очень плотные и очень устойчивы к различных ферментных методов лечения. Многоступенчатые decellularization протокол, описанные в этой статье рассматривается такое сопротивление и успешно создает decellularized матрицы. Для достижения этого, этот процесс охватывает в течение нес?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cadaveric joint			This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Amphotericin B	Thermo Fischer Scientific	15290026
Liquid nitrogen
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513
Triton X-100 (octoxynol-1)	Sigma-Aldrich	X100
Papain	Sigma-Aldrich	P3125
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Alginate	Sigma-Aldrich	180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylene
Paraffin
Ethylene oxide sterilization	Synergy Health, Venlo, the Netherlands
Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors			MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.
MEM alpha	Thermo Fischer Scientific	22561
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
Heat inactivated bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	10735086001
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)	R & D Systems	233-FB
DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
Freeze-dryer	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Analytical mill	IKA	A 11 basic
mortar/pestle	Haldenwanger 55/0A
Roller plate	CAT	RM5
Centrifuge (for 50 mL tubes)	Eppendorf	5810R
Capsule (cylindric mold)	TAAB	8 mm flat
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
Incubator
Microtome
Sieve (mesh size 0.71 mm)	VWR	34111229
Scalpel
Scalpel holder
Small laddle