ייצור של מטריקס הסחוס, נגזר Decellularized פיגומים

Summary

פיגומים הסחוס, נגזר decellularized יכול לשמש בדומה לפיגום כדי לתקן סחוס מדריך וכאמצעי לחדש רקמות osteochondral. מאמר זה מתאר את התהליך decellularization בפירוט ומספק הצעות להשתמש פיגומים אלו בהגדרות במבחנה.

Abstract

פגמים Osteochondral חוסר יכולת תיקון מהותי מספיק להתחדש באופן פונקציונלי קול רקמת עצם, סחוס. במידה זו, סחוס המחקר התמקדה הפיתוח של פיגומים משובי. מאמר זה מתאר את ההתפתחות של פיגומים הנגזרים לחלוטין מטריצה חוץ-תאית טבעיים הסחוס, מגיע תורם הרכיבה. יישומים אפשריים של פיגומים כוללים הפקת allografts לתיקון הסחוס, הגשה לפיגום בשביל לרקמות osteochondral הנדסה ואספקת דגמים במבחנה ללמוד היווצרות רקמה. על ידי decellularizing את הרקמה, תאי התורם מוסרות, אך רבים של המקלות ביו טבעי נחשבים יישמרו. היתרון העיקרי של שימוש לפיגום טבעי לעומת לפיגום לאכסון המיוצר הוא כי אין functionalization נוספת של פולימרים נדרשת התחדשות רקמות osteochondral נסיעה. פיגומים מטריקס הסחוס-derived יכול לשמש עבור התחדשות רקמות עצם, סחוס בהגדרות ויוו והן במבחנה.

Introduction

פגמים הסחוס במפרק הברך נגרמת על ידי אירועים טראומטיים עלול לגרום אי נוחות, ומעל הכל יכולה להיות השפעה גדולה על חייהם של צעירים ובעלי האוכלוסייה^1,2,3. יתר על כן, נזק לסחוס בגיל צעיר עלול להוביל התחלה מהירה יותר של דלקת מפרקים ניוונית בהמשך החיים⁴. כיום, הטיפול ההצלה היחיד עבור כללית דלקת מפרקים ניוונית של הברך הוא ניתוח החלפת מפרק. כמו סחוס hypocellular, aneural, רקמות avascular, יכולת ההתחדשות שלה מוגבל חמור. לכן, רפואה רגנרטיבית גישות רבים מחפשים סיוע ולעורר יכולת ההתחדשות של הרקמה הטבעית. למטרה זו, פיגומים שתוכננו ועברו המשמש כנשא או תא- או כחומר אינדוקטיבית, אשר מסית בידול והתחדשות של רקמת תאים מקורית של הגוף⁵.

פיגומים decellularized נחקרו באופן נרחב בתוך רפואה רגנרטיבית⁶. זה היה הצלחה מסוימת, לדוגמה, מסייע לרגנרציה של העור⁷, מבנים בטן⁸גידים⁹. היתרון של שימוש פיגומים decellularized הוא המקור הטבעי שלהם והיכולת שלהם לשמור על רמזים ביואקטיביות זה גם מושך וגם לגרום תאית התמיינות לתוך שושלת היוחסין המתאים הנדרש בשביל לרקמות תיקון^6,10. יתר על כן, כיוון מטריצה חוץ-תאית (ECM) הוא biomaterial טבעי, decellularization מונע לתגובה החיסונית פוטנציאליות על-ידי הסרת תוכן סלולרי או גנטי, סוגיות הנוגעות הביו ו biodegradability יש להתגבר.

פיגומים מטריקס הסחוס, נגזר (CDM) הראו chondrogenic נהדר פוטנציאליים ניסויים במבחנה כאשר נזרע עם תאי סטרומה mesenchymal¹¹. בנוסף, פיגומים אלו הראו פוטנציאל טופס רקמת העצם דרך התקשות endochondral על מקומות חוץ רחמי הגדרות ויוו¹². כמו CDM פיגומים מדריך היווצרות של שניהם עצם, רקמת סחוס, פיגומים אלו שמשקיעים פוטנציאליות לתיקון פגם osteochondral בנוסף לתקן סחוס.

מאמר זה מתאר פרוטוקול חיבור מקורי יאנג et al. (2010)¹³ לייצור של פיגומים CDM decellularized של סוסים להחניק את הסחוס. פיגומים אלו הם עשירים ב סוג הקולגן השנייה של תאים, אינם מכילים כל glycosaminoglycans (GAGs) לאחר decellularization. ניסויים במבחנה וגם ויוו על תיקון פגם chondral (osteo) יכול להתבצע באמצעות פיגומים אלו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

עבור פרוטוקול זה, סחוס חנוק הסוסים היה המתקבלים סוסים שמתו מגורמים אחרים מאשר דלקת מפרקים ניוונית. רקמות הושג עם הרשאת הבעלים, בקנה אחד עם תקנות אתיות מוסדיות.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של פיגומים מן הסחוס אקווין decellularized, אשר יכול לשמש עבור יישומים כגון חוץ גופית בתוך תרביות רקמה פלטפורמות או ויוו השרשה רפואה רגנרטיבית אסטרטגיות. השלבים טיפול אנזימטי חייב להתבצע לפי הסדר הכרונולוגי המתואר.

1. קצירת סחוס במפרק של התורם המפרקים (Cadaveric)

1. קדימה של השלב האיסוף, להכין 1 ליטר של הסחוס הכביסה פתרון, המורכב סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), בתוספת 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 1% (v/v) b. שהוא גוסס
2. ללבוש כפפות, חלוק מעבדה במהלך כל תהליך האיסוף, מאז התורם יכול לשאת פתוגנים.
3. השג של המפרק (cadaveric) ללא פגע לבידוד הסחוס.
   הערה: בשלב זה, העור סביב המפרק הוא עדיין שלם. הסחוס חנוק אקווין המתקבל הסוס היה בשימוש פרוטוקול זה, אך אחרים המפרקים ממינים אחרים יכול לשמש גם.
4. מסירים את העור הנמצא סביב אזור משותף עניין באמצעות אזמל של פינצטה כירורגית. בנוסף, להסיר רקמות שריר ושומן עודף במידת הצורך, מבלי לפגוע המפרק המשמש כבסיס. באופן אופציונלי, העברת הגופה מוכן בטיחות ביולוגית ארון.
5. לביצוע של arthrotomy, כלומר, הפרדה של המפרק, תחילה להגדיר את המיקום שבו המפרק מבטאת על-ידי ביצוע בטווח תנועות של המפרק.
6. הסר בזהירות יותר שכבות של שומן, השרירים, הגידים עם האזמל, פינצטה כירורגית כדי לפתוח את אזור משותף.
7. לעשות חתך כדי להגיע את חלל משותף.
   הערה: חלל משותף מלא בנוזל synovial, אשר ניתן לטפטף מן החלל בעת ביצוע חתך הנכון.
8. ממשיכים לפתוח את המקום לגמרי על-ידי לחתוך הגידים זה לשמור המשותפת ביחד.
9. בדוק את הסחוס בגין כל נזק מאקרוסקופית.
   הערה: אם אין הסחוס במפרק מראה מבריק וחלק או אם ניכר שלפוחיות, בתרי, או פגמים קיימים, למחוק את הסחוס.
10. השתמש באזמל סטרילי כדי להסיר את הסחוס של עצם subchondral. חותכים כל הדרך אל עצם subchondral גם להסיר את אזור עמוק של הסחוס (איור 1). כדי למנוע את הסחוס מתייבשת, באופן קבוע לטפטף הסחוס כביסה פתרון על הסחוס.
    הערה: בשלב זה, לא משנה גודל הפרוסות הסחוס.
11. לאסוף את הפרוסות הסחוס 50 מ ל צינורות המכיל הסחוס בעבר מוכן לשטוף פתרון (איור 2 א).
12. לאחר איסוף הסחוס לכל תחומי עניין, הצמד להקפיא את הפרוסות הסחוס בחנקן נוזלי במשך 5 דקות.
13. להעביר את הפרוסות הסחוס לתוך צינורות 50 מ ל, מיד lyophilize את הפרוסות הסחוס במשך 24 שעות ביממה בהקפאה מייבש. לקבוע מדיניות ההקפאה מייבש mbar כ 0.090 אמנם מעבה הקרח-51 ° C (איור 2B).
14. לאחסן את הפרוסות הסחוס במקום יבש בטמפרטורת החדר עד להמשך השימוש.
    הערה: עד לנקודה של היווצרות לגרדום, והפתרונות סחוס אין צורך להיות מוכן ומטופל באופן סטרילי.

2. יצירת Decellularized הסחוס חלקיקים

1. Submerse את פרוסות סחוס lyophilized חנקן נוזלי.
2. לטחון את הדגימות ישירות באופן ידני או על ידי מכונת הטחינה. כאשר שחיקה את הפרוסות הסחוס בעבודת יד, השתמש ומכתש, לטחון את הפרוסות במשך כ 45 דקות עד שהם השמיד (איור 2C ו- 2D). כאשר שחיקה אוטומטי, להשתמש מכונת הטחינה במהירות שלו מוגדר מראש לכמה שניות עד דקה, עד הפרוסות מוקפאים snap הסחוס הם לא....
   הערה: מראש מגניב המליטה או תא שחיקה של מכונת הטחינה בהוספת חנקן נוזלי. בעת שימוש מכונת הטחינה, ודא כי כל החלקיקים הם הקרקע, כי אין חלקיקי להישאר בחלק התחתון של תא שחיקה.
3. ניפוי החלקיקים סחוס כדי להיפטר חלקים גדולים יותר באמצעות מסננת עם גודל רשת מ מ 0.71.
4. אחסן את החלקיקים במקום יבש בטמפרטורת החדר.

3. אנזימטי Decellularization עם טריפסין 0.25%-EDTA

1. להכין את הפתרון עיכול, המורכב של 0.25% טריפסין עם EDTA בתוספת 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/mL 100 ו- 1% (v/v) שהוא גוסס ב' חנות הפתרון ב 4 º C.
   הערה: Trypin הוא פרוטאז זה מבזה חלבונים המתגוררים רקמת סחוס. שלב אנזימטי זה יפתח את מבנה הסחוס צפופה.
2. למלא את צינורות 50 מ עם החלקיקים הסחוס השמיד עד נפח של-7.5 mL למחזור.
3. דגירה החלקיקים סחוס עם הפתרון עיכול מוכן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בסך הכל, מרעננים את הפתרון העיכול כל 4 שעות.
   1. ראשית, להוסיף 30 מ של הפתרון העיכול כל שפופרת 50 מ ל המכיל חלקיקים הסחוס.
   2. לאחר מכן, resuspend את החלקיקים באמצעות למערבולת או pipet כך כל החלקיקים נחשפים הפתרון אנזימטיות.
   3. דגירה בדגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס על גלגלת.
   4. כדי לרענן את הפתרון עיכול, centrifuge הצינורות כעשרים דקות ב g x 3113 לגרום שיקוע של החלקיקים הסחוס. למחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: תגובת שיקוע יהפוך ברורים עם כל תקופת דגירה של טריפסין.
   5. חזור על שלב 3.3.1–3.3.4 עד החלקיקים מודגרות עם הפתרון לעיכול עבור 6 מחזורים של 4 שעות.
4. לאחר המחזור האחרון, להסיר את תגובת שיקוע לאחר צריך שתוציאו ולשטוף את החלקיקים ב 30 מ של הסחוס שטיפה פתרון פעמיים. Centrifuge למשך 20 דקות ב g x 3113 בין כל שוטף החלקיקים.

4. אנזימטי Decellularization בטיפול נוקלאז

1. הכינו 10 מ מ טריס-HCl פתרון ב- pH 7.5 במים יונים.
2. להוסיף מאגר טריס-HCl, כדי לקבל את הפתרון נוקלאז deoxyribonuclease U/mL 50 ו- U/mL 1 ribonuclease A.
   הערה: שלב זה מבוצע כדי לבזות במיוחד deoxyribonucleases ו- ribonucleases.
3. כדי להסיר את הסחוס שטיפה פתרון של החלקיקים סחוס (שלב 3.4), צנטריפוגה כעשרים דקות ב 3,113 x g, ולהסיר את תגובת שיקוע.
4. להוסיף 30 מ של הפתרון נוקלאז החלקיקים הסחוס ומערבבים את החלקיקים דרך הפתרון, לוודא כי כל החלקיקים נחשפים הפתרון נוקלאז.
5. דגירה בדגימות על גלגלת במשך 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.
6. להסיר את הפתרון נוקלאז על ידי צריך שתוציאו את החלקיקים הסחוס כעשרים דקות ב 3,113 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
7. לשטוף את הדוגמאות על-ידי הוספת 30 מ ל 10 מ מ טריס-HCl פתרון ללא deoxyribonuclease ואת ribonuclease A החלקיקים הסחוס. Resuspend החלקיקים ולהשאיר את הדגימות רולר עבור 20 h בטמפרטורת החדר.

5. Decellularization דטרגנט

1. להפוך את הפתרון דטרגנט על ידי המסת 1% (v/v) octoxynol-1 ב- PBS.
2. הסר את הפתרון טריס-HCl החלקיקים סחוס מאת צריך שתוציאו בשביל 20 דקות ב 3,113 x g ומחיקת את תגובת שיקוע.
3. להוסיף 30 מ של הפתרון דטרגנט מוכן 1% החלקיקים הסחוס. Resuspend החלקיקים הסחוס בעדינות כדי להימנע קצף של הפתרון.
   הערה: שלב זה נשברת ממברנות הסלולר.
4. דגירה בדגימות על גלגלת עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר על גלגלת.
5. להסיר את הפתרון דטרגנט על ידי צנטריפוגה כעשרים דקות ב 3,113 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
6. כדי להסיר את כל השאריות של הפתרונות decellularization, לשטוף את החלקיקים הסחוס ב- 6 מחזורים של 8 h ב- 30 מ של הסחוס שטיפה פתרון. לבצע כביסה על גלגלת בטמפרטורת החדר.
   1. כדי לשנות בכביסה הבאה, centrifuge המתלה למשך 20 דקות ב 3,113 x g, למחוק את תגובת שיקוע והוסף הסחוס טרי שטיפת פתרון.
7. להשאיר כביסה האחרון את החצוצרות שלה ולאחסן את חלקיקי סחוס decellularized ב-80 מעלות צלזיוס.

6. יצירת פיגומים החלקיקים Decellularized

1. אם החלקיקים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס, להפשיר הצינורות סגורות המכילות את הסחוס החלקיקים במים חמים לפני יצירת פיגומים.
2. להעביר את החלקיקים סחוס עם מצקת קטנה תבנית גלילי, לדוגמה, בקבוקון פלסטיק בקוטר של 8 מ מ, בגובה של 2 ס מ.
3. בשעת מיקום החלקיקים הסחוס לתוך כייר פלסטיק, הקש על כל-מבועות האויר החוצה כדי למנוע עששת ב לגרדום, למלא את התבנית עד הקצה.
   הערה: זה יהיה יותר קשה לקחת פיגומים מתוך תבנית מתכת לאחר היווצרות לגרדום, אשר יכול להוביל סדקים לגרדום.
4. להקפיא את התבניות עם סחוס חלקיקים 10 דקות ב-20 ° C.
5. Lyophilize פיגומים הסחוס בתוך שלהם ליציקות 24 שעות בהקפאה מייבש.
6. לאחר lyophilization, השתמש בפיגומים העובש (איור 3), קשר צולב אותם עם אולטרה סגול (UV) אור-30 ס"מ והמרחק 365 nm בין לילה.
7. על מנת להשתמש פיגומים תרבית תאים במבחנה או השרשה ויוו, לעקר פיגומים בגז, לדוגמה, אתילן אוקסיד (EtO).
   הערה: עיקור EtO מתבצע על ידי חיצוני.

7. אפיון של פיגומים Decellularized עם Stainings היסטולוגית

הערה: כדי להבטיח decellularization מלאה וכדי להמחיש את האופי הטבעי הנותרים של הסחוס, לבצע מספר stainings היסטולוגית לפני השימוש פיגומים בניסוי כלשהו, לרבות hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת כדי להבטיח decellularization, Safranin-O צביעת להמחיש נוכחות איסור פרסום שיורית, קולגן מסוג I אימונוהיסטוכימיה להבחין בין תוכן קולגן, קולגן מסוג II אימונוהיסטוכימיה להבחין בין תוכן קולגן.

1. חותכים פיגומים פרוסות דקות של 3 מ מ עם אזמל.
   הערה: אם פיגומים נחתכים בגדלים גדולים יותר או קטנים יותר, משך הזמן של המחזורים התייבשות צורך להתאים.
2. להטביע פיגומים ירידה של 4% (w/v) alginate, לגרום cross-linking על-ידי הוספת נפח דומה של 3.7% שאינם באגירה פורמלין המכיל 20 מ מ CaCl₂.
   הערה: קילוף פלסטיצידיות הטבעה הופכת את הפרוסות לגרדום נוקשה יותר לעומת השלבים כביסה לפני פרפין הטבעה. התיק שפיגומים יש כבר תא מתחילה או ויוו מושתל, alginate הטבעת היא לא הכרחי, כמו ההרכב של פיגומים יהיה עמיד מספיק עקב התאגדות ECM על ידי התאים.
3. מייבשים את הדוגמאות על ידי הצבתם סדרה מדורגת אתנול, החל שעה מחזורים של 70%, 96%, 96%, 100% ו 100% אתנול, ואחריו שני מחזורים 1 h של קסילן, ומסתיימת שני מחזורים 1 h של פרפין ב 60 מעלות צלזיוס.
4. לאחר התייבשות, פרפין-להטביע את הדגימות תבנית, לקרר את הדגימות.
5. חותכים את הדגימות עם מיקרוטום בפרוסות בעובי 5 μm.
6. לפני צביעת, נתרענן הדגימות על-ידי הצבתם בסדרה המוחזרת אתנול מדורגת. להתחיל עם שני שוטף של קסילן במשך 5 דקות, ואחריו שוטף 2 של אתנול 100%-95%, 70% למשך 3 דקות לכל לשטוף. לבסוף, יש לשטוף את הדגימות 3 פעמים במים למשך 2 דקות.
   הערה: במקרה של שימוש alginate לעבד דגימות של פרפין הטבעה, הקפידו לשטוף את alginate בחומצה ציטרית 10 מ מ, טרם התייבשות של הסעיפים פרפין.
7. כתם הדגימות ועם hematoxylin אאוזין, Safranin-O, קולגן, קולגן II כפי שמתואר הקודם¹¹.

8. אפיון של פיגומים Decellularized עם כמותני

1. להשיג פפאין מעכל של פיגומים כפי שתואר לעיל¹¹.
2. ביצוע וזמינותו עם מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית DNA כימות ערכת כדי למדוד את תכולת ה-DNA כפול-strand פיגומים כדי להבטיח decellularization מלאה. לפי התקנון המסופקים על ידי היצרן. לבטא את כמות ה-DNA לפי משקל יבש של לגרדום.
3. ביצוע וזמינותו של dimethylmethylene כחול כדי לכמת את שארית GAGs בתוך לגרדום, כפי שתואר לעיל¹¹. מבטאים את הכמות באיסור פרסום לכל ה-DNA.

9. זריעה של פיגומים Decellularized

1. חותכים פיגומים סטיריליים מהשלב 6.7 לתוך 3 מ מ פרוסות עבות.
2. העברת פיגומים בבארות נפרדים של צלחת 6-. טוב.
3. נתרענן פיגומים בינונית התרבות התא על ידי pipetting 1 מ"ל של מדיום על הגרדום. ולהניח לזה משרים למשך 30 דקות להשתמש chondrocyte או תאי גזע mesenchymal (MSC) הרחבה בינונית.
   הערה: השתמש המדיום אותו על התייבשות לגרדום באשר תרבית תאים התאים להיות נזרע. Chondrocyte הרחבה בינונית מורכב מדיה שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין μg/mL 100 ננוגרם למ"ל 10 פיברובלסט גורם גדילה-2 (FGF-2). MSC הרחבה בינונית מורכב מינימום אלפא בינוני חיוניים (-מ) עם 10% חום-לא פעיל FBS, 0.2 מ מ 2 חומצה אסקורבית L-פוספט, פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין μg/mL 100 ו- 10 ננוגרם למ"ל FGF-2.
4. להכין 3 x 10⁶ תאים 100 μL בינוני, המהווה אמצעי האחסון הנדרש עבור כל לגרדום בקוטר של 8 מ מ, בגובה של 3 מ מ.
   הערה: סוגי תאים מרובים של מינים שונים יכול לשמש זריעה. בעת שימוש chondrocytes או mesenchymal תאי סטרומה, לבודד את התאים כפי שתואר לעיל¹¹. בעת שימוש chondrocytes, ודא כי הם לא שהורחבו אחרי המעבר P1 על מנת לצמצם את מספר dedifferentiated chondrocytes. בעת שימוש בתאי סטרומה mesenchymal, הם חייבים להיבדק על פי יכולתם של בידול השושלת מרובה, כפי שתואר לעיל¹⁴.
5. Pipet 50 μL של מוכן תא התלוי מעל לגרדום טרום רטוב, דגירה לגרדום עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
6. להפוך לגרדום הפוך למטה, μL pipet ה-50 הנותרים של השעיה התא בצד הזה של לגרדום ובזהירות תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
7. לאחר דגירה, להוסיף 3 מ"ל של מדיום הבארות, וכן תרבות פיגומים נזרע תא ב 37 º C. להתמודד עם לוח תרבות בעדינות כדי למנוע ניתוק של התאים.
8. תרבות פיגומים עבור תקופת הזמן הדרוש לניסוי ולשנות את המדיום 2-3 פעמים בשבוע. Pipet לאט, הרחק הרחק מן לגרדום ככל האפשר.
9. לאחר culturing של לגרדום נזרע תא, לחתוך פיגומים במחצית ולעבד אותם עבור היסטולוגיה וניתוחים הביוכימי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תמיד וחייבות להיות מאושרות decellularization של CDM פיגומים באמצעות stainings היסטולוגית, כמו גם באמצעות כימות דנ א כדי למדוד את כמות ה-DNA שרידים. Decellularization לא מספיק עלול להוביל רצויה תגובות חיסוניות להשפיע על תוצאות הגדרות ויוו^15,16,17. ע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ה-ECM של הסחוס במפרק הוא מאוד צפוף, די גמיש לטיפולים אנזימטיות שונות. פרוטוקול צעד מרובת decellularization המתואר במאמר זה מטפל בכזאת התנגדות ומייצר בהצלחה מטריצות decellularized. כדי להשיג את זה, התהליך משתרע על פני מספר ימים. תהליכים decellularization רבים הוצעו עבור סוגים שונים של רקמות¹⁸, מאמר זה מת?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cadaveric joint			This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Amphotericin B	Thermo Fischer Scientific	15290026
Liquid nitrogen
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513
Triton X-100 (octoxynol-1)	Sigma-Aldrich	X100
Papain	Sigma-Aldrich	P3125
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Alginate	Sigma-Aldrich	180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylene
Paraffin
Ethylene oxide sterilization	Synergy Health, Venlo, the Netherlands
Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors			MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.
MEM alpha	Thermo Fischer Scientific	22561
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
Heat inactivated bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	10735086001
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)	R & D Systems	233-FB
DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
Freeze-dryer	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Analytical mill	IKA	A 11 basic
mortar/pestle	Haldenwanger 55/0A
Roller plate	CAT	RM5
Centrifuge (for 50 mL tubes)	Eppendorf	5810R
Capsule (cylindric mold)	TAAB	8 mm flat
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
Incubator
Microtome
Sieve (mesh size 0.71 mm)	VWR	34111229
Scalpel
Scalpel holder
Small laddle