Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

요약

Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.

초록

Osteochondral 결함 기능 소리 뼈와 연골 조직을 재생 하기 충분 한 내장 복구 용량을 부족 합니다. 이 정도로 연골 연구 재생 장비의 개발에 집중 했다. 이 문서는 완전히 말 기증자에서 오는 자연 연골 세포 외 매트릭스에서 파생 된 장비의 개발을 설명 합니다. 장비의 잠재 애플리케이션으로 이식 연골 수리, osteochondral 조직 공학, 생체 외에서 모델 연구 조직 형성을을 제공 하 고 발판으로 봉사에 대 한 생산. Decellularizing 조직, 여 기증자 세포 제거 됩니다, 하지만 많은 천연 생리 활성 신호 유지 될 것으로 생각 되. 종합적으로 생산된 비 계에 비해 자연 비 계를 사용 하 여의 주요 장점은 고분자의 아무 더 기능화 드라이브 osteochondral 조직 재생 하는 데 필요한입니다. 연골에서 파생 된 매트릭스 건설 기계는 vivo에서 그리고 생체 외에서 설정에서 뼈와 연골 조직 재생을 위해 사용할 수 있습니다.

서문

충격적인 사건으로 인 한 무릎 관절 연골 결함, 불편으로 이어질 수 있습니다 그리고 특히 젊고 활동적인 인구^1,2,3의 생활에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 젊은 나이에 연골 손상을 인생⁴나중에 관절염의 더 급속 한 발병 될 수 있습니다. 현재, 무릎의 일반화 된 관절염에 대 한 유일한 구조 치료는 합동 보충 수술입니다. 연골은 hypocellular, aneural, 및 avascular 조직, 재생 능력은 심각 하 게 제한 됩니다. 따라서, 재생 의학 접근은 원조 하 고 네이티브 조직의 재생 능력을 자극 후 모색. 이 목적을 위해 건설 기계 설계 되며 신체의 기본 셀⁵중 세포 운반대로 또는 차별화와 조직의 재생을 incites 유도 물자로 사용.

Decellularized 건설 기계 재생 의학⁶내에서 널리 공부 되었습니다. 그것은 했다 약간의 성공을, 예를 들어 피부⁷,⁸, 복 부 구조 및 힘 줄⁹의 재생성을 방 조에. Decellularized 건설 기계를 사용 하 여의 장점은 그들의 자연적인 근원 및 그들의 능력을 모두 유치 하 고 조직 수리^6,10에 필요한 적절 한 혈통으로 세포 분화를 유도 하는 생리 활성 신호 유지. 또한, 세포 외 기질 (ECM)은 자연 소재 decellularization 세포 또는 유전자 콘텐츠를 제거 하 여 잠재적인 면역 반응을 방지 하는 때문에, 생체 적합성 및 biodegradability에 관한 문제는 극복 됩니다.

연골에서 파생 된 매트릭스 (CDM) 건설 기계 mesenchymal stromal 세포¹¹시드 때 체 외 실험에서 잠재적인 큰 chondrogenic을 보여왔다. 또한, 이러한 건설 기계 vivo에서 설정¹²소성 위치에 endochondral 나오고 통해 양식 뼈 조직에 잠재력을 보여왔다. CDM 건설 기계 가이드의 형성 둘 다 뼈 고 연골 조직, 이러한 건설 기계 연골 수리 이외에 osteochondral 결함 수리에 대 한 잠재적인 취소 될 수 있습니다.

이 문서에서는 설명 합니다 양에서 적응 프로토콜 외. (2010)¹³ 말에서 decellularized CDM 장비의 생산에 대 한 억압 연골. 이 건설 기계 콜라겐 유형 II에 셀, 없는 풍부 하 고 decellularization 후 어떤 있다 (개 그)를 포함 하지 않습니다. 이러한 건설 기계를 사용 하 여 (osteo) chondral 결함 수리에 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 수행할 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 대 한 말 억압 연골 관절염 보다 다른 원인에서 죽 었다는 말에서 얻은 했다. 조직 기관 윤리 규정에 따라 소유자의 허가 함께 얻은 것입니다.

참고: 이 프로토콜에 체 외 조직 문화 플랫폼 등 응용 프로그램에 대 한 또는 vivo에서 이식 재생 의학 전략에 대 한 사용할 수 있는 decellularized 말 연골에서 장비의 제조를 설명 합니다. 설명 시간 순서 대로 효소 처리 단계를 수행 해야 합니다.

1. 기증자 (시체) 관절에서 관절 연골의 수확

1. 앞서 수확 단계 준비 솔루션을 세척, 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 1% (v/v) 암포 B. 보충 구성 된 연골의 1 L
2. 때문에 기증자는 병원 균을 수행할 수 있습니다 전체 수확 절차 중 장갑 및 실험실 외 투를 착용 합니다.
3. 연골 격리에 대 한 손상 (시체) 공동 얻을.
   참고: 이 시점에서, 관절 주위 피부는 그대로 이다. 말에서 얻은 말 억압 연골이이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나 다른 종에서 다른 관절을 사용할 수 있습니다.
4. 메스와 수술 족집게를 사용 하 여 관심 있는 공동 영역 주위에 피부를 제거 합니다. 또한, 기본 관절 손상 없이 과도 한 지방과 근육 조직이 필요한 경우 제거 합니다. 필요에 따라 생물 안전 캐비닛을 준비 시체를 전송 합니다.
5. arthrotomy, 즉 수행, 공동의 분리 먼저 공동 확장 및 관절의 굴곡을 수행 하 여 articulates 위치를 정의 합니다.
6. 조심 스럽게 지방, 근육, 그리고 힘 줄 메스와 공동 영역을 열고 수술 트위터의 더 많은 레이어를 제거 합니다.
7. 공동 구멍을 도달 하는 절 개를 확인 합니다.
   참고: 공동 구멍은 정확한 절 개를 수행할 때 구멍에서 똑 수 있는 활 액 액체, 가득 합니다.
8. 여 합동을 완전히 함께 관절을 유지 하는 힘 줄을 통해 절단 하 여 계속 합니다.
9. 거시적인 손상 연골을 검사 합니다.
   참고: 관절 연골에는 광택 하 고 부드러운 외관 또는 분명 젖어, clefts, 또는 결함이 있는 경우 연골을 삭제 합니다.
10. 마찰의 뼈에서 연골을 제거 하는 살 균 메스를 사용 합니다. 마찰의 뼈 연골 (그림 1)의 깊은 영역 제거까지 잘라. 연골 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 정기적으로 연골 연골에 솔루션을 세척 똑.
    참고: 이 시점에서 연골 조각의 크기는 중요 하지 않습니다.
11. 세척 솔루션 (그림 2A) 이전 준비 연골을 포함 하는 50 mL 튜브에 연골 조각을 수집 합니다.
12. 관심의 모든 영역에서 연골을 수집 후 스냅 연골 조각 5 분 액체 질소에서 동결.
13. 50 mL 튜브로 연골 조각을 전송 및 즉시 동결 건조 기에서 24 h에 대 한 연골 슬라이스를 lyophilize. 동결 건조 기에서 설정 약 0.090 mbar 얼음 콘덴서는-51 ° C (그림 2B).
14. 추가 사용까지 연골 조각 실 온에서 건조 한 장소에 저장 합니다.
    참고: 비 계 형성의 지점 솔루션 및 연골 필요가 없습니다 준비 하 여 살 균 방식에서으로 처리.

2. 만들기 Decellularized 연골 입자

1. 액체 질소에서 동결 건조 된 연골 조각을 submerse합니다
2. 수동으로 또는 밀링 기계에 직접 샘플을 갈기. 연골 조각 손으로 연 삭, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 고 분쇄 (그림 2C 및 2D) 때까지 약 45 분에 대 한 슬라이스를 갈기. 자동 연 삭 할 때 최대 1 분, 스냅-냉동 연골 조각 분쇄 된 때까지 몇 초 동안 미리 설정된 속도에 밀링 기계를 사용 합니다.
   참고: 액체 질소를 추가 하 여 박격포 또는 융기의 분쇄 구획을 멋진 사전. 밀링 기계를 사용 하면 모든 입자는 지상, 그리고 아무 입자 연 삭 구획의 바닥에 남아 있는지 확인 합니다.
3. 0.71 m m 매쉬의 크기와 체를 사용 하 여 큰 부품의 제거를 연골 입자 체질.
4. 실 온에서 건조 한 장소에 입자를 저장 합니다.

3. 효소 Decellularization 트립 신으로 0.25%-EDTA

1. EDTA와 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 1% (v/v) 암포 B. 저장소 솔루션 4 ° c.에 보충으로 0.25 %trypsin 이루어져 소화 솔루션 준비
   참고: Trypin은 연골 조직에 있는 단백질을 저하 효소 이다. 이 효소 단계는 조밀한 연골 구조를 열 것 이다.
2. 50 mL 튜브 튜브 당 약 7.5 mL의 볼륨까지 분쇄 연골 입자 채우십시오.
3. 새로 고치 소화 솔루션 마다 4 h 동안 총에서 24 h에 대 한 37 ° C에서 준비 된 소화 솔루션 연골 입자를 품 어.
   1. 먼저, 연골 입자를 포함 하는 각 50 mL 튜브에 소화 솔루션의 30 mL를 추가 합니다.
   2. 그런 다음 모든 입자는 효소 솔루션에 노출 되도록 소용돌이 또는 피펫으로 사용 하 여 입자를 resuspend.
   3. 롤러에 37 ° C에서 4 h에 대 한 샘플을 품 어.
   4. 소화 솔루션을 새로 고치려면, 연골 입자의 침전을 3113 x g 20 분에 대 한 튜브 원심. 폐기는 상쾌한.
      참고: 상쾌한 모든 트립 신 잠복기와 명확 하 게 될 것 이다.
   5. 3.3.1–3.3.4 단계를 반복 하 여 입자 4 h의 6 주기 위한 소화 솔루션 incubated 되어 있다.
4. 마지막 주기 이후 centrifuging 후는 상쾌한을 제거 하 고 두 번 솔루션을 세척 하는 연골의 30 mL에 입자를 세척 합니다. 3113 x g는 세척의 각각 사이 20 분 동안 입자 원심

4. 효소 Decellularization Nuclease 치료

1. 10 mM Tris HCl 해결책 pH 이온된 수 7.5에서 준비 합니다.
2. 50 U/mL deoxyribonuclease 및 1 U/mL ribonuclease A nuclease 솔루션을 얻기 위해 Tris HCl 버퍼에 추가 합니다.
   참고: 이 단계는 특히 deoxyribonucleases와 ribonucleases를 저하 수행 됩니다.
3. 연골 입자 (3.4 단계)에서 솔루션을 세척 하는 연골을 제거 하려면 3,113 x g에 20 분 동안 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
4. 연골 입자에 nuclease 솔루션의 30 mL를 추가 하 고 모든 입자 nuclease 솔루션에 노출 되어 있는지 확인 하 고 솔루션을 통해 입자를 저 어.
5. 4 h 37 ° c.에 대 한 롤러에 샘플을 품 어
6. 3,113 x g 에서 20 분 동안 연골 입자 centrifuging 여 nuclease 솔루션을 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
7. 연골 입자에 10 mm Tris HCl 솔루션 deoxyribonuclease ribonuclease A 없이 30 mL를 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 입자를 resuspend 하 고 실 온에서 20 h에 대 한 롤러에 샘플을 둡니다.

5. 세제 Decellularization

1. Octoxynol-1 PBS에서 1% (v/v)을 용 해 하 여 세제 솔루션을 확인 합니다.
2. 3,113 x g 에서 20 분 동안 centrifuging와 삭제는 상쾌한 연골 입자에서 Tris HCl 솔루션을 제거 합니다.
3. 연골 입자에 준비 된 1% 세제 용액 30 mL를 추가 합니다. 솔루션의 거품을 피하기 위해 부드럽게 연골 입자 resuspend
   참고: 이 단계는 세포 막 분해.
4. 롤러는 롤러에 실 온에서 24 h에 대 한 샘플을 품 어.
5. 세제 솔루션 3,113 x g 에서 20 분 동안 원심 분리 하 여 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
6. Decellularization 솔루션의 나머지의 모든을 제거 하려면 솔루션을 세척 하는 연골의 30 mL에 8 h 6 사이클에서 연골 입자를 씻어. 실 온에서 롤러 세척을 수행 합니다.
   1. 다음 세척을 변경 하려면, 원심 3,113 x g에서 20 분 동안 정지 하 고 삭제는 상쾌한 신선한 연골 세척 솔루션 추가.
7. 마지막 세척 튜브에 두고-80 ° c.에 decellularized 연골 입자 저장

6. Decellularized 입자에서 건설 기계를 만들기

1. 입자-80 ° C에 저장 된, 하는 경우는 건설 기계를 만들기 전에 따뜻한 물에 연골 입자를 포함 하는 닫힌된 튜브를 녹여.
2. 원통형 금형, 예를 들어 8 m m의 직경 2 cm의 높이와 플라스틱 병에 작은 국자와 연골 입자를 전송 합니다.
3. 플라스틱 금형에 연골 입자를 배치할 때 모든 공기-거품 밖으로 비 계에 구멍을 피하기 위해 누르고 가장자리까지 금형을 채우기.
   참고: 그것은 발판에 있는 균열으로 이어질 수 있는 비 계 형성 후 건설 기계 금속 금형을 더 어려울 것 이다.
4. -20 ° c.에서 10 분 동안 연골 입자와 금형을 고정
5. 동결 건조 기에서 24 h에 대 한 그들의 금형 내 연골 건설 기계를 lyophilize.
6. 후 동결은, 금형 (그림 3) 비 계 하 고 자외선 (UV) 빛 30 cm 거리와 365와 함께 그들을 상호 링크 nm 하룻밤.
7. 생체 외에서 세포 배양 또는 vivo에서 주입은 건설 기계를 사용, 가스로, 예를 들면, 에틸렌 산화물 (토) 건설 기계를 소독.
   참고: EtO 살 균은 외부 자에 의해 수행 됩니다.

7. 조직학 Stainings와 Decellularized 장비의 특성

참고: 완전 한 decellularization를 보장 하 고 연골의 나머지 자연 문자 시각화 하 되며 고 오신 (H & E) 되도록 얼룩을 포함 하 여 어떤 실험에는 건설 기계를 사용 하기 전에 여러 조직학 stainings를 수행 decellularization, Safranin-O 잔여 개 그 존재를 시각화 하기 위해 얼룩, 교원 질 유형 I immunohistochemistry 콜라겐 콘텐츠 및 콜라겐 유형 II immunohistochemistry 콜라겐 콘텐츠를 구분 하는 것.

1. 메스와 함께 약 3 m m의 얇은 조각에는 건설 기계를 절단.
   참고: 경우는 건설 기계는 큰 또는 작은 크기에, 탈수 사이클의 기간 적응 시킬 필요가 있다.
2. 4% (w/v) alginate 방울에는 건설 기계를 포함 하 고 추가 비슷한 양의 3.7% 버퍼링 되지 않은 포 르 말린 20 m m CaCl₂를 포함 하 여 교차 연결 유도.
   참고: Alginate 포함 파라핀 포함 이전 세척 단계에 비해 더 엄격한 비 계 조각을 합니다. 경우는 건설 기계는 셀-시드 또는 vivo에서 이식, alginate 포함 필요 하지 않습니다는 장비의 구성 셀에 의해 ECM 설립으로 인해 충분히 방지 될 것 이다.
3. 등급된 에탄올 시리즈에 그들을 배치, 70%, 96%의 한 시간 주기 시작, 96%, 100%, 100% 에탄올, 크 실 렌의 2 개의 1 시간 주기 및 60 ° c.에 파라핀의 2 개의 1 시간 주기 끝나는 샘플을 탈수
4. 탈수, 후 형에서 샘플 파라핀 포함 하 고 샘플을 진정.
5. 5 μ m 두께의 조각에 톰으로 샘플을 잘라.
6. 얼룩이 지기 전에 반환 된 등급된 에탄올 시리즈에 그들을 배치 하 여 샘플을 rehydrate. 100%, 95%, 및 70% 에탄올 세척 당 3 분의 2 세척 뒤 5 분 동안 크 실 렌의 두 세척 시작. 마지막으로, 샘플 3 시간 2 분 동안 물에에서 씻는 다.
   참고: Alginate를 사용 하 여 샘플 파라핀 포함에 대 한 처리를 하는 경우 재 파라핀 섹션의 이전 10 m m 구 연산 산 alginate 씻어 있는지 확인 합니다.
7. 얼룩 hematoxylin와 오신, 샘플 Safranin O, 콜라겐, 그리고 콜라겐 II 이전 설명된¹¹.

8. 정량 분석 Decellularized 장비의 특성

1. 앞에서 설명한¹¹장비의 papain 다이제스트를 얻습니다.
2. 형광 기반 DNA 정량화 키트 완전 한 decellularization를 위해 장비의 이중 가닥 DNA 콘텐츠를 측정 하는 시험을 수행 합니다. 제조업체에서 제공 하는 프로토콜을 따릅니다. 발판의 건조 중량 당 DNA의 양을 표현 한다.
3. 앞에서 설명한¹¹비 계, 내 개 그의 나머지를 계량 블루 dimethylmethylene 분석 결과 수행 합니다. DNA 당 개 그에 금액을 표현.

9. Decellularized 장비의 시드

1. 3 m m로 6.7 단계에서 소독된 건설 기계 두꺼운 조각 잘라.
2. 6 잘 플레이트의 별도 우물에 건설 기계를 전송 합니다.
3. 발판 위에 매체의 pipetting 1 mL로 세포 배양 매체와 건설 기계를 rehydrate 하 고 30 분 동안 담가 보자 chondrocyte 또는 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 확장 매체를 사용 하 여.
   참고: 동일한 매체를 사용 하 여 시드할 수 세포의 세포 배양에 관해서는 비 계 재에 대 한. 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스와 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자-2 (FGF-2) Dulbecco의 수정된 미디어 (DMEM) Chondrocyte 확장 매체에 의하여 이루어져 있었다. MSC 확장 매체 구성 최소 필수 중간 알파 (-MEM) 10% 열 비활성화 FBS, 0.2 m m L-아 스 코르 빈 산 2 인산, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 그리고 10 ng/mL FGF-2.
4. 3 m m의 높이와 직경 8 mm 각 비 계에 대 한 필요한 볼륨은 매체의 100 μ에서 3 x 10⁶ 셀을 준비 합니다.
   참고: 다른 종에서 여러 세포 유형 시드에 사용할 수 있습니다. Chondrocytes 또는 중간 엽 기질 세포를 사용할 경우 앞에서 설명한¹¹로 셀을 분리. Chondrocytes, 사용 하는 경우는 그들이 하지 확장 되어 P1 통행 과거 dedifferentiated chondrocytes의 수를 최소화 하려면 있는지 확인 합니다. 중간 엽 기질 세포를 사용할 경우 앞에서 설명한¹⁴멀티 혈통 차별화에 대 한 그들의 능력에 테스트 되어야 한다.
5. 피펫으로 50 μ의 세포 현 탁 액 미리 젖된 비 계 위에 준비 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 비 계를 품 어
6. 조심 스럽게 아래로, 세포 현 탁 액의 피펫으로 나머지 50 μ 거꾸로 비 계 발판의이 측면에 바뀌고 1 h 37 ° c.에 품 어
7. 부 화, 후 웰 스, 매체의 3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 셀 시드 건설 기계 문화 셀의 분리를 피하기 위해 부드럽게 문화 접시를 처리 합니다.
8. 실험에 필요한 시간 동안에 건설 기계를 문화 고 2-3 회 매체를 변경 합니다. 피펫으로 천천히 그리고 최대한 발판에서 떨어져.
9. 셀 시드 발판의 경작, 후에 건설 기계를 반으로 잘라 고 조직학 및 생화학 분석에 대 한 그들을 처리 합니다.

결과

조직학 stainings를 사용 하 여 뿐만 아니라 DNA 잔재의 양을 측정 하 DNA 정량화를 사용 하 여 CDM 장비의 decellularization 항상 확인 되어야 한다. 부족 한 decellularization vivo에서 설정^15,,1617결과 영향을 주는 원치 않는 면역학 응답 발생할 수 있습니다. 이 특정 decellularization 메서드에 대 한 DNA 검출 범위 13.6 ± 2.3...

토론

관절 연골의 ECM은 매우 조밀 하 고 아주 다른 효소 치료에 탄력. 이 문서에서 설명 하는 여러 단계 decellularization 프로토콜 같은 저항을 해결 하 고 성공적으로 decellularized 행렬을 생성 합니다. 달성 하기 위하여는, 과정은 몇 일 동안 걸쳐. 다른 유형의 조직¹⁸, 많은 decellularization 프로세스를 제안 하 고이 문서 연골의 decellularization에 대 한 적합 한 프로토콜을 설명 합니다. 그러나이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cadaveric joint			This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Amphotericin B	Thermo Fischer Scientific	15290026
Liquid nitrogen
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513
Triton X-100 (octoxynol-1)	Sigma-Aldrich	X100
Papain	Sigma-Aldrich	P3125
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Alginate	Sigma-Aldrich	180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylene
Paraffin
Ethylene oxide sterilization	Synergy Health, Venlo, the Netherlands
Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors			MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.
MEM alpha	Thermo Fischer Scientific	22561
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
Heat inactivated bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	10735086001
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)	R & D Systems	233-FB
DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
Freeze-dryer	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Analytical mill	IKA	A 11 basic
mortar/pestle	Haldenwanger 55/0A
Roller plate	CAT	RM5
Centrifuge (for 50 mL tubes)	Eppendorf	5810R
Capsule (cylindric mold)	TAAB	8 mm flat
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
Incubator
Microtome
Sieve (mesh size 0.71 mm)	VWR	34111229
Scalpel
Scalpel holder
Small laddle