Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Resumen

Decellularized andamios derivados de cartílago pueden utilizarse como un andamio para reparación de cartílago de guía y como medio para regenerar tejido osteocondral. Este documento describe el proceso de descelularización en detalle y ofrece sugerencias para utilizar estos andamios en configuración in vitro.

Resumen

Los defectos osteocondrales carecen de suficiente capacidad de reparación intrínseca a regenerar el tejido óseo y cartílago funcionalmente sano. En este sentido, investigación de cartílago se ha centrado en el desarrollo de andamios regenerativos. Este artículo describe el desarrollo de andamios completamente derivadas de la matriz extracelular del cartílago natural, procedente de un donante de equino. Posibles aplicaciones de las matrices de soporte incluyen producción de aloinjertos para reparación de cartílago, que sirve como un andamio para tejido osteocondral ingeniería y proporcionando modelos in vitro para estudiar la formación del tejido. Por decellularizing el tejido, las células del donante se retiran, pero muchas de las señales naturales bioactivas se piensan para ser retenido. La principal ventaja de utilizar un andamio tan natural en comparación con un andamio sintético producido es que ninguna otra funcionalización de polímeros se requiere para regeneración de tejido osteocondral en coche. Los andamios derivados de cartílago matriz pueden utilizarse para la regeneración de tejido óseo y cartílago en entornos tanto in vivo como in vitro.

Introducción

Defectos del cartílago articular de la rodilla causada por eventos traumáticos pueden conducir a molestias y sobre todo pueden tener un gran impacto en la vida de la población joven y activa^1,2,3. Por otra parte, daño del cartílago en una edad joven puede llevar a un inicio más rápido de la osteoartritis más adelante en vida⁴. Actualmente, la única terapia de salvamento para la osteoartritis generalizada de la rodilla es la cirugía de reemplazo articular. Como el cartílago es un tejido avascular, hipocelulares y aneural, su capacidad de regeneración está severamente limitada. Por lo tanto, enfoques de la medicina regenerativa son buscados para ayudar y estimular la capacidad regenerativa del tejido nativo. Para ello, los andamios están diseñados y utilizados como un celular-portador o como un material inductivo que incita a la diferenciación y regeneración de los tejidos del cuerpo las células nativas⁵.

Decellularized andamios han sido estudiados ampliamente en la medicina regenerativa⁶. Ha tenido cierto éxito, por ejemplo, ayudar en la regeneración de la piel⁷, estructuras abdominales⁸y tendones⁹. La ventaja de utilizar andamios decellularized es su origen natural y su capacidad para retener señales bioactivos que tanto atraen e inducen la diferenciación celular en el linaje apropiado requerido para la reparación de tejido^6,10. Por otra parte, como matriz extracelular (ECM) es un biomaterial natural y descelularización previene una posible respuesta inmune mediante la eliminación de contenido celular o genético, se superan problemas con respecto a la biocompatibilidad y biodegradabilidad.

Derivados de cartílago matriz (MDL) andamios han demostrado gran condrogénica posibles en experimentos in vitro cuando sembrado con células estromales mesenquimales¹¹. Además, estos andamios han demostrado el potencial de tejido óseo de forma a través de la osificación endocondral en localizaciones ectópicas en configuración en vivo¹². Como MDL andamios guían la formación de ambos huesos y tejido cartilaginoso, estos andamios pueden tener potenciales para la reparación de defectos osteocondrales además de reparación de cartílago.

Este artículo describe un protocolo adaptado de Yang et al (2010)¹³ para la producción de andamios decellularized de CDM de equinos sofocar cartílago. Estos andamios son ricos en colágeno de tipo II y desprovisto de células y no contienen ningún glicosaminoglicanos (GAGs) después de descelularización. Experimentos in vitro e in vivo sobre la reparación del defecto condral (osteo) pueden realizarse con estos andamios.

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Protocolo

Este protocolo, se obtuvo cartílago equino Babilla de caballos que habían muerto de otras causas de artrosis. Tejido se obtuvo con el permiso de los propietarios, conforme a las normas éticas institucionales.

Nota: Este protocolo describe la fabricación de andamios de decellularized cartílago equino, que puede utilizarse para aplicaciones tales como plataformas de cultivo de tejidos in vitro o en vivo la implantación de estrategias de la medicina regenerativa. Los pasos de tratamiento enzimático deben realizarse en el orden cronológico descrito.

1. recolección de cartílago Articular de donante (cadavérico) juntas

1. Por delante de la etapa de cosecha, preparar 1 L de cartílago solución de lavado, que consiste en tampón fosfato salina (PBS), complementada con 100 U/mL penicilina estreptomicina 100 de μg/mL y 1% (v/v) anfotericina B.
2. Use guantes y una bata de laboratorio durante el proceso de cosechando, ya que el donante puede transportar patógenos.
3. Obtener una articulación (cadavérico) intacta para el aislamiento del cartílago.
   Nota: En este punto, la piel alrededor de la articulación está aún intacta. Cartílago de rodilla equino de caballo se utilizó en el presente Protocolo, pero también se pueden utilizar otras articulaciones de otras especies.
4. Retirar la piel que se encuentra en el área de interés mediante el uso de un bisturí y una pinza quirúrgica. Además, quitar el exceso de tejido muscular y grasa si es necesario, sin dañar la articulación subyacente. Opcionalmente, traslado al cadáver preparado a un gabinete de seguridad biológica.
5. Para realizar una artrotomía, es decir, una separación de la articulación, primero definir el lugar donde se articula la articulación al realizar extensión y flexión de la articulación.
6. Retire con cuidado las capas de grasa, músculos y tendones con un bisturí y pinzas quirúrgicas para abrir el área.
7. Hacer una incisión para llegar a la cavidad articular.
   Nota: Se llena la cavidad articular con líquido sinovial, el cual puede gotear de la cavidad cuando se realiza una incisión correcta.
8. Continuar abrir completamente la Junta cortando a través de los tendones que mantener la articulación unida.
9. Inspeccione el cartílago daños macroscópicos.
   Nota: Si el cartílago articular no tiene un aspecto brillante y liso o si presentan ampollas evidentes, hendiduras o defectos, deseche el cartílago.
10. Utilice un bisturí estéril para retirar el cartílago del hueso subcondral. Cortar hasta el hueso subcondral para quitar también la zona profunda del cartílago (figura 1). Para impedir que el cartílago se sequen, regularmente gotear solución de lavado en el cartílago cartílago.
    Nota: En este momento, no importa el tamaño de los trozos de cartílago.
11. Recoger las láminas de cartílago en tubos de 50 mL que contiene cartílago preparado previamente lavado solución (figura 2A).
12. Después de recoger el cartílago de todas las áreas de interés, snap congelar los trozos de cartílago en nitrógeno líquido durante 5 minutos.
13. Transferir los trozos de cartílago en tubos de 50 mL e inmediatamente liofilizar las rebanadas del cartílago durante 24 h en una secador de la helada. Ajuste de la congelación temperatura a aproximadamente 0.090 mbar mientras el condensador de hielo es-51 ° C (figura 2B).
14. Almacene las láminas de cartílago en un lugar seco a temperatura ambiente hasta su uso posterior.
    Nota: Hasta el punto de formación de andamio, las soluciones y el cartílago no debe ser preparado y tratado de una manera estéril.

2. creación de Decellularized las partículas de cartílago

1. Sumerja las rebanadas de cartílago liofilizado en nitrógeno líquido.
2. Directamente moler las muestras manualmente o por una fresadora. Cuando los trozos de cartílago a mano, utilizar un mortero y una Maja y moler las rodajas de aproximadamente 45 minutos hasta que estén pulverizadas (figura 2 y 2D). Cuando esmerile automáticamente, utilizar una fresadora a la velocidad preestablecida durante unos pocos segundos hasta un minuto, hasta que los trozos de cartílago congelado de snap se pulverizan.
   Nota: Pre-enfriar el mortero o el compartimiento de pulido de la máquina de molienda mediante la adición de nitrógeno líquido. Cuando se utiliza una máquina de la molinería, asegúrese de que todas las partículas son tierra, y que no hay partículas de alojarte en la parte inferior del compartimiento de pulido.
3. Las partículas de cartílago para deshacerse de las piezas más grandes utilizando un tamiz con una malla de 0.71 m m del tamiz.
4. Almacenar las partículas en un lugar seco a temperatura ambiente.

3. descelularización enzimática con tripsina 0.25%-EDTA

1. Preparar la solución de digestión, que consiste en 0.25% tripsina con EDTA suplementado con 100 U/mL penicilina estreptomicina 100 de μg/mL y 1% (v/v) anfotericina B. tienda la solución a 4 ° C.
   Nota: Trypin es una proteasa que degrada proteínas en el tejido de cartílago. Este paso enzimático se abrirá en la estructura de cartílago denso.
2. Llenar los tubos de 50 mL con las partículas de cartílago pulverizado hasta un volumen de aproximadamente 7,5 mL por tubo.
3. Incubar las partículas de cartílago con la solución de digestión preparado a 37 ° C durante 24 h en total, mientras que actualizar la solución de digestión cada 4 h.
   1. En primer lugar, Añadir 30 mL de la solución de digestión a cada tubo de 50 mL que contiene las partículas de cartílago.
   2. A continuación, vuelva a suspender las partículas mediante un vortex o pipeta para que todas las partículas están expuestas a la solución enzimática.
   3. Incubar las muestras durante 4 h a 37 ° C en un rodillo.
   4. Para actualizar la solución de digestión, centrifugar los tubos durante 20 min a 3113 x g para causar sedimentación de las partículas de cartílago. Deseche el sobrenadante.
      Nota: El sobrenadante se hará más claro con cada período de incubación de la tripsina.
   5. Repita paso 3.3.1–3.3.4 hasta que las partículas han sido incubadas con la solución de digestión de 6 ciclos de 4 h.
4. Después del ciclo final, retirar el sobrenadante después de centrifugar y lavar las partículas en 30 mL de solución de lavado dos veces al cartílago. De centrífuga las partículas por 20 min a 3113 x g entre cada uno de los lavados.

4. enzimática descelularización con nucleasa tratamiento

1. Preparar una solución de Tris-HCl a pH 7,5 en agua desionizada de 10 mM.
2. Añadir 50 desoxirribonucleasa U/mL y ribonucleasa U/mL 1 al tampón Tris-HCl, para obtener la solución de la nucleasa.
   Nota: Este paso se realiza para degradar específicamente deoxyribonucleases y ribonucleasas.
3. Para quitar el cartílago lavado solución de las partículas de cartílago (paso 3.4), centrifugar durante 20 minutos a 3.113 x gy eliminar el sobrenadante.
4. Añadir 30 mL de la solución de nucleasa a las partículas de cartílago y remover las partículas a través de la solución, asegurándose de que todas las partículas están expuestas a la solución de la nucleasa.
5. Incubar las muestras en un rodillo de 4 h a 37 ° C.
6. Retirar la solución de nucleasa por centrifugación las partículas del cartílago por 20 min a 3.113 x g y descartar el sobrenadante.
7. Lavar las muestras añadiendo 30 mL de 10 mM Tris-HCl solución sin la desoxirribonucleasa y la ribonucleasa A las partículas de cartílago. Resuspender las partículas y dejar las muestras en un rodillo de 20 h a temperatura ambiente.

5. detergente descelularización

1. Que la solución detergente disolviendo 1% (v/v) octoxinol-1 en PBS.
2. Retire la solución de Tris-HCl de las partículas de cartílago por centrifugación durante 20 min a 3.113 x g y descartar el sobrenadante.
3. Añadir 30 mL de la solución preparada de detergente de 1% a las partículas de cartílago. Resuspender las partículas de cartílago suavemente para evitar formación de espuma de la solución.
   Nota: Este paso se rompe las membranas celulares.
4. Incubar las muestras en un rodillo durante 24 h a temperatura ambiente en un rodillo.
5. Eliminar la solución detergente por centrifugación durante 20 min a 3.113 x g y descartar el sobrenadante.
6. Para quitar todos los restos de las soluciones de descelularización, lavar las partículas de cartílago en 6 ciclos de 8 h en 30 mL de solución de lavado de cartílago. Realizar el lavado en un rodillo a temperatura ambiente.
   1. Para cambiar al siguiente lavado, centrifugar la suspensión por 20 min a 3.113 x g, deseche el sobrenadante y añadir cartílago fresca solución de lavado.
7. Deje el último lavado en los tubos y almacenar las partículas de cartílago decellularized a-80 ° C.

6. creación de matrices de soporte de las partículas Decellularized

1. Si las partículas se han guardado a-80 ° C, descongelar los tubos cerrados que contienen las partículas de cartílago en agua tibia antes de crear las matrices de soporte.
2. Transferencia de las partículas de cartílago con un cucharón pequeño a un molde cilíndrico, por ejemplo, un frasco de plástico con un diámetro de 8 mm y una altura de 2 cm.
3. Al colocar las partículas de cartílago en el molde de plástico, presiona todas las burbujas de aire hacia fuera para evitar las caries en el andamio y llenar el molde hasta el borde.
   Nota: Será más difícil tomar los andamios de un molde de metal después de la formación del andamio, que puede conducir a fisuras en el andamio.
4. Congelar los moldes con las partículas de cartílago durante 10 min a-20 ° C.
5. Liofilizar los andamios de cartílago en sus moldes durante 24 h en una secador de la helada.
6. Después de la liofilización, el andamio de molde (figura 3) y reaccione con ultravioleta (UV) luz en distancia de 30 cm y 365 nm durante la noche.
7. Para poder utilizar las matrices de soporte para cultivo celular in vitro o in vivo implantación, esterilizar los andamios con, por ejemplo, gas de etileno (EtO) de óxido.
   Nota: Esterilización de EtO se realiza por la parte externa.

7. Caracterización de los andamios Decellularized con los Stainings histológicos

Nota: Para garantizar completa descelularización y visualizar el carácter natural restante del cartílago, realizar varios stainings histológicos antes de usar las matrices de soporte en cualquier experimento, incluyendo la hematoxilina y eosina (H & E) tinción para asegurar descelularización, Safranina O de tinción para visualizar la presencia residual de GAG, colágeno tipo I inmunohistoquímica para diferenciar entre contenido en colágeno y colágeno tipo II inmunohistoquímica para diferenciar entre el contenido de colágeno.

1. Corte los andamios en rebanadas de aproximadamente 3 mm con un bisturí.
   Nota: Si los andamios se cortan en tamaños más grandes o más pequeñas, las duraciones de los ciclos de deshidratación necesitan adaptarse.
2. Incrustar los andamios en una caída de 4% (p/v) de alginato e inducir reticulación mediante la adición de un volumen similar de 3,7% formol no tamponado que contiene 20 mM CaCl₂.
   Nota: Incrustación de alginato hace las rebanadas de andamio más rígida en comparación con los pasos de lavado antes de la inclusión en parafina. En caso de que los andamios han sido células semilla en vivo implantado, incrustación de alginato no es necesario, ya que la composición de los andamios serán suficientemente resistente debido a la incorporación de ECM por las células.
3. Deshidratan las muestras colocándolas en una serie gradual de etanol, a partir de ciclos de una hora de 70%, 96%, etanol 96% y 100% 100%, seguido de dos ciclos de 1 h de xileno y terminando con dos ciclos de 1 h de parafina a 60 ° C.
4. Después de la deshidratación, las muestras de parafina incrustar en un molde y enfriar las muestras.
5. Corte las muestras con un micrótomo en trozos de 5 μm de espesor.
6. Antes de la tinción, rehidratar las muestras colocándolas en una serie de etanol graduado devuelto. Comience con dos lavados de xileno durante 5 min, seguido de 2 lavados de etanol 100%, 95% y 70% por 3 min por lavado. Por último, lavar las muestras 3 veces en agua durante 2 minutos.
   Nota: En caso de utilizar alginato para procesar muestras para inclusión de parafina, asegúrese de lavar el alginato con 10 mM ácido cítrico antes de rehidratación de las secciones de parafina.
7. Teñir las muestras con hematoxilina y eosina, Safranina O, colágeno I y colágeno II como descrito anterior¹¹.

8. Caracterización de los andamios Decellularized con análisis cuantitativos

1. Obtener resúmenes de papaína de los andamios como se describió anteriormente¹¹.
2. Realizar un ensayo con un kit de cuantificación ADN basado en fluorescencia para medir el contenido de ADN de doble cadena de los andamios para descelularización completa. Seguir el protocolo proporcionado por el fabricante. Expresar la cantidad de ADN por peso seco del andamio.
3. Realizar un ensayo de dimethylmethylene azul para cuantificar el resto de las garantías en el andamio, como se describió anteriormente¹¹. Expresar la cantidad de GAG por ADN.

9. siembra de los andamios Decellularized

1. Corte esterilizados andamios de paso 6.7 mm 3 rodajas.
2. La transferencia de los andamios en pocillos distintos de una placa de 6 pozos.
3. Rehidratar los andamios con medio de cultivo celular por Pipetear 1 mL de medio en la parte superior del andamio y déjelo remojar durante 30 minutos utilizar condrocitos o medio de expansión de células madre mesenquimales (MSC).
   Nota: Utilice el mismo medio para la rehidratación de andamio en cuanto a cultura de célula de las células que serán sembradas. Medio de expansión de condrocitos consiste en medio modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 10 ng/mL del factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2). Medio de expansión de MSC consiste en mínimo esencial alfa media (un-MEM) con 10% FBS, 0,2 mM 2-fosfato ácido L-ascórbico, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 10 ng/mL FGF-2 inactivadas por calor.
4. Preparar 3 x 10⁶ células en 100 μL de medio, que es el volumen requerido para cada soporte con un diámetro de 8 mm y 3 mm de altura.
   Nota: Múltiples tipos de células de especies diferentes pueden utilizarse para la siembra. Cuando utilizando condrocitos o células estromales mesenquimales, aislar las células como se describió anteriormente¹¹. Cuando utilizando condrocitos, asegúrese de que no se han ampliado más allá del paso P1 para reducir al mínimo el número de condrocitos dedifferentiated. Cuando se utilizan células estromales mesenquimales, debe probarse en su capacidad de diferenciación multilineal, como se describió anteriormente¹⁴.
5. Extraiga con pipeta 50 μL de preparada la suspensión de células en la parte superior del andamio previamente remojo e incubar el andamio por 1 h a 37 ° C.
6. Cuidadosamente gire el andamio al revés abajo, pipetee los restantes 50 μL de la suspensión celular en este lado del andamio e incubar durante 1 h a 37 ° C.
7. Después de la incubación, añadir 3 mL de medio a los pozos y la cultura de los andamios de células sembradas a 37 ° C. Manejar la placa de cultivo con cuidado para evitar el desprendimiento de las células.
8. Las matrices de soporte de la cultura para el período de tiempo necesario para el experimento y cambiar el medio de 2 – 3 veces a la semana. Pipeta lentamente y hasta lejos del andamio como sea posible.
9. Después de cultivo del andamio celular-sembrado, corte los andamios por la mitad y proceso para análisis bioquímicos y la histología.

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Resultados

Descelularización de MDL andamios siempre debe ser confirmada usando los stainings histológicos, así como uso de cuantificación de ADN para medir la cantidad de restos de ADN. Descelularización insuficiente puede llevar a respuestas inmunológicas no deseadas que influyen en los resultados en entornos en vivo^15,16,17. Para este método específico descelularización, ADN fue por debajo del r...

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Discusión

El ECM del cartílago articular es muy densa y bastante resistente a diversos tratamientos enzimáticos. El protocolo de la descelularización de varios pasos descrito en este artículo aborda de esa resistencia y con éxito genera matrices decellularized. Para ello, el proceso se extiende durante varios días. Muchos procesos de descelularización han sido propuestos para los diferentes tipos de tejidos¹⁸, y este artículo describe un protocolo adecuado para la descelularización de cartílago. E...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cadaveric joint			This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center.
Sterile phosphate-buffered saline (PBS)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Amphotericin B	Thermo Fischer Scientific	15290026
Liquid nitrogen
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fischer Scientific	25200072
Tris-HCl pH 7.5
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Ribonuclease A from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	R6513
Triton X-100 (octoxynol-1)	Sigma-Aldrich	X100
Papain	Sigma-Aldrich	P3125
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Alginate	Sigma-Aldrich	180947
Formalin
CaCl2
Ethanol
Xylene
Paraffin
Ethylene oxide sterilization	Synergy Health, Venlo, the Netherlands
Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors			MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center.
MEM alpha	Thermo Fischer Scientific	22561
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma-Aldrich	A8960
DMEM	Thermo Fischer Scientific	41965
Heat inactivated bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	10735086001
Fibroblast growth factor-2 (FGF-2)	R & D Systems	233-FB
DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)	Thermo Fischer Scientific	P7581
1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt	Sigma-Aldrich	341088
Freeze-dryer	SALMENKIPP	ALPHA 1-2 LD plus
Analytical mill	IKA	A 11 basic
mortar/pestle	Haldenwanger 55/0A
Roller plate	CAT	RM5
Centrifuge (for 50 mL tubes)	Eppendorf	5810R
Capsule (cylindric mold)	TAAB	8 mm flat
Superlite S UV	Lumatec	2001AV
Incubator
Microtome
Sieve (mesh size 0.71 mm)	VWR	34111229
Scalpel
Scalpel holder
Small laddle