JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، علينا أن نظهر الأساليب في فيفو التقييم الكمي لخروج الكريات البيض من السذاجة، ملتهبة، والجلد مورين الخبيثة. نقوم بمقارنة وجها لوجه بين نموذجين: فوتوكونفيرسيون التطبيق و في الموقع فيتك عبر الجلد. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر الأداة المساعدة فوتوكونفيرسيون لتعقب خروج الكريات البيض من الأورام الجلدية.

Abstract

خروج الكريات البيض من الأنسجة المحيطة بالغدد الليمفاوية تجفيف ليس فقط الحرجة لمراقبة محصنة وبدء بل تسهم أيضا في القرار ردود الأنسجة المحيطية. بينما يتم استخدام مجموعة متنوعة من أساليب لقياس خروج الكريات البيض من الأنسجة غير اللمفاوية، والأجهزة الطرفية، والآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم خروج تعتمد على السياق تظل غير مفهومة. هنا، نحن تصف الاستخدام في الموقع فوتوكونفيرسيون للتحليل الكمي لخروج الكريات البيض من الجلد مورين والأورام. فوتوكونفيرسيون يسمح بمباشرة العلامات من الكريات البيضاء المقيمين داخل الأنسجة الجلدية. على الرغم من تعرض الجلد للضوء فوق البنفسجي يستحث المحلية التحريضية الردود تتسم تتسرب الكريات البيض ويجتازها الأوعية الدموية، في مقارنة وجها لوجه مع التطبيق عبر الجلد لتتبع الفلورسنت، فوتوكونفيرسيون على وجه التحديد تسمية الخلية الجذعية هجرة السكان، وفي نفس الوقت تمكين التحديد الكمي لخروج النقوي واللمفاوية من ميكرونفيرونمينتس الجلدية والأورام. آليات خروج الكريات البيض تظل عنصرا مفقوداً في فهمنا لتعقيد الكريات البيض إينتراتومورال، وهكذا تطبيق الأدوات المبينة في هذا التقرير سوف توفر فريدة من التبصر في ديناميات الورم ميكرونفيرونمينتس محصنة على حد سواء في استقرار الدولة واستجابة للعلاج.

Introduction

الاستجابات المناعية الأنسجة المحيطية تتشكل ليس فقط بتجنيد الكريات البيض إلى المواقع الالتهاب ولكن أيضا بالآليات التي تنظم الاحتفاظ بها بعد ذلك. وهكذا، تمليه الحصانة الواقية التراكمي الآليات الخلوية والجزيئية التي تحدد عما إذا كان يدخل الكريات البيض، يبقى داخل، أو بالأحرى يهاجر خارج الأنسجة الطرفية عبر الأوعية اللمفاوية. الأهم من ذلك، أن الميل للكريات البيضاء للخروج من الأنسجة عن طريق الأوعية اللمفاوية (يطلق عليها الخروج) مرتبط بوظائفها المتخصصة. الخلايا الجذعية (DC) اكتساب سلوك الهجرة استجابة لإشارات النضج مما يؤدي إلى نقل مستضد والعرض التقديمي في تجفيف الغدد الليمفاوية (دلن)، هي عملية ضرورية لمناعة التكيفية1. مسح الخلايا النقوي، مثل الضامة والعدلات، تعمل على إزالة الأنقاض apoptotic عن طريق البلعمه. خلال العدوى البكتيرية، العَدلات خروج الأنسجة والخضوع في نهاية المطاف للمبرمج في دلنس2 ونموذج لالتهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي، والبيانات تدعم الفرضية القائلة بأن خروج بلعم ضروري لحل التهاب المحلية3. ومع ذلك، ما إذا كان يحدث خروج العَدلات وبلعم في جميع السياقات التحريضية، غير معروف. أدلة اللمفاويات T الخروج من حالة ثابتة4،5،،من67و المصابين8ملتهبة4،،من910، 11،12 الأنسجة الطرفية غير اللمفاوية، ويشير إلى أن أوافيكم بنشاط خلايا تي، على الرغم من الإشارات المستندة إلى الأنسجة التي تدفع هذا الخروج ما زالت غير مفهومة. وقد حددت عدة دراسات خروج الإشارات الضرورية للهجرة الاتجاه نحو تجفيف الشعيرات اللمفاوية واللاحقة بما في ذلك يجند chemokine (عزر ج ج) 21 (CCL21) ولها مستقبلات، CCR7،من411 13, يجند chemokine (عزر ج-س-ج) 12 (CXCL12) ومستقبلات CXCR42،14، وسفينجوسيني-1-فوسفات (S1P)10،،من1516. بيد أن هذه الآليات ليست نشطة في جميع السياقات، وعما إذا كانت هي تحديد الخروج من جميع أنواع الخلايا تبقى مسألة مفتوحة. الأهم من ذلك، يتطلب أعمق للآليات التي تحكم متدفقة وأهميتها الوظيفية في المرض زيادة الكمية في فيفو أساليب التحليل.

وقد استخدمت عدة طرق التحديد الكمي للخروج في عدة نماذج حيوانية في الجسم الحي بما في ذلك كانوليشن مباشرة من الأوعية اللمفاوية، التبني نقل السابقين فيفو المسمى الكريات البيضاء، التطبيق عبر الجلد لتتبع الفلورسنت، حقن الجسيمات المسمى، و في فيفو فوتوكونفيرسيون17،18. كانولاتيون المباشر للأوعية اللمفاوية الماوس الزبائ صعبة ومحدودة في الحيوانات الصغيرة بكميات السوائل التي يمكن جمعها. وبالتالي، إلى حد كبير أداء كانوليشن في الحيوانات الكبيرة (على سبيل المثال.، الأغنام) التي تكون فيها مثل هذه المعالجات الجراحية العملية. وتوفر هذه الدراسات أدلة مباشرة لوجود خلايا اللمفاوية سواء النقوي في الليمفاوية10،،من1920. وعلاوة على ذلك، تكشف نماذج الأغنام أن الالتهاب الحاد والمزمن زاد وجود اللمفاويات في الليمفاوية 100-fold حوالي10،21.

التبني نقل الخلايا الليمفاوية المسماة ومحوره وراثيا كشفت الأهم من ذلك أن CCR7 مطلوب للخروج من خلايا CD4 خلايا+ ر من حدة التهاب الجلد5،11، أثناء المعالجة الأولية للخلايا اللمفية مع جزيء صغير S1P مستقبلات مؤثر، يمنع FTY720، إلا بصورة جزئية عن خروج10. من المثير للاهتمام، الخروج من الخلايا الليمفاوية المحولة من التهاب مزمن في الجلد مستقلة CCR710، لكن قد تتطلب جزئيا CXCR49. تجارب نقل التبني، ومع ذلك، توصيل أرقام غير الفسيولوجية السابقين فيفو لمفاوية المنشط والمسمى إلى الأنسجة عن طريق الحقن، مما يغير البيئة النشاط الحيوي للأنسجة والضغوط السائل الخلالي مرتفعة أن فتح الشعيرات اللمفاوية الأولية، وتغيير خصائص النقل على22. كبديل، تطبيق عبر الجلد من fluorescein isothiocyanate (فيتك) في وجود أو عدم وجود المهيجات الجلدية (مثلاً.، والفثالات الفثالات، دبة) أو العدوى23،24 يسمح بالتتبع خلايا متجولة التي تتراكم الراسم وتهاجر إلى دلنس. وبالمثل، المسمى فلوريسسينتلي الأورام توفر وسيلة لتتبع الخلايا البلعمية التي تجتاح الورم المواد25. ووفرت هذه الأساليب الهامة من التبصر في الآليات التي تحكم العاصمة خروج13،14،17،،من2627 ولكن غير قادر على تتبع غير متجولة الخلايا الليمفاوية، وتفسير يمكن تعقدت اللمفاوي خالية من فيتك القابلة للذوبان وبالتالي وضع العلامات غير المهاجرة، LN المقيم وحدات تحكم المجال Dc.

وبدلاً من ذلك، الفحص المجهري إينترافيتال هو أداة قوية تسمح بتتبع في فيفو السكان الكريات البيض فسيولوجيا ذات الصلة في الوقت الحقيقي28،29. المستخدمة في تركيبة مع مراسل الفئران والقائم على جسم في فيفو إيمونوفلوريسسينت العلامات، إينترافيتال مجهرية كشف المجمع المكاني والزماني ديناميات المناعي الخلية الاتجار بالأشخاص، بما في ذلك الهجرة فراغي30 ، التهجير عبر البطانة اللمفاوية، ومرور داخل التجويف اللمفاوية، والهجرة على LN دخول28،31. محدود بالمصروفات، الخبرة الفنية اللازمة لإعداد، اعتماد واسع النطاق لتقنيات التصوير إينترافيتال ومحدودة الإنتاجية للتحديد الكمي لأنواع متعددة من الخلايا. لا يزال، اقتران الأساليب الكمية أن تحليل الديناميات السكانية الأنسجة مع تصوير إينترافيتال سوف توفر البصيرة ميكانيكية إضافية وهامة فيما يخص آليات حركية والهجرة نحو وداخل الشعيرات الدموية اللمفية 18 , 31 , 32.

ونتيجة لذلك، في فيفو فوتوكونفيرسيون برز كوسيلة تسمح الموقع في وضع العلامات، مستقل لنشاط متجولة، والتحديد الكمي لخروج الكريات البيض الفسيولوجية (عندما يقترن بالتدفق الخلوي) في غياب أو وجود التحدي. مؤثرا عن الفئران كايد تيمبل بروتين المعزولة من المرجان ستوني أن يسلك الفلورية الخضراء (كايد الأخضر) حتى تتعرض للضوء فوق البنفسجي، بعدها أنه يحول لا رجعة فيه للأسفار أحمر (كايد أحمر)33. يمكن تعقب الخلايا فوتوكونفيرتيد كما أنها خروج من مواقع الأنسجة المحيطية، وتتراكم في دلنس. وكشفت هذه وأخرى مماثلة فوتوكونفيرتيبلي الماوس نماذج34،35 البيولوجيا الهامة بما في ذلك خروج المكونة من خلايا تي التنظيمية من الجلد36، تعتمد على CXCR4 خلية بالخروج من البقع في بييير37 , تعبئة خلايا الذاكرة المقيم T عند إعادة تحدي الببتيد38، وخروج الكريات البيض واسعة من ورم ميكرونفيرونمينتس39. هنا، نحن إجراء مقارنة وجها لوجه من فوتوكونفيرسيون مع التطبيق فيتك عبر الجلد في سياق الالتهابات الجلدية والعدوى تسمح بإجراء مقارنة مباشرة للبيانات الموجودة باستخدام أسلوب فوتوكونفيرتيبلي. وعلاوة على ذلك، نحن تثبت فوتوكونفيرسيون في أورام مزروع ووصف كفاءة التحويل وخروج انتقائية من ورم ميكرونفيرونمينتس. على هذا النحو، يمكننا القول بأن تطبيق هذه الأساليب المزيد من توضيح بيولوجيا حاسمة لخروج الكريات البيض من الأورام، والتي سيكون لها آثار كبيرة على تفسير intratumoral الكريات البيض التعقيد، الحصانة المضادة للورم، و واستجابة للعلاج.

Protocol

كافة البروتوكولات الحيوانية عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في ولاية أوريغون للصحة والعلوم بجامعة.

1-تنظيم دورات تعريفية لالتهاب وطلاء فيتك بينا الماوس

  1. في غطاء الاندفاق الصفحي، تخدير ماوس C57Bl/6 استخدام إيسوفلوراني المتبخرة (حمل في 3-5% إيسوفلوراني والحفاظ على إيسوفلوراني 1-3%؛ معدل تدفق الأكسجين في 0.5-1.0 لتر/دقيقة). ضمان أنيسثيتيزيشن السليم عن طريق رصد فقدان دواسة العاكسة، حركات لا إرادية، وانخفاض معدل التنفس.
  2. ويكمن إذن شقة مع الجانب البطني من الإذن التي تواجه صعودا. بيبيت 20 ميليلتر محلول فيتك 5% يذوب في الأسيتون 1:1: والفثالات الفثالات (دبة) إلى الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
  3. 24 ساعة بعد تطبيق فيتك، euthanize الفئران عن طريق التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون تليها التفكك عنق الرحم. جمع بن الإذن في برنامج تلفزيوني عن طريق يفصل بين الأذنين من الرأس باستخدام مقص. جمع دلنس عنق الرحم ولنس غير استنزاف الآربي في برنامج تلفزيوني استخدام الملقط لفصل في لنس من الأنسجة المحيطة. لنس الآربي غير استنزاف سيكون بمثابة عناصر سلبية لوجود فيتك++ /Kaede الحمراء الكريات البيضاء. التخلص من جثث كل بروتوكول المؤسسية.
    ملاحظة: فوتوكونفيرسيون وظيفة الوقت الأمثل لتحليل سيتوقف على نوع الخلية والسلوكيات الهجرة المعروفة. على سبيل المثال، يمكن اكتشاف الخلايا الجذعية، في دلنس في وقت مبكر كتطبيق افرجا بوست ح 6.

2-تنظيم دورات تعريفية لالتهاب وفوتوكونفيرسيون بينا الماوس

  1. في غطاء الاندفاق الصفحي، تخدير ماوس كايد تيمبل (خلفية C57Bl/6) عن طريق الحقن داخل من الكيتامين 80 ملغ/كغ و 10 مغ/كغ إكسيلازيني الذائبة في المياه المالحة. ضمان أنيسثيتيزيشن المناسب كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
  2. ويكمن إذن شقة مع الجانب البطني من الإذن التي تواجه صعودا. بيبيت 20 ميليلتر من 1:1 الأسيتون: دبة إلى الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
  3. وبعد تطبيق دبة، قطع فتحه في قطعة من رقائق الألومنيوم وسحب الإذن من خلال الشق لفضح الإذن لمصدر الضوء فوق البنفسجي. وضع الإذن مسطح مع الجانب الظهرية التي تواجه إلى الأعلى باستخدام الشريط على الوجهين للحصول على الإذن لإحباط.
  4. ضع الإذن مباشرة تحت مصدر الضوء، وفوتوكونفيرت لمدة 3 دقيقة باستخدام مصدر ضوء 405 نانومتر في 100 ميغاواط السلطة.
  5. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران كايد تيمبل وحصاد بن الإذن وعنق الرحم لنس لنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
    ملاحظة: بالإضافة إلى الاعتبارات المشار إليها في "الخطوة 1، 3"، أن معدلات الانتشار سيحدد توقيت التحليل كما سوف يحدث فقدان الأحمر كايد في سرعة تقسيم الخلايا.

3-اللقاحية العدوى بينا الماوس وتطبيق فيتك

  1. تخدير ماوس C57Bl/6 مع إيسوفلوراني يتبخر كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
  2. ويكمن الجانب البطني من الإذن شقة. بيبيت 5 × 106 تشكيل اللوحة (بفو) لوحدات اللقاحية الفيروسات (فاكف) مخفف في 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني على بينا الإذن. باستخدام إبرة قياس 29، كزة بينا مرات 2540.
  3. 24 ساعة بعد الإصابة، تخدير الفئران المصابة فاكف مع إيسوفلوراني كما هو موضح في "الخطوة 1-1" وبيبيت 20 ميليلتر 5% فيتك المذاب في الأسيتون على الجانب البطني من بينا الإذن. يسمح الإذن لتجف لبضع ثوان.
  4. 24 ساعة بعد تطبيق فيتك، euthanize الفئران وجمع بينناي الإذن، لنس عنق الرحم ولنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
    ملاحظة: يمكن تطبيق فيتك في أي وقت نقطة وظيفة العدوى لتحديد DC الاتجار في مختلف فترات ح 24. نحن ذكرت سابقا هو الحفاظ على DC الهجرة إلى دلنس على مستويات مماثلة من العدوى من الرتبة 1 إلى 3 يوم41.

4-اللقاحية العدوى بينا الماوس وفوتوكونفيرسيون.

  1. تخدير ماوس كايد تيمبل مع إيسوفلوراني يتبخر كما هو موضح في "الخطوة 1-1".
  2. تصيب بينا الإذن مع فاكف كما هو موضح في "الخطوة 3-2".
  3. تخدير الفئران المصابة فاكف كايد كما هو موضح في "الخطوة 2، 1" 24 ساعة بعد الإصابة، وتنفيذ فوتوكونفيرسيون كما هو موضح في الخطوات 2.3-2.4.
  4. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران وحصاد بن الإذن وعنق الرحم لنس لنس الاربية كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".
    ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه في "الخطوة 3، 4"، يمكن أن تدار فوتوكونفيرسيون في أي وقت نقطة بعد العدوى.

5-الإذن والعقدة الليمفاوية التجهيز للتدفق الخلوي

  1. إنشاء تعليق خلية مفردة من بن الإذن: قشر بعيداً على الجانبين البطني والظهريه من بينا الإذن باستخدام اثنين من أزواج من ملاقط ومكان مع الإذن أسفل إلى الآبار لصفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في الداخل مخزنة المالحة الحل (هبس في هانك) (التي تحتوي على Ca2 + و Mg2 +). احتضان في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 صحفي الأنسجة هضمها من خلال مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر.
  2. إنشاء تعليق خلية مفردة من لنس: ضع لنس في آبار صفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في حبس. فتح نفش العقدة الليمفاوية كبسولة استخدام اثنين 29-قياس الإبر، واحتضان الليمفاوية في 37 درجة مئوية ل 30 دقيقة ثم اضغط الأنسجة هضمها عبر مصفاة خلية نايلون 70 ميكرومتر.

6-زرع الورم سرطان الجلد الأدمة وفوتوكونفيرسيون.

  1. يحلق الفراء من وسط الجزء الخلفي من ماوس كايد تيمبل يستخدم حلاقة الكهربائية.
  2. ضع إبرة قياس 29 في وسط الظهر بين سكابولاي اليسرى واليمنى العليا، وإينتراديرمالي بحقن الخلايا السرطانية5 5 × 10 (مخففة في 50 ميليلتر من المحلول الملحي) جلد الفئران كايد تيمبل. يجب أن توضع الأورام بعناية لضمان التصريف اللمفاوي إلى العقد الليمفاوية المحددة (أي، اليسار واليمين عضدي لنس لاورام وضعت في منتصف الجزء الأعلى من الظهر). تجنب وضع الورم أعلاه دلن كما يمكن أن ينتج عن هذا فوتوكونفيرسيون مباشرة من لنس عن طريق الجلد/الورم.
  3. السماح للأورام تنمو إلى الحجم المطلوب (100-650 ملم3).
  4. يوم واحد قبل جمع الأنسجة، تخدير كايد تيمبل ماوس كما هو موضح في 2.1 ويحلق أي الفراء ريجروون حديثا حول الورم.
  5. قطع حفرة دائرية في رقائق الألومنيوم وسحب الورم عن طريق تعريض الورم إلى مصدر الضوء. قص الثقب أصغر قليلاً من الورم لمنع الورم من الوقوع مرة أخرى من خلال الثقب والتقليل من تحويل الجلد المجاور، غير الورم.
  6. تحديد موضع الورم مباشرة أسفل مصدر الضوء وفوتوكونفيرت لمدة 5 دقائق باستخدام مصدر ضوء 405 نانومتر في 200 ميغاواط السلطة.
  7. 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، euthanize الفئران كما هو موضح في "الخطوة 1، 3". جمع الأورام وعضدي دلنس الاربية لنس غير استنزاف في برنامج تلفزيوني. قطع الأورام بعيداً عن الجلد المحيطة باستخدام مقص وإزالة لنس كما هو موضح في "الخطوة 1، 3".

7-الورم والعقدة الليمفاوية التجهيز للتدفق الخلوي

  1. إنشاء تعليق خلية واحدة من الأورام: فرم الأورام مع مقص إلى الآبار لصفيحة 24-البئر الذي يحتوي على 1 ملغ/مل كولاجيناز د والدناز يو/مليلتر 80 المخفف في حبس. احتضان في 37 درجة مئوية حاء 1 الصحافة هضم الأنسجة من خلال مصفاة نايلون 70 ميكرومتر.
  2. إنشاء تعليق خلية واحدة فقط من العقد الليمفاوية كما هو موضح في "الخطوة 5-2".

8-جسم تلطيخ للتدفق الخلوي

  1. بعد هضم الأنسجة في تعليق خلية مفردة، تنفيذ معيار التدفق الخلوي تقنيات المصبوغة لتسمية الخلايا مع علامات الاهتمام. بإيجاز، بيبيت 2 × 106 خلايا في لوحة 96-جيدا. احتضان العينات مع كتلة Fc (1 ميكروغرام/مل) لمدة 20 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (ألبومين المصل البقري 1% من برنامج تلفزيوني). إضافة وصمة عار يعيش الميت (مخففة في برنامج تلفزيوني) للعينات واحتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) المخفف في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لمدة 30 دقيقة على الجليد؛ تغسل مرتين مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
    ملاحظة: كايدى الخضراء وكايدي ومضان أحمر يتداخل مع fluorophores فيتك والمؤسسة العامة؛ وهكذا، لا يمكن استخدام فيتك والأجسام المضادة مترافق PE في تركيبة مع البروتينات كايد.
  2. بعد تلطيخ، تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق. وبدلاً من ذلك، إصلاح الخلايا مع 2% منهاج عمل بيجين.

9. التدفق الخلوي التحليل

  1. تعيين فيتك (كايد الأخضر) وقناة PE (كايد الأحمر) الفولتية PMT إلى 70-80% من مجموع النطاق (مركز السكان في حوالي الساعة 104) استخدام السابقين فيفو الأخضر كايد أو كايد حمراء اللون المفرد سبلينوسيتيس أو الدم.
    ملاحظة: لا تعوض عن كايد الأخضر (فيتك) وقنوات كايد أحمر (PE) كهذا سيؤدي إلى إشارة أكبر انتشار.
    1. لإنشاء عناصر تحكم كايد أحادي اللون، جمع من الطحال أو الدم من ماوس كايد تيمبل. خلايا الدم الحمراء مع ACK المخزن المؤقت، ثم تقسيم الخلايا إلى مجموعتين: غير محولة كايد كايد الخضراء وتحويلها أحمر.
    2. للون واحد كايدى ضوابط حمراء، تعليق الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني وفوتوكونفيرت في صفيحة 24-جيدا لمدة 5 دقائق باستخدام مصادر ضوء 405 من شمال البحر الأبيض المتوسط في طه 100 ميغاواط. تستخدم هذه الخلايا لتعيين كايد الخضراء (فيتك) وكايد الفولتية PMT حمراء على تدفق سيتوميتير (9.1 الخطوة).
  2. بمجرد تم تعيين الفولتية للبروتينات كايد، التعويض عن سائر البقع الأولية جسم واحد-fluorophore المسمى الخرز تعويض كل إرشادات الشركة المصنعة باستخدام.
  3. تشغيل العينات على سيتوميتير تدفق لجمع البيانات.
    ملاحظة: ويجري إنتاج البروتين كايد باستمرار بالخلايا. وهذا يعني أن 24 ساعة بعد فوتوكونفيرسيون، سيتم تحويل الخلايا إيجابية مزدوجة كايد الخضراء وتراكمت البروتين كايد حمراء كالمركبة حديثا كايد (الأخضر) في الخلية.
  4. تحليل البيانات باستخدام برنامج فلووجو أو برامج مماثلة.

النتائج

أولاً سعينا إلى تكرار النتائج فوتوكونفيرسيون نشرت في الأدب لتقييم الكفاءة وتحديد التهاب المرتبطة بها في الجلد الماوس. تعرضت بينا الإذن إلى 100 ميغاواط البنفسجي الخفيف (405 نانومتر) لدقيقة 3 كما تم وصفه سابقا33. واحد تعليق خلية المتولدة من الجلد الإذن أو دلنس عنق ...

Discussion

على الرغم من أن خروج الكريات البيض من الأنسجة المحيطية، غير اللمفاوية أمر حاسم لبدء والقرار من الاستجابات المناعية، هي غير مفهومة الآليات الجزيئية التي تنظم متدفقة. هذه الفجوة في المعرفة إلى حد كبير بسبب توفر أدوات للقياس الكمي في فيفو. هنا، يمكننا وصف استخدام الفئران فوتوكونفيرتيب?...

Disclosures

الكتاب على لا تعارضات بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يشكر الدكتور ماركوس بوثينبيرج لتوفير YUMM 1.1 و YUMM 1.7 الميلانوما مورين خطوط والدكتورة ديبورا ج. فول لتوفير B6. Cg-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr الفئران باﻻتفاق مع BRC بتبريد عن طريق بيو الموارد الوطنية من يأمرون، اليابان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved