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Neste Artigo

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Resumo

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Resumo

Saída de leucócitos de tecidos periféricos para drenagem de linfonodos não é somente crítica para vigilância imune e iniciação mas também contribui para a resolução das respostas do tecido periférico. Embora uma variedade de métodos são usados para quantificar a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos, os mecanismos celulares e moleculares que governam o egresso de contexto-dependente permanecem mal compreendidos. Aqui, descrevemos o uso de photoconversion em situ para análise quantitativa de saída de leucócitos da pele murino e tumores. Photoconversion permite a rotulagem direta de leucócitos residente no tecido cutâneo. Embora a exposição da pele à luz ultravioleta induz local respostas inflamatórias caracterizam por infiltração de leucócitos e leakiness vascular, em uma comparação frente a frente com aplicação transdérmica dos marcadores fluorescentes, photoconversion especificamente rotulado de populações de células dendríticas migratórias e simultaneamente habilitado a quantificação de mieloide e linfoide egresso do microambiente cutâneo e tumores. Os mecanismos de saída de leucócitos mantêm um componente em falta em nossa compreensão da complexidade de leucócitos intratumoral, e, portanto, a aplicação das ferramentas descritas neste documento fornecerá uma visão única da dinâmica do tumor imune microambiente que ambos Só firme estadual e em resposta à terapia.

Introdução

Respostas imunes de tecido periférico são moldadas não apenas por recrutamento de leucócitos para os locais de inflamação, mas também por mecanismos que regulam sua retenção subsequente. Assim, a imunidade protetora é ditada pela cumulativos mecanismos celulares e moleculares que determinam se um leucócito entra, fica dentro, ou melhor migra do tecido periférico, através de vasos linfáticos. Importante, a propensão para leucócitos sair do tecido através de vasos linfáticos (denominado Egresso) está ligada às suas funções especializadas. Células dendríticas (DC) adquirem comportamento migratório, em resposta a sinais de maturação, levando a transporte do antígeno e apresentação na drenagem dos gânglios linfáticos (dLN), um processo que é necessário para a imunidade adaptativa1. Eliminação de células mieloides, tais como os macrófagos e os neutrófilos, servem para limpar escombros apoptotic através da fagocitose. Durante a infecção bacteriana, os neutrófilos saída de tecido e, finalmente, sofrem apoptose em dLNs2 e em um modelo da colite induzida por DSS, dados suporta a hipótese de que o egresso macrófago é necessário para resolver a inflamação local3. No entanto, se o egresso de neutrófilos e macrófagos ocorre em todos os contextos inflamatórios, é desconhecido. Provas para saída de linfócitos T de estado estacionário4,5,6,7, infectados8e inflamada4,9,10, 11,12 periféricos, não-linfoides tecidos indica que células T recircular ativamente, embora os sinais baseados em tecido que impulsionam esta saída permanecem mal compreendidos. Vários estudos têm identificado os sinais necessários para a migração direcional para drenagem linfáticos capilares e subsequentes saída incluindo chemokine (C-C motif) ligand 21 (CCL21) e seu receptor CCR74,11, 13, chemokine (C-X-C motif) ligand 12 (CXCL12) e seu receptor CXCR42,14e esfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Estes mecanismos não são ativos em todos os contextos, no entanto, e se eles determinam a saída de todos os tipos de célula permanece uma questão em aberto. Importante, ainda mais insight sobre os mecanismos que regem o egresso e sua relevância funcional na doença requer métodos quantitativos na vivo de análise.

Vários métodos têm sido utilizados para quantificar o egresso em vários modelos animais na vivo incluindo canulação direta dos vasos linfáticos, transferência adotiva de ex vivo rotulado leucócitos, aplicação de transdermal dos marcadores fluorescentes, injeção de partículas rotuladas e na vivo photoconversion17,18. Canulação direta dos vasos linfáticos aferentes do rato é difícil e limitado em pequenos animais pelos volumes de líquido que pode ser recolhido. Assim, canulação em grande parte foi realizada em animais de grandes porte (ex., ovelha) onde tais manipulações cirúrgicas são práticas. Estes estudos fornecem a evidência direta da presença de células linfoides e mieloides em linfa10,19,20. Além disso, modelos de ovinos revelam que inflamação aguda e crônica aumentou a presença de linfócitos na linfa por quase 100 vezes10,21.

Transferência adotiva de linfócitos etiquetados e manipulados geneticamente importante revelou que CCR7 é necessária para a saída dos CD4+ T células de5,da pele inflamada aguda11, enquanto o pré-tratamento dos linfócitos com a pequena molécula agonista do receptor de S1P, FTY720, apenas parcialmente inibe sua saída10. Curiosamente, a saída de linfócitos transferidos de pele cronicamente inflamada é independente CCR710, mas parcialmente pode exigir CXCR49. Experimentos de transferência adotiva, no entanto, entregam números não-fisiológicos da ex vivo ativados e rotulados de linfócitos no tecido através de injeção, que altera o ambiente biomecânico dos tecidos e pressões elevadas de fluido intersticiais que abrir os capilares linfáticos iniciais e alterar suas propriedades de transporte22. Como uma alternativa, aplicação de transdermal de isotiocianato de fluoresceína (FITC) na presença ou ausência de irritantes dérmicas (EG., Dibutilftalato, DBP) ou infecção23,24 permite o acompanhamento das células fagocíticas que acumulam tracer e migram para o dLNs. Da mesma forma, tumores fluorescente etiquetadas fornecem um meio para controlar as células fagocíticas que tem engolido o tumor material25. Esses métodos têm fornecido importantes insights sobre os mecanismos que regem a DC saída13,14,17,26,27 , mas são incapazes de controlar não-fagocíticas linfócitos e, a interpretação podem ser complicadas por drenagem linfática grátis de solúvel FITC rotulando assim não migratória, LN residentes DCs.

Alternativamente, a microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite o rastreamento no vivo das populações de leucócitos fisiologicamente relevantes em tempo real28,29. Usado em combinação com o repórter ratos e anticorpo-baseado na vivo imunofluorescência etiquetando, intravital microscopia revelou o complexo espacial e temporal dinâmica de imune celular de tráfico, incluindo a migração intersticial30 , transmigração através do endotélio linfático, passagem dentro do lúmen linfática e migração em cima LN entrada28,31. Ampla adoção de técnicas de imagem intravital é limitada pela despesa, conhecimentos necessários para configurar e limitado throughput para quantificação dos vários tipos de células. Ainda, métodos quantitativos que analisam a dinâmica populacional de acoplamento tecidos com intravital imagem irão fornecer uma visão mecanicista adicional e importante no que diz respeito as mecanismos de mobilidade e migração em direção e dentro de capilares linfáticos 18 , 31 , 32.

Por conseguinte, na vivo photoconversion emergiu como um método que permite em situ etiquetando, independente da atividade fagocítica e para a quantificação de saída de leucócitos fisiológica (quando acoplado com citometria de fluxo) na ausência ou presença de desafio. Ratos de Kaede-Tg constitutivamente expressam uma proteína isolada de corais stony que apresenta fluorescência verde (Kaede verde) até expostos à luz violeta, após o qual ele converte irreversivelmente a fluorescência vermelha (Kaede vermelho)33. Photoconverted células podem ser rastreadas como eles saída de sítios de tecidos periféricos e acumular-se no dLNs. Esta e outras semelhantes photoconvertible rato modelos34,35 revelaram importante biologia incluindo egresso constitutivo de pilhas de T reguladoras de pele36, egresso de células B CXCR4-dependente de Peyer37 , mobilização de células de memória residente T após peptídeo re-desafio38e saída de leucócitos amplo de tumor microambiente39. Neste documento, podemos realizar uma comparação frente a frente de photoconversion com aplicação de transdermal FITC no contexto da inflamação cutânea e infecção para permitir a comparação direta dos dados existentes com o método de photoconvertible. Além disso, demonstramos photoconversion em tumores implantados e descrever a eficiência de conversão e saída seletiva do microambiente do tumor. Como tal, podemos argumentar que é necessária mais aplicação destes métodos para elucidar a biologia crítica do egresso de leucócitos de tumores, que terá implicações significativas para interpretar a complexidade de leucócitos intratumoral, imunidade anti-tumoral, e resposta à terapia.

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Oregon Health & Science University e institucional Cuidado Animal.

1. indução da inflamação e FITC pintura de Mouse Pinna

  1. Em uma capa de fluxo laminar, anestesiar um rato C57Bl/6 utilizando isofluorano vaporizado (induzir no 3-5% isofluorano e manter-se em 1-3% isofluorano; taxa de fluxo de oxigênio em 0,5-1,0 L/min). Assegurar a adequada anesthetization monitorando a perda do reflexo de pedal, movimentos involuntários e taxa respiratória reduzida.
  2. Lançar uma orelha plana com o lado ventral do ouvido fique virado para cima. Pipetar 20 µ l de solução FITC 5% dissolvido em 1:1 acetona: Dibutilftalato (DBP) para o lado ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.
  3. 24 h após a aplicação de FITC, eutanásia os ratos através de exposição de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical. Colete o transformam de orelha em PBS separando as orelhas na cabeça com uma tesoura. Colete o dLNs cervical e inguinais não-drenando LNs em PBS, usando uma pinça para separar os serviços de imigração dos tecidos circundantes. Inguinais não-drenando LNs irão servir como controles negativos para a presença de leucócitos FITC+/Kaede vermelho+ . Descarte de carcaças de acordo com o protocolo institucional.
    Nota: O tempo ideal post photoconversion para análise dependerá do tipo de célula e comportamentos migratórios conhecidos. Células dendríticas, por exemplo, podem ser detectadas em dLNs tão cedo como aplicativo de DBP post 6 h.

2. indução de inflamação e Photoconversion de rato Pinna

  1. Em uma capa de fluxo laminar, anestesia um rato de Kaede-Tg (fundo C57Bl/6) pela injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de ketamina e xilazina 10 mg/kg, dissolvido em solução salina. Assegure a adequada anesthetization conforme descrito no passo 1.1.
  2. Lançar uma orelha plana com o lado ventral do ouvido fique virado para cima. Pipetar 20 µ l de um 1:1 acetona: DBP ao lado ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.
  3. Após a aplicação de DBP, cortar uma fenda em um pedaço de papel alumínio e puxar a orelha através da fenda para expor a orelha para a fonte de luz violeta. Deite a orelha com a dorsal virada para cima, usando fita adesiva para proteger a orelha para a folha.
  4. Posição da orelha diretamente sob a fonte de luz e photoconvert por 3 min usando uma fonte de luz de 405 nm em 100 mW de potência.
  5. 24 h após photoconversion, eutanásia em ratos a Kaede-Tg e colher o transformam de orelha, LNs cervicais e inguinais LNs, conforme descrito na etapa 1.3.
    Nota: Além de considerações citadas na etapa 1.3, as taxas de proliferação irão determinar o tempo de análise como a perda de Kaede vermelho ocorrerá em rapidamente dividir células.

3. vaccinia infecção do Mouse Pinna e aplicação FITC

  1. Anestesia um rato C57Bl/6 com isofluorano vaporizado, conforme descrito no passo 1.1.
  2. Coloque o lado ventral da orelha plana. Pipetar 5 x 106 deformação unidades (PFU) de vírus vaccinia (VacV) diluído em 10 µ l de PBS para o pavilhão da orelha. Usando uma agulha de calibre 29, cutucar o pavilhão auricular 25 vezes40.
  3. pós-infecção 24 h, anestesiamos ratos infectados VacV com isofluorano, conforme descrito no passo 1.1 e pipetar 20 µ l 5% FITC dissolvido em acetona na face ventral do pavilhão da orelha. Permita a orelha secar por alguns segundos.
  4. 24 h após a aplicação de FITC, eutanásia de ratos e recolher transformam a orelha, LNs cervicais e inguinais LNs conforme descrito na etapa 1.3.
    Nota: FITC pode ser aplicado em qualquer infecção de post do ponto de tempo para determinar DC tráfico em vários intervalos de 24h. Anteriormente, informou que a migração de DC para o dLNs é mantida a níveis semelhantes de dia 1 a 3 post infecção41.

4. vaccinia infecção do Mouse Pinna e Photoconversion.

  1. Anestesia um rato de Kaede-Tg com isofluorano vaporizado, conforme descrito no passo 1.1.
  2. Infectar o pavilhão auricular orelha com VacV conforme descrito no passo 3.2.
  3. pós-infecção 24 h, anestesiamos a ratos infectados VacV Kaede conforme descrito no passo 2.1 e executar photoconversion, conforme descrito nas etapas 2.3-2.4.
  4. 24 h após photoconversion, eutanásia de ratos e colher o transformam de orelha, LNs cervicais e inguinais LNs, conforme descrito na etapa 1.3.
    Nota: Como mencionado acima, no passo 3.4, photoconversion pode ser administrado em qualquer infecção de post do ponto de tempo.

5. ouvido e linfonodo processamento por citometria de fluxo

  1. Criar suspensões única célula de transformam ouvido: Descasque separados os lados ventrais e dorsais do pavilhão auricular orelha usando dois pares de pinças e lugar com o interior da orelha voltada para baixo, para os poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 DNase U/mL, diluído em Hank é Buffered Saline solução (HBSS) (que contém Ca2 + e Mg2 +). Incube a 37 ° C por 30 min. Pressione o tecido digerido através de um filtro de célula de nylon 70 µm.
  2. Criar suspensões celulares único de LNs: Coloque LNs em poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 U/mL DNase diluído em HBSS. Provocadora Abra o nó de linfa cápsula usando duas agulhas de calibre 29 e então incubar os linfonodos a 37 ° C por 30 min. Pressione o tecido digerido através de um filtro de célula de nylon 70 µm.

6. intradérmica Melanoma Tumor implantação e Photoconversion.

  1. Raspe o pelo do centro das costas de um rato de Kaede-Tg usando um barbeador elétrico.
  2. Posicione uma agulha de calibre 29 no centro das costas entre as escápulas esquerdas e superiores direito e por via intradérmica, injetar 5 x 105 pilhas do tumor (diluídas em 50 µ l de soro fisiológico) na pele de ratos Kaede-Tg. Tumores devem ser cuidadosamente posicionados para assegurar a drenagem linfática, para linfonodos especificados (ou seja, esquerda e direita braquial LNs para tumores colocados no meio da parte superior das costas). Evite colocar o tumor acima dLN, pois isso pode resultar em photoconversion direto dos LNs através do pele/tumor.
  3. Permitir que os tumores crescem para o tamanho desejado (100-650 mm3).
  4. Um dia antes da coleta do tecido, anestesiar um rato Kaede-Tg conforme descrito no ponto 2.1 e raspar qualquer recém regrown peles ao redor do tumor.
  5. Corte um buraco circular em papel de alumínio e puxe o tumor através de expor o tumor para a fonte de luz. Cortar o furo ligeiramente menor do que o tumor para impedir que o tumor volta a cair no buraco e minimizar a conversão da pele adjacente, não-tumoral.
  6. Posicione o tumor diretamente abaixo da fonte de luz e photoconvert por 5 min usando uma fonte de luz de 405 nm em 200 mW de potência.
  7. 24 h após photoconversion, eutanásia os ratos, conforme descrito na etapa 1.3. Colete os tumores, dLNs braquial e inguinais não-drenando LNs em PBS. Corte os tumores longe da pele circundante com uma tesoura e retire o LNs, conforme descrito na etapa 1.3.

7. o tumor e linfonodo processamento por citometria de fluxo

  1. Criar suspensões celulares único de tumores: picar os tumores com tesoura em poços de uma placa de 24 contendo 1 mg/mL colagenase D e 80 U/mL DNase diluído em HBSS. Incube a 37 ° C, durante 1 h. Pressione o tecido digerido através de um filtro de nylon 70 µm.
  2. Crie suspensão única célula dos gânglios linfáticos, conforme descrito no passo 5.2.

8. anticorpo que mancha para citometria de fluxo

  1. Após a digestão dos tecidos em suspensões celulares simples, execute técnicas de coloração padrão fluxo cytometry para rotular as células com marcadores de interesse. Brevemente, Pipetar 2 x 106 células em uma placa de 96 poços. Incubar as amostras com bloco de Fc (1 µ g/mL) por 20 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs (1% albumina de soro bovino em PBS). Adicionar ao vivo/morto mancha (diluída em PBS) para as amostras e incube por 15 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs. Incube com anticorpos primários (Tabela de materiais), diluídos em tampão de FACs por 30 min no gelo; Lave duas vezes com tampão de FACs.
    Nota: Kaede verde e Kaede se sobrepõe a fluorescência vermelha com fluorophores FITC e PE; assim, FITC e anticorpos conjugados a PE não podem ser usados em combinação com proteínas de Kaede.
  2. Depois da coloração, execute as amostras em um citômetro de fluxo. Alternativamente, consertar as células com 2% PFA.

9. fluxo Cytometry Analysis

  1. Definir o FITC (Kaede verde) e PE (Kaede vermelho) canal tensões de PGTO para 70-80% da amplitude total (centro de população em aproximadamente 104) usando ex vivo Kaede verde ou vermelho Kaede splenocytes de cor única ou sangue.
    Nota: Não compensa a Kaede verde (FITC) e canais de Kaede vermelho (PE) pois isso resultará em maior sinal espalhado.
    1. Para criar controles de Kaede da único-cor, colete um baço ou o sangue de um rato de Kaede-Tg. Lisar os glóbulos vermelhos com buffer ACK e, em seguida, dividir as células em dois grupos: unconverted Kaede verde e convertido Kaede vermelho.
    2. Para única cor Kaede controles vermelhos, suspender as células em 1 mL de PBS e photoconvert em uma placa de 24 por 5 min usando uma fontes de luz de 405 nm, com uma potência de 100 mW. Usar essas células para definir a Kaede verde (FITC) e Kaede tensões de PGTO vermelhas sobre o citômetro de fluxo (passo 9.1).
  2. Uma vez que as tensões para as proteínas de Kaede tiver sido definida, compensa todas as outras manchas de anticorpo primário usando single-fluoróforo rotulado contas de compensação, as instruções do fabricante.
  3. Execute as amostras em um citômetro de fluxo para coletar dados.
    Nota: A proteína de Kaede está continuamente sendo produzida pelas células. Isto significa que 24 h após photoconversion, células convertidas será positivo duplo para Kaede verde e proteína Kaede vermelho como Kaede recém sintetizado (verde) tem acumulado na célula.
  4. Analise os dados usando o software de FlowJo ou um software similar.

Resultados

Primeiro procuramos replicar photoconversion resultados publicados na literatura para avaliar a eficiência e determinar a inflamação associada na pele do rato. O pavilhão auricular orelha foi exposto a 100 mW violeta luz (405 nm) para 3 min como anteriormente descrito33. Único suspensões celulares geradas a partir de pele de orelha ou cervical dLNs imediatamente após a exposição revelaram uma eficiência de conversão de 78% de todos os CD45+ le...

Discussão

Embora a saída de leucócitos de tecidos não-linfoides, periféricos é fundamental para a iniciação e a resolução de respostas imunes, os mecanismos moleculares que governam o egresso são mal compreendidos. Esta lacuna no conhecimento é em grande parte devido à pronta disponibilidade de ferramentas para a quantificação em vivo. Aqui, descrevemos o uso de ratos de photoconvertible (Kaede-Tg) para quantificar a saída de leucócitos endógeno da pele e tumores e fornecer uma comparação direta de fren...

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer o Dr. Marcus Bosenberg para fornecer YUMM 1.1 e 1.7 YUMM linhas de melanoma murino e Dr. Deborah J. Fowell para fornecer B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr ratos de acordo com a RIKEN BRC através do Bio-recurso nacional do MEXT, Japão.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Referências

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