JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Özet

Periferik dokulara gelen lökosit çıkış drenaj lenf düğümleri için sadece immün gözetim ve başlatma için kritik değil ama ayrıca periferik doku yanıt olarak çözümlenmesini katkıda bulunur. Çeşitli yöntemler kullanılır lökosit çıkış lenfoid sigara, periferik dokulara üzerinden ölçmek için içerik bağımlı çıkış yöneten hücresel ve moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır kalır. Burada, biz Nicel analiz lökosit çıkış fare deri ve tümörleri, in situ photoconversion nasıl kullanılacağını açıklar. Photoconversion doğrudan lökosit kutanöz doku içinde ikamet etiketleme için sağlar. Cilt ışığa maruz kalma menekşe yerel indükler rağmen inflamatuar yanıt lökosit infiltratlar ve floresan izleyiciler, transdermal uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması vasküler leakiness photoconversion özellikle ile karakterize göçmen dendritik hücre popülasyonlarının etiketli ve kutanöz microenvironments ve tümör myeloid ve lenfoid çıkış miktar aynı anda etkin. Lökosit çıkış mekanizmaları anlayışımız intratumoral lökosit karmaşıklık içinde eksik bir bileşeni olarak kalır ve böylece uygulama burada açıklanan araçları bağışıklık microenvironments tümör dinamikleri benzersiz bir anlayış sağlayacak Devlet ve tedaviye yanıt yükseliyor.

Giriş

Periferik doku bağışıklık yanıtı sadece sitelerine lökosit alımı iltihap tarafından aynı zamanda onların sonraki bekletme düzenleyen mekanizmalar tarafından şekillenir. Böylece, koruyucu bağışıklık kalır içinde ister bir lökosit girer, ya da daha doğrusu geçirir lenf damarları ile periferik doku dışında belirlemek toplu hücresel ve moleküler mekanizmaları tarafından dikte edilir. Önemlisi, doku (çıkış olarak adlandırdığı) lenf damarları ile çıkmak lökosit için eğilimi onların özel işlevlere bağlıdır. Dendritik hücreler (DC) yanıt olarak olgunlaşma sinyalleri antijen taşıma ve edinilmiş bağışıklığın1için gerekli olan bir işlemi lenf düğümleri (dLN), drenaj içinde tanıtımı için önde gelen göçmen davranış elde etmek. Makrofajlar ve nötrofiller, gibi atma myeloid hücrelerin apoptotik enkaz fagositoz ile temizlemek için hizmet vermektedir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında nötrofil doku çıkış ve sonuçta apoptosis dLNs2 ve kolit DSS kaynaklı bir model geçmesi, veri makrofaj çıkış yerel iltihap3gidermek için gerekli olan hipotezi destekler. Olup tüm inflamatuar bağlamlarda, nötrofil ve makrofaj çıkış oluşur ancak bilinmemektedir. Kanıt için T lenfosit çıkış kararlı duruma4,5,6,7, virüslü8ve iltihaplı4,9,10, 11,12 periferik, Sigara-lenfoid doku gösterir T hücreleri aktif olarak recirculate, bu çıkış sürücü doku tabanlı sinyalleri kötü anlaşılır kalır rağmen. Çeşitli çalışmalarda belirledik sinyalleri lenfatik kapiller boşaltma doğru yönlü geçiş için gerekli ve sonraki çıkış kemokin (C-C motifi) ligand de dahil olmak üzere 21 (CCL21) ve onun reseptör CCR74,11, 13, kemokin (C-X-C motifi) ligand 12 (CXCL12) ve reseptör CXCR42,14ve sphingosine-1-fosfat (S1P)10,15,16. Bu mekanizmalar tüm bağlamlarda etkin değildir ve olup tüm hücre tiplerinin çıkış belirlemek bir açık soru kalır. Önemlisi, daha fazla çıkış ve fonksiyonel önemini hastalığında yöneten mekanizmaları içgörü nicel vivo içinde analiz yöntemleri gerektirir.

Doğrudan cannulation lenf damarlarının, lökosit, etiketli ex vivo transdermal uygulama floresan izleyiciler, evlat edinen transferi dahil olmak üzere birden fazla hayvan modelleri vivo içinde çıkış ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır, Enjeksiyon etiketli parçacıklar ve in vivo photoconversion17,18. Afferent fare lenf damarları doğrudan cannulation zor ve küçük hayvanlarda sıvı toplanabilir birimler tarafından sınırlı. Böylece, cannulation büyük ölçüde büyük hayvanlarda yapılmıştır (Örn., koyun) gibi cerrahi işlemler nerede pratik. Bu çalışmalar lenf10,19,20lenfoid ve myeloid hücrelerin varlığı için doğrudan kanıt sağlar. Ayrıca, ovine modelleri akut ve kronik inflamasyon lenf lenfosit varlığı neredeyse 100-fold10,21tarafından artış ortaya koyuyor.

Etiketli ve genetik olarak işlenmiş lenfositlerin evlat edinen transfer, CCR7 CD4 çıkış için gerekli olduğunu da önemlisi koymuştur+ T hücreleri Akut iltihaplı cilt5,11, lenfositler ön süre S1P reseptör agonist küçük molekül ile FTY720, yalnızca kısmen onların çıkış10engeller. İlginçtir, kronik iltihaplı deri üzerinden transfer edilen lenfositlerin çıkış CCR7 bağımsız10, ama kısmen CXCR49gerektirebilir. Evlat edinen transfer deneyler, ancak, aktif ve etiketli lenfositler doku doku ve yükseltilmiş interstisyel sıvı basıncı biyomekanik ortamı değiştirir enjeksiyon ile içine ex vivo fizyolojik olmayan sayıda teslim Bu ilk lenfatik kapiller açın ve onların taşıma özellikleri22alter. Floresein isothiocyanate (FITC) varlığı veya yokluğu dermal tahriş edici bir alternatif, transdermal uygulama olarak (Örn., Dibutil ftalat, DBP) veya enfeksiyon23,24 için izleme sağlar İzleyici biriken ve dLNs için göç fagositik hücreler. Benzer şekilde, fluorescently etiketli tümör tümör malzeme25yuttu fagositik hücreleri izlemek için bir yol sağlar. Bu yöntemler DC çıkış13,14,17,26,27 yöneten ancak olmayan fagositik takip edemiyoruz mekanizmalarının içine önemli fikir vermiş lenfositler ve yorumu çözünür FITC LN ikamet DCs böylece göçmen olmayan-etiketleme ücretsiz lenfatik drenaj tarafından karmaşık.

Alternatif olarak, intravital mikroskobu vivo içinde izleme gerçek zamanlı28,29fizyolojik ilgili lökosit nüfusun sağlayan güçlü bir araçtır. Mikroskopi kompleks kayma ortaya koymuştur ile birlikte muhabir fareler ve antikor tabanlı vivo içinde immünfloresan etiketleme, intravital kullanılan ve ticareti, dahil interstisyel geçiş30 bağışıklık zamansal dinamiği hücre , hicret arasında lenfatik endotel, geçit lenfatik lümen ve geçiş sonucunda LN giriş28,31içinde. İntravital görüntüleme teknikleri geniş kabulü gider, kurmak, için gerekli uzmanlık ile sınırlıdır ve birden çok hücre tipleri miktarının için çıkışını sınırlı. Yine de, nüfus dinamikleri analiz nicel metodlar kaplin intravital görüntüleme kurcalayarak geçiş doğru ve lenfatik kapiller içinde ve hareket mekanizmaları ile ilgili olarak ek ve önemli mekanik kavrama sağlayacak 18 , 31 , 32.

Sonuç olarak, in vivo photoconversion in situ etiketleme için izin veren bir yöntem olarak fagositik aktivite ve (akış sitometresi ile birleştiğinde) fizyolojik lökosit çıkış miktar için bağımsız ortaya çıkmıştır Devamsızlık veya meydan okuma varlığı. Kaede-Tg fareler yapısal mor ışık, sonra geri dönüşümsüz kırmızı floresans (Kaede kırmızı)33' e dönüştürür maruz kadar yeşil floresan (Kaede yeşil) sergiler taşlı mercan dan izole bir protein hızlı. Photoconverted hücrelerin periferik doku sitelerden çıkış olarak izleniyor ve dLNs içinde birikir. Bu ve diğer benzer photoconvertible fare modelleri34,35 önemli biyoloji bünye çıkış düzenleyici T hücreleri cilt36, CXCR4 bağımlı B hücre çıkış Peyer's yamalar37 üzerinden de dahil olmak üzere indirdik , peptid yeniden meydan38ve geniş lökosit çıkış tümör microenvironments39üzerine sakin bellek T hücrelerinin seferberlik. Burada, kutanöz inflamasyon ve enfeksiyon varolan verileri doğrudan karşılaştırma için photoconvertible yöntemi ile izin bağlamında photoconversion transdermal FITC uygulama ile kafa kafaya karşılaştırılması gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, implante tümörler photoconversion göstermek ve dönüşüm verimliliği ve tümör microenvironments üzerinden seçici çıkış açıklayın. Bu nedenle, biz daha fazla uygulama bu yöntemlerin lökosit çıkış intratumoral lökosit karmaşıklığı, anti-tümör dokunulmazlık, yorumlamak için önemli etkileri olacaktır tümörler üzerinden kritik biyoloji aydınlatmak için gerekli olduğunu iddia ve tedaviye yanıt.

Protokol

Tüm hayvan iletişim kuralları kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. indüksiyon iltihaplanma ve fare Pinna FITC resim

  1. Bir laminar akış başlık, buharlaşmış isofluorane kullanarak C57Bl/6 fare anestezi (% 3-5 isofluorane teşvik ve % 1-3 isofluorane at; korumak oksijen akış hızı 0.5-1.0'de L/dk). Pedal refleks kaybı izleyerek uygun anesthetization emin olmak istemsiz hareketler ve solunum indirimli.
  2. Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kulak ile düz bir kulak yatıyordu. Damlalıklı 20 µL % 5 FITC çözüm çözünmüş 1:1 aseton: Dibutil ftalat (DBP) kulak pinna ventral tarafına. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.
  3. 24 h FITC uygulama sonra ötenazi servikal çıkığı tarafından takip karbon dioksit pozlama ile fare. Kulak pinnae makas kullanarak başından kulakları ayırarak PBS toplamak. Servikal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs dokuları çevreleyen LNs ayırmak için cımbız kullanarak PBS içine toplamak. Kasık sigara boşaltma LNs FITC+/Kaede kırmızı+ lökosit varlığı için negatif denetimleri olarak görev yapacak. Kurumsal iletişim kuralı başına karkas atmayın.
    Not: Uygun zaman yazı photoconversion analiz için hücre tipi ve bilinen göçmen davranışları üzerinde bağlıdır. Dendritik hücreler, örneğin, dLNs gibi erken 6 h mesaj DBP uygulama olarak tespit edilebilir.

2. indüksiyon iltihaplanma ve fare Pinna Photoconversion

  1. Bir laminar akış başlık, Kaede-Tg fare (arka plan C57Bl/6) 80 mg/kg ketamin ve salin çözünmüş 10 mg/kg xylazine mayi enjeksiyonla anestezi. Uygun anesthetization adım 1. 1'açıklandığı gibi olun.
  2. Ventral tarafı yukarı bakacak şekilde kulak ile düz bir kulak yatıyordu. Damlalıklı 20 µL bir 1:1 aseton: DBP kulak pinna ventral tarafına. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.
  3. DBP uygulama sonra bir yarık bir parça alüminyum folyo kesim ve kulak mor ışık kaynağına maruz slit kulağından çek. Kulak düz dorsal yüzü yukarı folyo kulağa güvenliğini sağlamak için çift taraflı bant kullanarak bakacak şekilde yatıyordu.
  4. Işık kaynağı ve photoconvert altında doğrudan kulak 3 dk 100 mW gücünde bir 405 nm ışık kaynağı kullanarak yerleştirin.
  5. 24 h photoconversion sonra Kaede-Tg fareler ötenazi ve kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs adım 1. 3'açıklandığı gibi hasat.
    Not: Kaede kırmızı kaybı hızla hücre bölünmesi ortaya çıkar gibi ek konuları adım 1. 3'gösterdi, nükleer silahların yayılmasına karşı oranları analiz zamanlama belirler.

3. vaksinia enfeksiyon fare Pinna ve FITC uygulama

  1. C57Bl/6 fare buharlaşmış isofluorane ile adım 1. 1'açıklandığı gibi anestezi.
  2. Kulak ventral tarafında düz yatıyordu. Damlalıklı 5 x 106 plak oluşturan birim (PFU) PBS 10 µL üzerine kulak pinna içinde seyreltilmiş vaksinia virüs (VacV). 29-gauge iğne kullanarak, pinna 25 kez40poke.
  3. 24 saat sonrası enfeksiyon, adım 1.1 ve damlalıklı 20 µL FITC çözünmüş aseton kulak teleklerinin ventral yan üzerine içinde %5 açıklandığı gibi isofluorane ile VacV-enfekte fareler anestezi. Bir kaç saniyeliğine kurumaya kulak ver.
  4. 24 h FITC uygulama sonra fareyi ötenazi ve adım 1. 3'açıklandığı gibi kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs toplamak.
    Not: FITC DC çeşitli 24 h aralıklarla kaçakçılığı belirlemek için herhangi bir zaman noktası sonrası enfeksiyon, uygulanabilir. Biz daha önce dLNs DC göç gün 1-3 sonrası enfeksiyon41benzer düzeyde korunur bildirdi.

4. vaksinia enfeksiyonu fare Pinna ve Photoconversion.

  1. Kaede-Tg fareyle buharlaşmış isofluorane adım 1. 1'açıklandığı gibi anestezi.
  2. Kulak pinna VacV ile adım 3.2 açıklandığı gibi bulaştırmak.
  3. 24 saat sonrası enfeksiyon, adım 2.1 içinde açıklandığı gibi VacV enfekte Kaede fareler anestezi ve photoconversion 2.3-2.4 adımlarda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  4. 24 h photoconversion sonra fareyi ötenazi ve kulak pinnae, servikal Ins ve kasık LNs adım 1. 3'açıklandığı gibi hasat.
    Not: adım 3.4 yukarıda belirtildiği gibi herhangi bir zaman noktası sonrası enfeksiyon photoconversion yönetilebilir.

5. kulak ve lenf nodu akış sitometresi için işleme

  1. Kulak pinnae tek hücre süspansiyonlar oluşturun: 1 mg/mL collagenase D ve içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey plaka kuyu içine aşağı bakacak şekilde kulak içi ile iki çift cımbız ve yer kullanarak kulak teleklerinin tahliyeleri ve dorsal taraf ayrı soyma Hank tamponlu tuz çözüm ((Ca2 + ve Mg2 +içeren) HBSS). 30 dk. basın sindirilir doku 37 ° C'de 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.
  2. Tek hücre süspansiyonlar LNs oluşturun: LNs kuyu 1 mg/mL collagenase D ve HBSS içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey tabak yerleştirin. Lenf nodu iki 29-gauge iğne kullanarak kapsül ve 30 dk. 37 ° C'de lenf düğümleri kuluçkaya tease aç'a basın sindirilir doku 70 µm naylon hücre süzgeç aracılığıyla.

6. intradermal Melanom tümör implantasyon ve Photoconversion.

  1. Bir Kaede-Tg fare tıraş kullanılarak arka ortasından kürk tıraş.
  2. 29-gauge iğne sol ve sağ üst scapulae arasında arka ortasına yerleştirin ve intradermally (50 µL serum içinde seyreltilmiş) 5 x 105 tümör hücreleri Kaede-Tg fareler deri içine enjekte. Tümörler (LNs tümör üst sırt ortasında yeryani, sol ve sağ brakiyal) belirtilen lenf düğümlerine lenf drenaj sağlamak için dikkatli bir şekilde konumlandırılmalıdır. Bu LNs cilt/tümör aracılığıyla doğrudan photoconversion, neden olabilir gibi tümör dLN yukarıda yerleştirmekten kaçının.
  3. Tümörler istenen boyuta (100-650 mm3) büyümeye izin.
  4. 2.1 içinde açıklandığı gibi bir Kaede-Tg fare bir gün önce doku koleksiyonu, anestezi ve tümör çevresinde herhangi bir yeni regrown kürk tıraş.
  5. Alüminyum folyo bir dairesel delik ve tümör tümör ışık kaynağına maruz çek. Delik biraz tümör tümör geri delikten düşmesini önlemek için daha küçük ve bitişik, Sigara-tümörün cilt dönüşüm en aza indirmek.
  6. Tümör hemen altında ışık kaynağı ve photoconvert 5 dk 200 mW gücünde bir 405 nm ışık kaynağı kullanarak yerleştirin.
  7. 24 h photoconversion sonra adım 1. 3'açıklandığı gibi farelerin ötenazi. Tümörler, brakiyal dLNs ve kasık sigara boşaltma LNs PBS toplamak. Tümör çevresindeki deri makas kullanarak uzak kesmek ve INS adım 1. 3'konusunda açıklanan şekilde kaldırın.

7. tümör ve lenf nodu akış sitometresi için işleme

  1. Tek hücre kullanılamaz hale tümör oluşturun: tümör makasla 1 mg/mL collagenase D ve HBSS içinde seyreltilmiş 80 U/mL DNaz içeren bir 24-şey plaka kuyu içine kıyma. 1 h. basın sindirilir doku için 37 ° C'de 70 µm naylon süzgeç aracılığıyla kuluçkaya.
  2. Tek hücre süspansiyon lenf nodlarının adım 5,2 açıklandığı gibi oluşturun.

8. antikor akış sitometresi için boyama

  1. Dokular tek hücre süspansiyonlar sindirerek sonra standart akış sitometresi boyama teknikleri hücreleri faiz işaretleyicilerle etiketlemek için gerçekleştirin. Kısaca, damlalıklı 2 x 106 hücrelere bir 96-şey plaka. Buz üzerinde 20 dk için Fc bloğu (1 µg/mL) ile örnekleri kuluçkaya; FACs arabellek (%1 sığır serum albümin PBS içinde) iki kez yıkayın. Canlı/ölü leke (PBS içinde seyreltilmiş) örnekleri için ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde kuluçkaya; iki kez FACs arabellek ile yıkayın. Birincil antikorlar (Tablo reçetesi) FACs arabellek için buz üzerinde 30 dk içinde seyreltilmiş ile kuluçkaya; iki kez FACs arabellek ile yıkayın.
    Not: Kaede yeşil ve kırmızı floresans FITC ve PE fluorophores ile çakışıyor Kaede; Böylece, FITC ve PE-Birleşik antikorlar Kaede proteinler ile birlikte kullanılamaz.
  2. Boyama sonra örnekleri üzerinde bir akış sitometresi çalıştırın. Alternatif olarak, %2 ile hücreleri tamir PFA.

9. Akış Sitometresi Analizi

  1. FITC (Kaede yeşil) ve PE (Kaede kırmızı) Kanal toplam Aralık % 70-80 Devresel_ödeme gerilimleri ayarla (Merkezi nüfus yaklaşık 104) ex vivo Kaede yeşil veya kırmızı Kaede tek renkli splenocytes ya da kan kullanarak.
    Not: Bu büyük sinyal yaymak yol açar gibi Kaede yeşil (FITC) ve Kaede kırmızı (PE) kanalları için telafi etmek değil.
    1. Tek renkli Kaede denetimleri oluşturmak için bir Kaede-Tg fare--dan bir dalak veya kan toplama. Kırmızı kan hücreleri ile ACK arabellek parçalayıcı, sonra hücreleri iki gruba ayırın: Kaede yeşil ve dönüştürülmüş Kaede kırmızı din.
    2. Tek renk Kaede kırmızı denetimleri, askıya PBS 1 mL hücrelerde ve photoconvert 5 dk 100 gücünde bir 405 nm ışık kaynakları kullanarak bir 24-şey plaka mW. Bu hücreler Kaede yeşil (FITC) ve Kaede ayarlamak için kullanın kırmızı Devresel_ödeme gerilimleri akış sitometresi (adım 9.1) üzerinde.
  2. Kaede protein gerilimleri ayarladıktan sonra tek-fluorophore tazminat boncuk üretici yönergelerine başına etiketli kullanarak diğer tüm birincil antikor lekeler için telafi.
  3. Örnekleri verileri toplamak için bir akış sitometresi çalıştırın.
    Not: Kaede protein sürekli hücreleri tarafından üretilmektedir. Bu o 24 h anlamına gelir photoconversion sonra dönüştürülmüş hücrelerin Kaede yeşil için çift olumlu olacak ve Kaede yeni sentezlenmiş Kaede (yeşil) kırmızı protein hücre içinde birikmiş.
  4. FlowJo yazılım veya benzer bir yazılım kullanarak veri analiz.

Sonuçlar

Biz ilk etkinliğini değerlendirmek ve fare cilt ilişkili iltihap belirlemek için literatürde yayınlandı photoconversion sonuçları çoğaltmak aranan. Kulak pinna 100 mW menekşe ışığa maruz (405 nm) 3 dk. daha önce33açıklandığı gibi için. Tek poz takip tüm CD45 %78 dönüşüm verimliliğini ortaya hemen kulak cilt veya servikal dLNs oluşturulan hücre süspansiyonlar+ lökosit cilt dönüştürülmüş hiçbir hücre ile gözlenen ...

Tartışmalar

Lökosit çıkış periferik, Sigara-lenfoid doku üzerinden kritik başlatma ve bağışıklık yanıtı çözümlenmesi için olsa da, çıkış düzenleyen moleküler mekanizmalar kötü anlaşılır. Bilgi serisindeki bu boşluğun miktar içinde vivoiçin araçları hazır kullanılabilirliğini büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Burada, photoconvertible fareler (Kaede-Tg) endojen lökosit çıkış deri ve tümör ölçmek ve inflamatuar FITC boya ile doğrudan kafa kafaya karşılaştırma sağlamak i?...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çakışma var.

Teşekkürler

Yazarlar Dr. Marcus Bosenberg YUMM 1.1 ve YUMM 1.7 fare Melanom hatları ve Dr Deborah J. Fowell B6 sağlamak için sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr fareler RIKEN BRC aracılığıyla Ulusal biyo-kaynak olduğunu MEXT, Japonya ile anlaşma.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Referanslar

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  2. Hampton, H. R., Bailey, J., Tomura, M., Brink, R., Chtanova, T. Microbe-dependent lymphatic migration of neutrophils modulates lymphocyte proliferation in lymph nodes. Nature Communications. 6, 7139 (2015).
  3. D'Alessio, S., et al. VEGF-C-dependent stimulation of lymphatic function ameliorates experimental inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 124 (9), 3863-3878 (2014).
  4. Debes, G. F., et al. Chemokine receptor CCR7 required for T lymphocyte exit from peripheral tissues. Nature Immunology. 6 (9), 889-894 (2005).
  5. Bromley, S. K., Yan, S., Tomura, M., Kanagawa, O., Luster, A. D. Recirculating memory T cells are a unique subset of CD4+ T cells with a distinct phenotype and migratory pattern. Journal of Immunology. 190 (3), 970-976 (2013).
  6. Tomura, M., et al. Activated regulatory T cells are the major T cell type emigrating from the skin during a cutaneous immune response in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (3), 883-893 (2010).
  7. Tomura, M., Itoh, K., Kanagawa, O. Naive CD4+ T lymphocytes circulate through lymphoid organs to interact with endogenous antigens and upregulate their function. Journal of Immunology. 184 (9), 4646-4653 (2010).
  8. Jennrich, S., Lee, M. H., Lynn, R. C., Dewberry, K., Debes, G. F. Tissue exit: a novel control point in the accumulation of antigen-specific CD8 T cells in the influenza a virus-infected lung. Journal of Virology. 86 (7), 3436-3445 (2012).
  9. Geherin, S. A., Wilson, R. P., Jennrich, S., Debes, G. F. CXCR4 is dispensable for T cell egress from chronically inflamed skin via the afferent lymph. PLoS One. 9 (4), e95626 (2014).
  10. Brown, M. N., et al. Chemoattractant receptors and lymphocyte egress from extralymphoid tissue: changing requirements during the course of inflammation. Journal of Immunology. 185 (8), 4873-4882 (2010).
  11. Bromley, S. K., Thomas, S. Y., Luster, A. D. Chemokine receptor CCR7 guides T cell exit from peripheral tissues and entry into afferent lymphatics. Nature Immunology. 6 (9), 895-901 (2005).
  12. Gomez, D., Diehl, M. C., Crosby, E. J., Weinkopff, T., Debes, G. F. Effector T Cell Egress via Afferent Lymph Modulates Local Tissue Inflammation. Journal of Immunology. 195 (8), 3531-3536 (2015).
  13. Ohl, L., et al. CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity. 21 (2), 279-288 (2004).
  14. Kabashima, K., et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required for migration of cutaneous dendritic cells. American Journal of Pathology. 171 (4), 1249-1257 (2007).
  15. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Review of Immunology. 30, 69-94 (2012).
  16. Matloubian, M., et al. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature. 427 (6972), 355-360 (2004).
  17. Teijeira, A., Rouzaut, A., Melero, I. Initial afferent lymphatic vessels controlling outbound leukocyte traffic from skin to lymph nodes. Frontiers in Immunology. 4, 433 (2013).
  18. Hunter, M. C., Teijeira, A., Halin, C. T Cell Trafficking through Lymphatic Vessels. Frontiers in Immunology. 7, 613 (2016).
  19. Bujdoso, R., Hopkins, J., Dutia, B. M., Young, P., McConnell, I. Characterization of sheep afferent lymph dendritic cells and their role in antigen carriage. Journal of Experimental Medicine. 170 (4), 1285-1301 (1989).
  20. Young, A. J. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Seminars in Immunology. 11 (2), 73-83 (1999).
  21. Seabrook, T., et al. The traffic of resting lymphocytes through delayed hypersensitivity and chronic inflammatory lesions: a dynamic equilibrium. Seminars in Immunology. 11 (2), 115-123 (1999).
  22. Swartz, M. A., et al. Mechanics of interstitial-lymphatic fluid transport: theoretical foundation and experimental validation. Journal of Biomechanics. 32 (12), 1297-1307 (1999).
  23. Macatonia, S. E., Knight, S. C., Edwards, A. J., Griffiths, S., Fryer, P. Localization of antigen on lymph node dendritic cells after exposure to the contact sensitizer fluorescein isothiocyanate. Functional and morphological studies. Journal of Experimental Medicine. 166 (6), 1654-1667 (1987).
  24. Robbiani, D. F., et al. The leukotriene C(4) transporter MRP1 regulates CCL19 (MIP-3beta, ELC)-dependent mobilization of dendritic cells to lymph nodes. Cell. 103 (4), 757-768 (2000).
  25. Roberts, E. W., et al. Critical Role for CD103(+)/CD141(+) Dendritic Cells Bearing CCR7 for Tumor Antigen Trafficking and Priming of T Cell Immunity in Melanoma. Cancer Cell. 30 (2), 324-336 (2016).
  26. Forster, R., et al. CCR7 coordinates the primary immune response by establishing functional microenvironments in secondary lymphoid organs. Cell. 99 (1), 23-33 (1999).
  27. Johnson, L. A., Jackson, D. G. The chemokine CX3CL1 promotes trafficking of dendritic cells through inflamed lymphatics. Journal of Cell Science. 126, 5259-5270 (2013).
  28. Teijeira, A., et al. T Cell Migration from Inflamed Skin to Draining Lymph Nodes Requires Intralymphatic Crawling Supported by ICAM-1/LFA-1 Interactions. Cell Reports. 18 (4), 857-865 (2017).
  29. Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
  30. Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin alphaV. Nature Immunology. 14 (9), 949-958 (2013).
  31. Russo, E., et al. Intralymphatic CCL21 Promotes Tissue Egress of Dendritic Cells through Afferent Lymphatic Vessels. Cell Reports. 14 (7), 1723-1734 (2016).
  32. Steven, P., Bock, F., Huttmann, G., Cursiefen, C. Intravital two-photon microscopy of immune cell dynamics in corneal lymphatic vessels. PLoS One. 6 (10), e26253 (2011).
  33. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  34. Shand, F. H., et al. Tracking of intertissue migration reveals the origins of tumor-infiltrating monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (21), 7771-7776 (2014).
  35. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030 (2014).
  36. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. Journal of Experimental Medicine. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  37. Schmidt, T. H., Bannard, O., Gray, E. E., Cyster, J. G. CXCR4 promotes B cell egress from Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 210 (6), 1099-1107 (2013).
  38. Beura, L. K., et al. T Cells in Nonlymphoid Tissues Give Rise to Lymph-Node-Resident Memory T Cells. Immunity. 48 (2), 327-338 (2018).
  39. Torcellan, T., et al. In vivo photolabeling of tumor-infiltrating cells reveals highly regulated egress of T-cell subsets from tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (22), 5677-5682 (2017).
  40. Khan, T. N., Mooster, J. L., Kilgore, A. M., Osborn, J. F., Nolz, J. C. Local antigen in nonlymphoid tissue promotes resident memory CD8+ T cell formation during viral infection. Journal of Experimental Medicine. 213 (6), 951-966 (2016).
  41. Loo, C. P., et al. Lymphatic Vessels Balance Viral Dissemination and Immune Activation following Cutaneous Viral Infection. Cell Reports. 20 (13), 3176-3187 (2017).
  42. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  43. Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (18), 6696-6701 (2014).
  44. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  45. Demkowicz, W. E., Littaua, R. A., Wang, J., Ennis, F. A. Human cytotoxic T-cell memory: long-lived responses to vaccinia virus. Journal of Virology. 70 (4), 2627-2631 (1996).
  46. Stewart, A. J., Devlin, P. M. The history of the smallpox vaccine. Journal of Infection. 52 (5), 329-334 (2006).
  47. Hammarlund, E., et al. Duration of antiviral immunity after smallpox vaccination. Nature Medicine. 9 (9), 1131-1137 (2003).
  48. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  49. Tomura, M., Kabashima, K. Analysis of cell movement between skin and other anatomical sites in vivo using photoconvertible fluorescent protein "Kaede"-transgenic mice. Methods in Molecular Biology. , 279-286 (2013).
  50. Bellingan, G. J., Caldwell, H., Howie, S. E., Dransfield, I., Haslett, C. In vivo fate of the inflammatory macrophage during the resolution of inflammation: inflammatory macrophages do not die locally, but emigrate to the draining lymph nodes. Journal of Immunology. 157 (6), 2577-2585 (1996).
  51. Gautier, E. L., Ivanov, S., Lesnik, P., Randolph, G. J. Local apoptosis mediates clearance of macrophages from resolving inflammation in mice. Blood. 122 (15), 2714-2722 (2013).
  52. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106 (5), 1843-1850 (2005).
  53. Beauvillain, C., et al. CCR7 is involved in the migration of neutrophils to lymph nodes. Blood. 117 (4), 1196-1204 (2011).
  54. Rigby, D. A., Ferguson, D. J., Johnson, L. A., Jackson, D. G. Neutrophils rapidly transit inflamed lymphatic vessel endothelium via integrin-dependent proteolysis and lipoxin-induced junctional retraction. Journal of Leukocyte Biology. 98 (6), 897-912 (2015).
  55. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  56. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 143lenf damarlarkka ak l kKaedeFITC boyal kositmelanom

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır