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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.

Résumé

Sortie de leucocytes des tissus périphériques aux ganglions lymphatiques de drainage n’est pas seulement essentiel pour la surveillance du système immunitaire et initiation mais contribue aussi à la résolution des réactions des tissus périphériques. Bien qu’une variété de méthodes sont utilisées pour quantifier l’évacuation de leucocytes de tissus non lymphoïdes, périphériques, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent contextuel évacuation restent mal compris. Nous décrivons ici l’utilisation de photoconversion de in situ pour l’analyse quantitative d’évacuation de leucocytes de peau murine et tumeurs. Photoconversion permet l’étiquetage direct des leucocytes résidant dans les tissus cutanés. Bien que l’exposition de la peau aux ultraviolets provoque local réponses inflammatoires caractérisent par des infiltrats de leucocytes et de la perméabilité vasculaire, dans une comparaison entre application transdermique des traceurs fluorescents, photoconversion spécifiquement marqué les populations de migrateurs cellules dendritiques et activé simultanément la quantification d’évacuation myéloïde et lymphoïde de micro-environnements cutanées et tumeurs. Les mécanismes d’évacuation des leucocytes restent un élément manquant dans notre compréhension de la complexité des leucocytes intratumorale, et donc l’application des outils décrits dans les présentes fournira un aperçu unique de la dynamique de la tumeur des micro-environnements immunitaires à steady state et en réponse à la thérapie.

Introduction

Réponses immunitaires tissus périphériques sont formés non seulement par le recrutement des leucocytes aux sites d’inflammation, mais aussi par des mécanismes qui régulent leur maintien ultérieur. Ainsi, l’immunité protectrice est dictée par cumulatives mécanismes cellulaires et moléculaires qui déterminent si un leucocyte saisit, séjours au sein, ou plutôt migre dans les tissus périphériques via les vaisseaux lymphatiques. Ce qui est important, la propension des leucocytes à la sortie des tissus par les vaisseaux lymphatiques (appelés egress) est liée à leurs fonctions spécialisées. Les cellules dendritiques (DC) acquièrent un comportement migrateur en réponse aux signaux de maturation conduisant au transport de l’antigène et présentation à drainer des ganglions lymphatiques (RAD), un processus qui est nécessaire à l’immunité adaptative1. Nettoyage des cellules myéloïdes, telles que les macrophages et les neutrophiles, servent à dégager des débris d’apoptose par phagocytose. Au cours de l’infection bactérienne, neutrophiles évacuer les tissus et finalement apoptose dans dLNs2 et dans un modèle de colite induite par le DSS, données soutiennent l’hypothèse que l’évacuation des macrophages est nécessaire à la résolution de l’inflammation locale3. Évacuation des neutrophiles et les macrophages se soit produite dans tous les contextes inflammatoires, cependant, est inconnue. Éléments de preuve pour l’évacuation des lymphocytes T du regime4,5,6,7, infectés8et enflammée4,9,10, 11,12 des tissus périphériques, non lymphoïdes indique que les cellules T recirculer activement, même si les signaux sur tissus qui animent cette sortie restent mal compris. Plusieurs études ont identifié les signaux nécessaires à la migration directionnelle vers capillaires lymphatiques de drainage et ultérieures évacuation y compris ligand chemokine (C-C motif) 21 (CCL21) et son récepteur CCR74,11, 13, ligand chemokine (C-X-C motif) 12 (CXCL12) et son récepteur CXCR42,14et sphingosine-1-phosphate (S1P)10,15,16. Toutefois, ces mécanismes ne sont pas actifs dans tous les contextes, et qu’ils déterminent l’évacuation de tous les types de cellules reste une question ouverte. Ce qui est important, plus les mécanismes qui régissent l’évacuation et sa pertinence fonctionnelle dans la maladie exige que quantitative in vivo des méthodes d’analyse.

Plusieurs méthodes ont été utilisées pour quantifier l’évacuation dans plusieurs modèles animaux in vivo , y compris une canulation directe des vaisseaux lymphatiques, transfert adoptif ex vivo étiqueté leucocytes, application transdermique des traceurs fluorescents, injection de particules marquées et in vivo photoconversion17,,18. Canulation directe des vaisseaux lymphatiques afférents de la souris est difficile et limitée chez de petits animaux par les volumes de liquide pouvant être collectées. Ainsi, canulation a largement été effectuée chez les grands animaux (p. ex.., moutons) où de telles manipulations chirurgicales sont pratiques. Ces études fournissent des preuves directes de la présence de cellules lymphoïdes et myéloïdes dans la lymphe10,19,20. En outre, modèles ovins révèlent que l’inflammation aiguë et chronique ont augmenté de présence de lymphocytes dans les ganglions de presque 100 fois10,21.

Transfert adoptif des lymphocytes étiquetées et génétiquement manipulés a surtout révélé que CCR7 est nécessaire pour l’évacuation des CD4+ T les cellules de5,peau enflammée aiguë11, tandis que le prétraitement des lymphocytes avec la petite molécule agoniste des récepteurs S1P, FTY720, inhibe partiellement leur sortie10. Fait intéressant, l’évacuation des lymphocytes transférés de peau chroniquement enflammée est indépendant du CCR710, mais peut exiger partiellement CXCR49. Expériences de transfert adoptif, cependant, livrer des numéros non physiologiques de ex vivo lymphocytes activés et étiquetées dans les tissus par injection, ce qui altère l’environnement biomécanique des tissus et des pressions élevées de fluide interstitielles qui ouvre les capillaires lymphatiques initiaux et modifier leurs propriétés de transport22. Comme alternative, application transdermique d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) en présence ou en absence d’irritants par voie cutanée (e.g., phtalate de dibutyle, DBP) ou infection23,24 permet le suivi des cellules phagocytaires qui s’accumulent à traceurs et de migrent vers dLNs. De même, tumeurs fluorescent étiquetés fournissent un moyen pour assurer le suivi des cellules phagocytaires qui ont englouti la tumeur matière25. Ces méthodes ont donné un important aperçu les mécanismes qui régissent DC sortie13,14,17,26,27 , mais sont incapables de suivre non phagocytaires lymphocytes et, l’interprétation peuvent être compliquées par drainage lymphatique libre du FITC soluble donc étiquetage non migratrice, LN DCs résidents.

Par ailleurs, la microscopie intravitale est un outil puissant qui permet en vivo suivi des populations de leucocytes physiologiquement pertinentes en temps réel28,29. Utilisé en combinaison avec la souris journaliste et axée sur les anticorps in vivo par immunofluorescence labeling, intravitale microscopie a révélé le complexe spatial et la dynamique temporelle d’immunitaire cellulaire traite, y comprises les migrations interstitielle30 , transmigration à travers l’endothélium lymphatique, le passage dans le lumen lymphatique et la migration sur LN entrée28,31. L’adoption généralisée de techniques d’imagerie intravitale est limitée par la dépense, l’expertise nécessaire pour mettre en place et limité le débit pour quantifier plusieurs types de cellules. Encore, les méthodes quantitatives qui analysent la dynamique des populations de couplage tissus avec imagerie intravitale fournira insight mécanistique supplémentaire et important en ce qui concerne les mécanismes de la motilité et la migration vers et au sein de capillaires lymphatiques 18 , 31 , 32.

Par conséquent, en vivo photoconversion a émergé comme une méthode qui permet d’in situ étiquetage, indépendante de l’activité phagocytaire et la quantification d’évacuation leucocytaire physiologique (lorsqu’il est couplé avec la cytométrie en flux) dans le absence ou présence de défi. Les souris Kaede-Tg expriment constitutivement une protéine isolée de stony corail qui présente une fluorescence verte (Kaede vert) jusqu'à ce que l’exposé à la lumière violette, après quoi il convertit irréversiblement à fluorescence rouge (rouge de Kaede)33. Photoconverted cellules peuvent être suivis comme ils sortir de sites tissulaires périphériques et s’accumulent dans dLNs. Ceci et autres34,des modèles de souris similaires et35 ont révélé importante biologie, y compris la sortie constitutive des lymphocytes T régulateurs de peau36, évacuation des lymphocytes B CXCR4 dépendant de plaques de Peyer37 , la mobilisation des cellules de mémoire résidente T sur le peptide re-défier38et de sortir de leucocyte large du tumeur microenvironnements39. Dans les présentes, nous effectuons une comparaison entre photoconversion avec application FITC transdermique dans le contexte d’inflammation cutanée et d’infection afin de permettre une comparaison directe des données existantes avec la méthode et. En outre, nous montrent photoconversion dans les tumeurs implantés et décrire l’efficacité de conversion et évacuation sélective des micro-environnements tumeur. Par conséquent, nous croyons que davantage l’application de ces méthodes est nécessaires pour élucider la biologie critique d’évacuation de leucocytes de tumeurs, ce qui aura des implications importantes pour l’interprétation de complexité de leucocyte intratumorale, immunité anti-tumorale, et réponse au traitement.

Protocole

Tous les protocoles d’animaux ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Oregon Health & Science University et d’institutionnels animalier.

1. l’induction de l’Inflammation et de la peinture FITC de souris Pinna

  1. Dans une hotte à flux laminaire, anesthésier une souris C57Bl/6 en utilisant isofluorane vaporisé (induire à isofluorane de 3 à 5 % et de maintenir à 1-3 % isofluorane ; débit d’oxygène à 0,5-1,0 L/min). Assurer le bonne anesthetization en surveillant la perte du réflexe de pédale, mouvements involontaires et baisse du rythme respiratoire.
  2. Jeter une oreille plate avec la face ventrale de l’oreille vers le haut. Pipeter 20 µL de solution FITC 5 % dissous dans l’acétone de 1:1 : dibutyl phtalate (DBP) à la face ventrale du pavillon de l’oreille. Permettre à l’oreille à sécher pendant quelques secondes.
  3. 24h après l’application de la FITC, euthanasier les souris par l’intermédiaire de dioxyde de carbone exposition suivie de dislocation cervicale. Recueillir les pennes oreille dans PBS en séparant les oreilles de la tête à l’aide de ciseaux. Recueillir le dLNs cervicales et inguinales non drainant LNs dans PBS à l’aide de pinces pour séparer le LNs des tissus environnants. Inguinales non drainant LNs servira de témoins négatifs pour la présence de leucocytes /Kaede rouge+ +de FITC. Disposer des carcasses par le protocole de l’établissement.
    Remarque : La photoconversion de post temps optimal pour l’analyse dépendra du type de cellule et les comportements migratoires connus. Les cellules dendritiques, par exemple, peuvent être détectées dans dLNs plus tôt en tant qu’application de DBP post 6 h.

2. l’induction de l’Inflammation et Photoconversion de souris Pinna

  1. Dans une hotte à flux laminaire, anesthésier une souris Kaede-Tg (contexte C57Bl/6) par injection intrapéritonéale de kétamine 80 mg/kg et 10 mg/kg de xylazine dissous dans une solution saline. Assurer anesthetization adéquate tel que décrit au point 1.1 de l’étape.
  2. Jeter une oreille plate avec la face ventrale de l’oreille vers le haut. Pipeter 20 µL d’une DBP : acétone de 1:1 du côté ventral de la pavillon de l’oreille. Permettre à l’oreille à sécher pendant quelques secondes.
  3. Après application de DBP, couper une fente dans un morceau de papier d’aluminium et tirer l’oreille par le biais de la fente pour exposer l’oreille à la source de lumière violette. Plat l’oreille avec la face dorsale, face vers le haut à l’aide de ruban adhésif double-face pour garantir l’oreille sur la feuille.
  4. Positionner l’oreille directement sous la source lumineuse et photoconvert pendant 3 min à l’aide d’une source lumineuse de 405 nm à puissance de 100 mW.
  5. 24h après photoconversion, euthanasier les souris Kaede-Tg et récolter les pennes de l’oreille et LNs cervicales inguinales LNs comme décrit dans l’étape 1.3.
    Remarque : En plus des considérations citées au point 1.3 de l’étape, le taux de prolifération déterminera le moment de l’analyse que cette perte de Kaede rouge se produit dans les cellules à division rapide.

3. vaccine Infection des souris Pinna et FITC Application

  1. Anesthésier une souris C57Bl/6 avec isofluorane vaporisé comme décrit au point 1.1 de l’étape.
  2. Posez la face ventrale de l’oreille plate. Déposer 5 x 106 formant unités (PFU) du virus de la vaccine (VacV) diluée dans 10 µL de PBS sur le pavillon de l’oreille. À l’aide d’une aiguille de calibre 29, piquez le pavillon 25 fois40.
  3. infection après 24h, anesthésier les souris infectées par VacV avec isofluorane comme décrit dans l’étape 1.1 et pipeter 20 µL 5 % FITC dissous dans l’acétone sur la face ventrale de la pavillon de l’oreille. Permettre à l’oreille à sécher pendant quelques secondes.
  4. 24h après l’application de la FITC, euthanasier les souris et recueillir les pennes de l’oreille, LNs cervicales et inguinales LNs comme décrit dans l’étape 1.3.
    Remarque : FITC peut être appliqué à n’importe quel moment point après l’infection pour déterminer DC traite à divers intervalles de 24 h. Nous avons déjà indiqué que les migrations DC à dLNs sont maintenue à des niveaux similaires de jour 1 à 3 post infection41.

4. vaccine Infection des souris Pinna et Photoconversion.

  1. Anesthésier une souris Kaede-Tg avec isofluorane vaporisé comme décrit au point 1.1 de l’étape.
  2. Infecter le pavillon de l’oreille avec VacV comme décrit dans l’étape 3.2.
  3. infection après 24h, anesthésier les souris infectées par le VacV Kaede comme décrit au point 2.1 et effectuer photoconversion comme décrit aux points 2.3-2.4.
  4. 24h après photoconversion, euthanasier les souris et récolter les pennes de l’oreille et LNs cervicales inguinales LNs comme décrit dans l’étape 1.3.
    Remarque : Comme indiqué ci-dessus dans l’étape 3.4, photoconversion peut être administrée à n’importe quel point après infection de temps.

5. oreille et ganglion de traitement pour la cytométrie en flux

  1. Créer des suspensions de cellules simples de pennes oreille : peler dehors les côtés ventrales et dorsales de la penne d’oreille à l’aide de deux paires de pinces à épiler et place à l’intérieur de l’oreille vers le bas dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mg/mL collagénase D et 80 DNase U/mL dilué dans Hank Buffered Saline Solution (HBSS) (contenant Ca2 + et Mg2 +). Incuber à 37 ° C pendant 30 min. presse les tissus digérés à travers un tamis de cellule de nylon de 70 µm.
  2. Créer des suspensions cellulaires unique de LNs : placer le LNs dans le puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mg/mL collagénase D et 80 DNase U/mL dilué dans HBSS. Taquiner open du ganglion lymphatique capsule à l’aide de deux aiguilles de calibre 29 et puis incuber les ganglions lymphatiques à 37 ° C pendant 30 min. presse les tissus digérés à travers un tamis de cellule de nylon de 70 µm.

6. intradermique mélanome tumeur Implantation et Photoconversion.

  1. Raser la fourrure depuis le centre du dos d’une souris de Kaede-Tg à l’aide d’un rasoir électrique.
  2. Placer une aiguille de calibre 29 au centre du dos entre les omoplates gauche et supérieurs droit et injecter par voie intradermique 5 x 105 cellules tumorales (diluées dans 50 µL de solution saline) dans la peau de souris Kaede-Tg. Les tumeurs doivent être positionnés avec soin pour assurer un drainage lymphatique aux ganglions spécifiés (c.-à-d., gauche et droite brachiale LNs pour les tumeurs placés au milieu de la partie supérieure du dos). Évitez de placer la tumeur au-dessus de rad, car cela peut entraîner photoconversion directe de la LNs par le biais de la tumeur de la peau /.
  3. Laissez les tumeurs atteigne la taille désirée (100-650 mm3).
  4. Un jour ayant précédé le prélèvement de tissus, anesthésier une souris Kaede-Tg comme décrit en 2.1 et raser tout nouvellement repousse fourrure autour de la tumeur.
  5. Découper un trou circulaire dans le papier d’aluminium et tirez la tumeur par exposer la tumeur à la source de lumière. Découper le trou légèrement plus petit que la tumeur afin d’empêcher la tumeur de retomber dans le trou et minimiser la conversion de la peau adjacente, non-tumeur.
  6. Position de la tumeur directement sous la source lumineuse et photoconvert pendant 5 min à l’aide d’une source lumineuse de 405 nm à la puissance 200 mW.
  7. 24h après photoconversion, euthanasier les souris comme décrit dans l’étape 1.3. Recueillir les tumeurs, dLNs brachiale et inguinales non drainant LNs dans PBS. Coupez les tumeurs de la peau environnante, à l’aide de ciseaux et enlevez LNs comme décrit dans l’étape 1.3.

7. tumeur et ganglion de traitement pour la cytométrie en flux

  1. Créer des suspensions de cellules du même les tumeurs : Émincer les tumeurs avec des ciseaux dans des puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mg/mL collagénase D et 80 DNase U/mL dilué dans HBSS. Incuber à 37 ° C pendant 1 h. presse les tissus digérés à travers un tamis en nylon de 70 µm.
  2. Créer la suspension monocellulaire de ganglions lymphatiques comme décrit au point 5.2.

8. les anticorps coloration pour la cytométrie en flux

  1. Après digestion des tissus dans des suspensions de cellules du même, effectuer des techniques de coloration de cytométrie en flux standard pour étiqueter les cellules avec des marqueurs d’intérêt. En bref, déposer 2 x 106 cellules dans une plaque de 96 puits. Incuber les échantillons avec bloc Fc (1 µg/mL) pendant 20 min sur glace ; laver deux fois avec le tampon de FACs (albumine sérique bovine en 1 % dans du PBS). Ajouter live/dé tache (dilué dans du PBS) dans les échantillons et incuber pendant 15 minutes sur la glace ; laver deux fois avec le tampon de FACs. Incuber les anticorps primaire (Table des matières), dilué dans un tampon FACs pendant 30 min sur glace ; laver deux fois avec le tampon de FACs.
    Remarque : Kaede vert et Kaede fluorescence rouge chevauche avec des fluorophores FITC et PE ; FITC et anticorps conjugués PE ne peuvent donc, être utilisés en combinaison avec les protéines de Kaede.
  2. Après coloration, exécuter les exemples sur un cytomètre en flux. Vous pouvez également fixer les cellules avec 2 % PFA.

9. analyse en cytométrie en flux

  1. Régler le FITC (Kaede vert) et le canal de PE (Kaede rouge) tensions PMT à 70-80 % de la plage totale (centre de population à environ 104) utilisation ex vivo Kaede vert ou Kaede rouge monochrome splénocytes ou sang.
    Remarque : Ne compensent pas les vert Kaede (FITC) et les canaux de Kaede rouge (PE) car cela se traduira par le grand signal de se propager.
    1. Pour créer des contrôles de Kaede monochrome, recueillir une rate ou le sang d’une souris de Kaede-Tg. Lyse des globules rouges avec le tampon de l’accusé de réception, puis diviser les cellules en deux groupes : non convertis Kaede vert et convertir Kaede rouge.
    2. Pour unicolores Kaede contrôles rouges, suspendre les cellules dans 1 mL de PBS et photoconvert dans une plaque 24 puits pendant 5 min en utilisant des sources lumineuses une 405 nm à une puissance de 100 mW. Ces cellules permet de définir la Kaede vert (FITC) et Kaede rouges tensions PMT sur le cytomètre (étape 9.1).
  2. Après avoir réglé les tensions pour les protéines de Kaede, compenser pour toutes les autres anticorps primaire les taches à l’aide de simple-fluorophore étiqueté perles de compensation selon les instructions du fabricant.
  3. Exécuter les exemples sur un cytomètre en flux pour collecter les données.
    Remarque : La protéine de Kaede est continuellement produite par les cellules. Cela signifie que 24 h après photoconversion, cellules convertis sera double positif pour Kaede vert et protéine de Kaede rouge comme nouvellement synthétisée Kaede (vert) se sont accumulés dans la cellule.
  4. Analyser les données à l’aide du logiciel FlowJo ou un logiciel similaire.

Résultats

Tout d’abord, nous avons cherché à reproduire photoconversion résultats publiés dans la littérature pour évaluer l’efficacité et de déterminer l’inflammation associée à la peau de souris. Le pavillon de l’oreille a été exposé à la lumière de mW violet 100 (405 nm) pour 3 min comme décrit plus haut33. Single des suspensions de cellules produites de la peau de l’oreille ou les cervicales dLNs immédiatement après l’exposition révèle une...

Discussion

Bien que l’évacuation de leucocytes de tissus non lymphoïdes périphériques est essentielle pour l’initiation et la résolution des réponses immunitaires, les mécanismes moléculaires qui régissent l’évacuation sont mal compris. Cette lacune dans les connaissances est en grande partie en raison de la disponibilité d’outils permettant la quantification in vivo. Nous décrivons ici l’utilisation de la souris et à quantifier l’évacuation de leucocyte endogène de la peau et des tumeurs et de f...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit de divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Marcus Bosenberg qui YUMM 1.1 et lignes de mélanomes murins YUMM 1.7 et Dr. Deborah J. Fowell permettant B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr souris en accord avec RIKEN BRC grâce à la Bio-ressource nationale du MEXT, Japon.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Références

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