小鼠皮肤和肿瘤淋巴血管白细胞出口的定量

摘要

在这里, 我们展示了在体内定量的方法,白细胞出口从天真, 发炎, 恶性小鼠皮肤。我们对两种模型进行了面对面的比较: 透皮 fitc 应用和原位光转换。此外, 我们还论证了光转换在跟踪皮肤肿瘤白细胞出口方面的作用。

摘要

白细胞从外周组织进入排淋巴结不仅对免疫监测和启动至关重要, 而且有助于外周组织反应的解决。虽然使用了多种方法来量化白细胞从非淋巴, 外周组织, 细胞和分子机制, 控制上下文依赖的出口仍然了解甚少。在这里, 我们描述了使用原位光转换定量分析白细胞出口从小鼠皮肤和肿瘤。光转换允许直接标记白细胞居住在皮肤组织内。虽然皮肤暴露在紫罗兰色的光导致局部炎症反应的特点是白细胞浸润和血管泄漏, 在头部与透皮应用荧光示踪剂的比较, 光转换专门标记迁移树突状细胞群, 同时使骨髓和淋巴出口从皮肤微环境和肿瘤的量化。白细胞出口的机制仍然是我们对肿瘤内白细胞复杂性的理解中缺失的组成部分, 因此本文所述工具的应用将为肿瘤免疫微环境的动态提供独特的见解。在稳定的状态和对治疗的反应。

引言

外周组织免疫反应不仅是由白细胞招募到炎症部位, 但也由机制, 调节其随后的保留。因此, 保护性免疫是由累积的细胞和分子机制决定的, 这些机制决定白细胞是进入、停留在内, 还是通过淋巴血管从外周组织中迁移出去。重要的是, 白细胞通过淋巴血管 (称为出口) 退出组织的倾向与它们的专门功能有关。树突状细胞 (dc) 获取迁移行为, 以响应成熟信号, 导致抗原转运和在排水淋巴结 (dln) 中的表现, 这是适应性免疫1所必需的一个过程。清除骨髓细胞, 如巨噬细胞和中性粒细胞, 有助于清除凋亡的碎片, 通过吞噬。在细菌感染期间, 中性粒细胞退出组织, 并最终在 dln 2 和 dss诱导结肠炎模型中发生凋亡, 数据支持巨噬细胞出口是解决局部炎症³所必需的假设。然而, 中性粒细胞和巨噬细胞的退出是否发生在所有炎症环境中尚不清楚。t 淋巴细胞出口的证据,^从稳定^{状态 4,5,}6, 7, 感染⁸, 并发炎^4,9,^{10 ,11,12个}外周, 非淋巴组织表明 t 细胞积极循环, 虽然基于组织的信号, 推动这一出口仍然很少了解。几项研究确定了定向迁移以排出淋巴毛细血管和随后的出口所必需的信号, 包括趋化因子 (c-c 母题) 配体 21 (ccl21) 及其受体 ccr7 4^{,11, 13}、趋化因子 (c-x-c 母题) 配体 12 (cxcl12) 及其受体 cxcr42、¹⁴和 sphingosine-1-phosphate-磷酸 (s1p)^10、15、16。然而, 这些机制并不是在所有情况下都很活跃, 它们是否决定了所有细胞类型的出口仍然是一个悬而未决的问题。重要的是, 要进一步深入了解控制出口的机制及其在疾病中的功能相关性, 需要定量的体内分析方法。

在体内多个动物模型中, 有几种方法被用来量化出口, 包括淋巴血管的直接插管、体内标记白细胞的采用转移、荧光示踪剂的透皮应用,注射标记颗粒, 并在体内光转换^17,18。直接插管的外发小鼠淋巴管是困难的, 并限制在小动物的液体量, 可以收集。因此, 插管主要是在大型动物 (如绵羊), 在那里这种手术操作是可行的。这些研究为^{淋巴 10、19、20}中存在淋巴和骨髓细胞提供了直接证据。此外, 卵巢模型显示, 急性和慢性炎症增加淋巴细胞在淋巴中的存在近 100倍 10^,21。

通过转移标记和基因操纵的淋巴细胞, 重要地表明 ccr7 是 cd4⁺ t 细胞从剧烈发炎的皮肤^5,11, 而淋巴细胞的预处理所必需的用小分子 s1p 受体激动剂 f其次 720, 仅部分抑制他们的出口¹⁰。有趣的是, 从慢性发炎的皮肤转移的淋巴细胞是 ccr7 独立¹⁰, 但可能部分需要 cxcr4⁹。然而, 采用转移实验通过注射将体外活化淋巴细胞和标记为组织的非生理数量传递给组织, 从而改变组织的生物力学环境和间质液体压力升高打开最初的淋巴毛细血管, 改变它们的运输特性²²。作为替代办法, 在存在或不存在皮肤刺激物 (如邻苯二甲酸二丁酯、dbp) 或感染²³、²⁴的情况下, 荧光素异硫氰酸酯 (fitc) 的透皮应用允许跟踪积累示踪剂并迁移到 dln 的吞噬细胞。同样, 荧光标记的肿瘤提供了一种方法来追踪吞噬细胞, 这些细胞已经吞没^{了肿瘤物质 25}。这些方法为指导^{直流出口 13、14、17、26、27}的机制提供了重要的见解, 但无法跟踪非吞噬细胞淋巴细胞和, 解释可以复杂的可溶性 fitc 的游离淋巴引流, 从而标记非迁移, ln 居民 dc。

另外, 体内显微镜是一个强大的工具, 允许在体内实时跟踪与生理相关的白细胞群 28,^29.体内显微镜与报告小鼠和抗体联合使用, 在体内进行免疫荧光标记, 揭示了免疫细胞贩运的复杂时空动态, 包括间质迁移³⁰, 在淋巴内皮细胞中的迁移, 在淋巴腔内的通道^,以及在 ln 进入 28^,31时的迁移。广泛采用的体内成像技术受到费用、设置所需专业知识以及用于量化多种细胞类型的有限吞吐量的限制。尽管如此, 将分析种群动力学组织的定量方法与生命内成像结合起来, 将为淋巴毛细血管的运动和迁移机制提供额外而重要的机械洞察^18,31,32岁

因此,体内光转换已成为一种方法, 允许原位标记, 独立于吞噬活性, 并定量生理白细胞出口 (当与流式细胞术结合)没有或存在的挑战。kaede-tg 小鼠本组织地表达从石珊瑚中分离出的一种蛋白质, 这种蛋白质表现出绿色荧光 (kaede 绿色), 直到暴露在紫罗兰色的光线下, 之后它不可逆转地转化为红色荧光 (kaede 红色)³³。光转换细胞可以被跟踪, 因为他们从周围组织部位退出和积累在 dln。这和其他类似的光敞篷车模型³⁴,³⁵揭示了重要的生物学, 包括从皮肤的调节 t 细胞^的本构出口 36, cxcr4 依赖 b 细胞出口从 peyer 的补丁³⁷在多肽后动员常驻记忆 t 细胞重新挑战³⁸, 从肿瘤微环境中动员广泛的白细胞出口39。在此, 我们对皮肤炎症和感染情况下的光转换与透皮 fitc 应用进行了面对面的比较, 以便将现有数据与光转换方法直接比较。此外, 我们还演示了植入肿瘤的光转换, 并描述了肿瘤微环境中的转化效率和选择性出口。因此, 我们认为, 需要进一步应用这些方法来阐明肿瘤白细胞出口的关键生物学, 这将对解释骨髓内白细胞复杂性、抗肿瘤免疫和对治疗的反应。

研究方案

所有动物协议都已获得俄勒冈州健康 & 科学大学动物护理和使用机构委员会的批准。

1. 小皮纳炎症和 fitc 绘画的归纳

1. 在层流罩中, 使用蒸发异氟烷麻醉 c57bl6 小鼠 (诱导为3-5% 异氟烷, 并保持在1-3% 异氟烷; 氧气流量为 0.5-1.0 lmmin)。通过监测踏板反射的损失、非自愿的运动和呼吸速率的降低, 确保适当的麻醉。
2. 将耳朵扁平, 耳朵的腹侧朝上。将 5% fitc 溶液的 p0μl 溶解在1:1 丙酮中: 邻苯二甲酸二丁酯 (dbp) 到耳朵 pinna 的腹侧。让耳朵干燥几秒钟。
3. 在 fitc 应用后 24小时, 通过接触二氧化碳对小鼠进行安乐死, 然后进行宫颈脱位。用剪刀将耳朵与头部分离, 将耳针收集到 pbs 中。收集宫颈 dln 和腹股沟非排水 ln 到 pbs 使用推子, 以分离 ln 从周围的组织。腹股沟非排水 ln 将作为 fitc⁺/kaede 红色⁺白细胞存在的负控制。根据机构协议处理尸体。
   注意: 用于分析的最佳拍摄后时间将取决于细胞类型和已知的迁移行为。例如, 树突状细胞最早可以在 dbp 应用后6小时内在 dln 中检测到。

2. 小鼠平纳的炎症和光转换的诱导

1. 在层流罩中, 用腹腔注射 80 mg kg 的氯胺酮和溶解在盐水中的 10 mg/kg xylazine 麻醉一个 kaede-tg 小鼠 (背景 c57bl6)。确保正确的麻醉, 如步骤1.1 中所述。
2. 将耳朵扁平, 耳朵的腹侧朝上。将11:1 丙酮的液滴20μl 连接到耳针的腹侧。让耳朵干燥几秒钟。
3. 应用 dbp 后, 在一片铝箔中切割一个缝隙, 然后将耳朵通过缝隙, 将耳朵暴露在紫罗兰色光源上。将耳朵平放, 背侧朝向上, 使用双面胶带将耳朵固定在铝箔上。
4. 将耳朵直接放置在光源下方, 并在 100 mw 功率下使用 405 nm 光源进行3分钟的光转换。
5. 在光转换24小时后, 对 kaede-tg 小鼠进行安乐死, 并按照步骤1.3 中的描述收获耳朵的羽状、宫颈 ln 和腹股沟 ln。
   注: 除了步骤1.3 中提到的考虑因素外, 增殖率将决定分析的时间, 因为凯德红的损失将发生在快速分裂的细胞中。

3. 小鼠平纳疫苗感染及 fitc 应用

1. 如步骤1.1 所述, 将 c57bl6 小鼠与汽化异氟烷进行麻醉。
2. 将耳朵的腹侧平铺。圆环 5 x 10 6形成斑块的装置 (pfu) 的疫苗病毒 (vacv) 稀释在10μl 的 pbs 到耳朵 pinna。用29规格的针头, 戳到^{松果 40次}。
3. 24小时感染后, 麻醉感染真空的小鼠与异氟烷如步骤1.1 和移液 20μl 5% fitc 溶解在丙酮到内侧侧的耳朵 pinna。让耳朵干燥几秒钟。
4. 在 fitc 申请后 24小时, 对小鼠实施安乐死, 并收集耳针、颈椎 ln 和腹股沟 ln, 如步骤1.3 所述。
   注: fitc 可在感染后的任何时间点适用, 以确定不同24小时间隔的直流贩运。我们以前报告说, dc 迁移到 dln 的水平从第1天到第3天的感染后⁴¹保持在类似的水平。

4. 小鼠平娜和光的感染。

1. 如步骤1.1 中所述, 用汽化的异氟烷对 kaede-tg 鼠标进行麻醉。
2. 如步骤3.2 中所述, 用真空 v 感染耳朵粉红。
3. 感染24小时后, 麻醉感染真空的 kaede 小鼠, 如步骤2.1 中所述, 并执行第 2.3-2.4 步中所述的光转换。
4. 光转换24小时后, 对小鼠进行安乐死, 并按照步骤1.3 中所述, 收获耳朵的羽鼻、颈 ln 和腹股沟 ln。
   注意: 如上文第3.4 步所述, 可在感染后的任何时间点进行光转换。

5. 流式细胞术的耳与淋巴结处理

1. 创建单个细胞悬浮液的耳朵 pinnae: 剥开腹侧和背侧的耳朵 pinna 使用两对推子和地方与耳朵的内部面朝下进入一个24孔板的井, 其中 1 mgml 胶原酶 d 和 80 u/ml pinnae 稀释 汉克缓冲盐水 (hbss) (含 ca^{2 +}和 mg^{2 +})。在37°c 下孵化 30分钟, 通过70μm 尼龙电池过滤器按下消化过的组织。
2. 从 ln 中建立单细胞悬浮液: 将 ln 放置在一个24孔板的井中, 其中含有在 hbss 中稀释的 1 mgmml 胶原酶 d 和 80 uml dnase。用两个29规格的针头打开淋巴结囊, 然后在37°c 孵育淋巴结 30分钟, 通过70μm 尼龙细胞过滤器按下消化过的组织。

6. 真皮内黑色素瘤肿瘤植入术和光转换。

1. 用电动剃须刀把凯德-塔格老鼠背部中央的毛刮掉。
2. 将29规格的针放置在左、右上肩骨之间的背部中心, 并在皮内将 5 x^{10 5}个肿瘤细胞 (在50μl 盐水中稀释) 注射到 kaede-tg 小鼠的皮肤中。肿瘤必须仔细定位, 以确保淋巴引流到指定的淋巴结 (即, 左和右臂 ln 的肿瘤放置在中背部)。避免将肿瘤置于 dln 之上, 因为这会导致 ln 通过皮肤肿瘤直接光转换。
3. 允许肿瘤生长到所需的大小 (0-650 毫米³)。
4. 在组织采集前一天, 麻醉一个 kaede-tg 小鼠, 如2.1 中所述, 并剃光肿瘤周围新再生的毛皮。
5. 在铝箔上切开一个圆形的洞, 然后将肿瘤拉过, 将肿瘤暴露在光源上。将孔切成比肿瘤稍小的切口, 防止肿瘤从孔中回落, 最大限度地减少相邻、非肿瘤皮肤的转化。
6. 将肿瘤直接置于光源下方, 并在200mw 功率下使用 405 nm 光源进行5分钟的光转换。
7. 光转换24小时后, 对小鼠进行安乐死, 如步骤1.3 中所述。收集肿瘤, 臂部 dln, 腹股沟非排水 ln 到 pbs。按照步骤1.3 中的描述, 用剪刀将肿瘤从周围皮肤上剪掉, 并取出 ln。

7. 流式细胞术的肿瘤和淋巴结处理

1. 从肿瘤中创建单个细胞悬浮液: 用剪刀将肿瘤切割成一个24孔板的井, 其中含有 1 mgml 胶原酶 d 和 80 uml dnase 稀释在 hbss 中。在37°c 下培养 1小时. 通过70μm 尼龙过滤器压住消化过的组织。
2. 如步骤5.2 中所述, 创建淋巴结的单个细胞悬浮液。

8. 流式细胞仪抗体染色

1. 在将组织消化成单个细胞悬浮液后, 执行标准的流式细胞术染色技术, 用感兴趣的标记标记细胞。简单地说, 将 2 x 10⁶个细胞放入96孔板中。用 fc 块 (1μgml) 在冰上加用样品 20分钟;用 fac 缓冲液清洗两次 (pbs 中1% 的牛血清白蛋白)。在样品中加入活的/死的污渍 (在 pbs 中稀释), 在冰上孵育 15分钟;用 mac 缓冲液清洗两次。用原生抗体 (材料表) 在 fac 缓冲液中稀释30分钟在冰上进行;用 mac 缓冲液清洗两次。
   注: kaede green 和 kaede 红色荧光与 fitc 和 pe 荧光重叠;因此, fitc 和 pe 共轭抗体不能与 kaede 蛋白结合使用。
2. 染色后, 在流式细胞仪上运行样品。或者, 使用2% 的 pfa 固定单元格。

9. 流式细胞仪分析

1. 使用前体内kaede green 或 kaede 红色单色花细胞或血液将 fitc (kaede green) 和 pe (kaede red) 通道 pmt 电压设置为总范围的 70-80% (中心人口约为 10⁴⁾。
   注意: 不要补偿凯德绿色 (fitc) 和 kaede 红色 (pe) 通道, 因为这将导致更大的信号传播。
   1. 要创建单色凯德控制, 收集脾脏或血液从凯德-tg 鼠标。用 ack 缓冲液将红血球分开, 然后将细胞分成两组: 未转换的 kaede 绿色和转换的 kaede 红色。
   2. 对于单色 kaede 红色控制, 悬挂 pbs 1 毫升中的细胞, 并在24孔板中使用 405 nm 光源, 以 100 mL 的功率进行5分钟的光转换。使用这些单元在流式细胞仪上设置 kaede green (fitc) 和 kaede 红色 pmt 电压 (步骤 9.1)。
2. 一旦凯德蛋白的电压设置好, 就可以根据制造商的说明, 使用带有补偿珠标签的单荧光机标记来补偿所有其他主要抗体污渍。
3. 在流式细胞仪上运行样本以收集数据。
   注意: 凯德蛋白是由细胞不断产生的。这意味着光转换后 24小时, 转换后的细胞将是双阳性的凯德绿色和凯德红色新合成的凯德 (绿色) 蛋白已在细胞中积累。
4. 使用 flowjo 软件或类似软件分析数据。

结果

我们首先试图复制发表在文献中的光转换结果, 以评估效率, 并确定相关的炎症在小鼠皮肤。耳朵 pinna 暴露在 100 mw 紫罗兰色光 (405 nm) 3分钟之前所述的 33.暴露后立即从耳皮或宫颈 dln 产生的单个细胞悬浮液显示, 皮肤中所有 cd45⁺白细胞的转化效率为 78%, 在 dln 中没有观察到转化细胞 (图 1a)。为了评估与光转换相关的炎症反应,...

讨论

尽管外周、非淋巴组织的白细胞出口对免疫反应的启动和解决至关重要, 但控制出口的分子机制却鲜为人知。这种知识差距在很大程度上是由于可随时提供在体内进行量化的工具。在这里, 我们描述了使用光敞篷小鼠 (kaed-tg) 量化皮肤和肿瘤的白细胞出口, 并提供了一个直接的面对面比较与 fitc 油漆在炎症和感染模型。我们证明, 虽然这两种模型跟踪内源性 dc 种群, fitc 的自由引流和非吞噬细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase	Roche	4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor	Prizmatix Ltd	V8144
Fluorescein isothiocyanate isomer I	Sigma-Aldrich	F4274
dibutyl phthalate	Sigma-Aldrich	524980
acetone	Macron Fine Chemicals	2440-02
29-guage syringes	Exel International	26029
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
70 um cell strainers	VWR	732-2758
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
HBSS	Caisson	HBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32	Tonbo Biosciences	70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)	Biolegend	117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)	BD Pharmingen	562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)	Biolegend	100341
APC CD8a (clone 53-6.7)	TonBo Biosciences	20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103116
BV650 CD19 (clone 6D5)	Biolegend	115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)	Biolegend	128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)	Biolegend	123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)	Biolegend	127623
BV711 CD11b (clone M1/70)	Biolegend	101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)	BD Biosciences	563726
Bovine serum albumin (Fraction V)	Fisher Scientific	BP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set	BD Biosciences	552845
Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences
FlowJo v10 Software	FlowJo