في فيفو التعبير المستهدفة من البروتينات أوبتوجينيتيك باستخدام الأفلام الحرير/إف

Summary

وهنا نقدم طريقة لإيصال النواقل الفيروسية التعبير في الدماغ باستخدام الأفلام fibroin الحرير. هذا الأسلوب يسمح التنفيذ الهادف لناقلات التعبير باستخدام الألياف البصرية المغلفة بالحرير/إف ومدبب من الألياف الضوئية ونوافذ الجمجمة.

Abstract

السعي فهم كيف العصبية دوائر المعلومات العملية من أجل إخراج محرك الأقراص السلوكية قد ساعد إلى حد كبير بوسائل بصرية وضعت مؤخرا للتلاعب ورصد نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي. تعتمد هذه الأنواع من التجارب على عنصرين رئيسيين هما: 1) القابلة للغرس من الأجهزة التي توفر الوصول البصرية إلى الدماغ، والبروتينات 2) حساسة للضوء أن تغيير استثارة الخلايا العصبية أو تقديم قراءات لنشاط الخلايا العصبية. وهناك عدد من الطرق للتعبير عن البروتينات حساسة للضوء، ولكن الحقن ستيريوتاكسيك من النواقل الفيروسية حاليا النهج الأكثر مرونة لأنه يمكن التحكم في التعبير بدقة الوراثية والتشريحية والزمانية. على الرغم من فائدة كبيرة من النواقل الفيروسية، إيصال الفيروس إلى الموقع الذي يزرع الضوئية يطرح العديد من التحديات. حقن فيروس ستيريوتاكسيك يطالبون بالعمليات الجراحية التي زيادة وقت الجراحة، وزيادة تكلفة الدراسات، وتشكل خطرا على صحة الحيوان. يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة فعلياً بحقنه الحقن ومكسبه الالتهابات الناجمة عن تسليم المفاجئ بلعه فيروسات عالية-عيار. محاذاة الحقن مع يزرع الضوئية ومن الصعوبة عند استهداف المناطق الصغيرة في أعماق الدماغ. للتغلب على هذه التحديات، يمكننا وصف طريقة لطلاء أنواع متعددة من يزرع بصري مع الأفلام تتكون من الحرير fibroin ومتجهات (إف) الفيروسية المرتبطة بالغدة. يمكن تغليف بوليمر المستمدة من الشرنقة من موري بومباي، فيبروين، وحماية الجزيئات الحيوية ويمكن معالجتها في أشكال تتراوح بين الأفلام القابلة للذوبان للسيراميك. عند زرعها في الدماغ، الطلاء الحرير/إف الإفراج عن الفيروسات في مجال التفاعل بين العناصر البصرية والدماغ المحيطة بها، ويقود التعبير تحديداً حيث أنه مطلوب. هذا الأسلوب هو تنفيذها بسهولة ويبشر بأن ييسر إلى حد كبير في فيفو دراسات مهمة الدائرة العصبية.

Introduction

العقد الماضي أسفر انفجار هندسة البروتينات حساسة للضوء لرصد ومعالجة النشاط العصبي¹. فيروسات توفر مرونة لا مثيل لها للتعبير عن هذه الأدوات أوبتوجينيتيك في المخ. وبالمقارنة بالحيوانات المحورة وراثيا، الفيروسات أسهل بكثير لإنتاج ونقل وتخزين والسماح بالتنفيذ السريع لأحدث أدوات أوبتوجينيتيك. يمكن استهداف التعبير وراثيا للسكان العصبية متميزة، والفيروسات المصممة لنقل إلى الوراء حتى يمكن أن تستخدم لاستهداف التعبير استناداً إلى اتصال الخلايا العصبية².

عادة ما يتم إدخال الفيروسات مع حقن ستيريوتاكسيك، التي يمكن أن تكون صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. دقة استهداف المناطق الصغيرة يمكن أن تكون صعبة، بينما القيادة التعبير أكثر مجالات واسعة كثيرا ما يتطلب العديد من الحقن. وعلاوة على ذلك، عندما يكون جهاز بصري مزروع في وقت لاحق في الدماغ لتسليم الخفيفة في فيفو، عملية الزرع يجب أن تكون محاذاة بشكل صحيح مع حقن الفيروسية. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنفيذها بسهولة عن تسليم ناقلات الأمراض الفيروسية للأنسجة حول جهاز مزروع باستخدام الحرير fibroin الأفلام³. فيبروين الحرير المتاحة تجارياً، ويتغاضى عنها جيدا بالانسجة العصبية، ويمكن استخدامها لإنتاج مواد ذات خصائص متنوعة. يمكن تطبيقها ليزرع باستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل الماصات microinjection أفلام الحرير أو من ناحية الماصات. الأفلام الحرير/إف إلغاء شرط اثنين العمليات الجراحية والتأكد من أن الفيروس بوساطة التعبير بشكل صحيح محاذاة لزرع الضوئية. التعبير الناتج مقيد إلى غيض من الألياف، والنتائج في أقل تعبير غير المرغوب فيها على طول مسار الألياف من حقن ستيريوتاكسيك.

بالإضافة إلى إنتاج التعبير المستهدفة في غيض من ألياف صغيرة، يمكن استخدام أفلام الحرير/إف لحملة على نطاق واسع (> 3 مم) التعبير القشرية تحت windows الجمجمة. في فيفو التصوير 2-فوتون من أجهزة الاستشعار النشاط الفلورسنت أصبحت أداة لا غنى عنها لتقييم دور نشاط الخلايا العصبية في القيادة المعالجة الحسية والمعرفية. ومع ذلك، أداء التعبير على مناطق واسعة القشرية، المجربون في كثير من الأحيان لقيادة موحدة حقنات متعددة. هذه الحقن يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً جداً، ويمكن أن يؤدي إلى التعبير غير متناسقة عبر مجال الرؤية. وفي المقابل، الحرير/إف-المغلفة النوافذ الجمجمة سهلة للغاية صنع ويقلل كثيرا من الوقت اللازم للعمليات الجراحية، وآخر ملحوظ محرك التعبير مئات ميكرون تحت السطح القشرية.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها "اللجنة الدائمة هارفارد" في "رعاية الحيوان" ووصف المبادئ التوجيهية التالية في "المعاهد الوطنية للصحة لنا" دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. واستخدمت الفئران C57BL/6 الكبار من كلا الجنسين (6-15 أسبوعا عمر) لجميع التجارب.

1-الحصول على فيبروين الحرير مائي

1. إعداد أو شراء fibroin الحرير مائي (5-7.5% w/v).

2-خلط مائي الحرير مع ناقلات التعبير إف

1. اختر متجه تعبير إف محرك البروتين أوبتوجينيتيك أو مؤشر الفلورسنت الاختيار.
   ملاحظة: للتقليل من حجم الحرير/إف التي يجب تطبيقها ليزرع أثناء القيادة لا تزال قوية التعبير، ينصح إف عيار الأوراق المالية (الأسهم التتر الحصول عليها عادة من النوى ناقلات حوالي ~ 10¹³ gc/mL).
2. قبل مباشرة يزرع طلاء، ذوبان الجليد قاسمة إف والجمع fibroin الحرير مائي 5-7.5 ٪ (سيشار إلى هذا الخليط كالحرير/إف). في أنبوب بكر 200 ميليلتر، مزيج فيبروين المائية واف في نسبة 1:1 (لاستخدام windows الجمجمة 1:4) قبل التطبيق مباشرة. بلطف "الماصة؛" الحل والخروج عدة مرات مزيج دقيق fibroin واف.
3. تبقى خليط الحرير/إف على الجليد قبل استخدامها.

3-إعداد المعدات لتصنيع وتخزين أجهزة الحرير/إف-المغلفة

1. شراء معدات لطلاء الألياف الضوئية والعدسات متدرجة-فهرس (ابتسامة) (الأرقام 1، 2).
   1. بناء حامل التسليح مستقرة. عقد الحلقات, والسيراميك، وحفر ثقوب 1.25 ملم في كتلة من ورقة اﻷكريليك ¼ ". اضغط على ثقوب لإدراج مجموعة مسامير من الجانب لعقد الحلقات, وفي المكان.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي المشبك لهذا الغرض.
   2. ضع مناور بدقة ملليمتر الفرعية لنقل الألياف الضوئية (جهاز ستيريوتاكسيك أو ميكرومانيبولاتور الدقيقة الأخرى).
   3. تجميع حامل مستقرة لتحديد موضع في ميكروينجيكتور.
   4. استخدام ستيريوسكوبي لتصور التجميعية الحرير والألياف البصرية.
   5. ضع مصدر ضوء لإضاءة الألياف البصرية.
2. إعداد المعدات لدهان الجمجمة windows (الشكل 3).
   1. اختيار أي بيبيتور P10.
   2. الحصول على حاوية مع غطاء.
      ملاحظة: يتم اقتراح أي حاوية مع قاع سيليكون – الجزء السفلي لينة يسهل رفع النوافذ الجمجمة.
3. إعداد المعدات لتخزين يزرع الانتهاء (الشكل 4).
   1. الحصول على فراغ (1-5 لتر) غرفة صغيرة.
   2. تأكد من أن هناك مساحة لتخزين يزرع في ثلاجة 4 درجات مئوية.

4-تطبيق الفيلم الحرير/إف للأجهزة

1. طلاء الألياف الضوئية للتعبير تنسيق محرك الأقراص على طرف الألياف
   1. إعداد يزرع الألياف المزمن كما هو موضح سابقا⁴.
   2. قبل الشروع في الاستخدام، شطف يزرع مع الإيثانول، ثم مع الماء عالي النقاوة للتأكد من أن الألياف الضوئية نظيفة.
      ملاحظة: الأفلام الحرير التقيد أكثر موثوقية لتنظيف أسطح الزجاج.
   3. تحضير جهاز لعقد الحلقات, والألياف. مم للحلقات, نموذجية 1.25 مم وقطرها استخدام كتلة اﻷكريليك واضحة، مع ~1.3 ¼ بوصة الثقوب، وتستغل مجموعة مسامير تدخل من الجانب إلى ثقب يزرع بشدة في مكان (الشكل 1A).
   4. جبل صاحب التسليح في جهاز ستيريوتاكسيك (أو أي حل التلاعب بدقة سوبميليميتير) مجهزة ميكروينجيكتور. مكان صاحب التسليح أعلاه ميكروينجيكتور وتطبيق الخليط الحرير/إف من الأسفل.
      ملاحظة: هذا بسبب التطبيقات كميات كبيرة من فوق أسفرت الحرير/إف أن لم يكن مقصورا على الحافة. ومع ذلك، يمكن أن تنتج تطبيق العديد من أحجام صغيرة متسلسلة من أعلى أو أسفل الودائع إف/الحرير التي تقتصر على الطرف (على الرغم من أننا نفضل أن تطبق من الأسفل).
   5. سحب ماصة حقن داخل الجمجمة قياسية من زجاج البورسليكات الشعرية.
      1. لتجعل من السهل على
      2. لإنتاج نصيحة حقن مع تلميح شقة نظيفة للقطر المطلوب وعقد ماصة واحدة في كل جهة واستخدم الجزء أكثر سمكا من تفتق على ماصة واحدة لنقاط ماصة أخرى في موقع فاصل المطلوب.
      3. فرك بلطف ذهابا وإيابا في حركة سونج (أسلوب التهديف الزجاج على الزجاج).
      4. بعد التسجيل الماصة، تطبيق ضغط لطيف على غيض ماصة سجل مع جثة ماصة أخرى لتحقيق الانفصال.
   6. ضع ستيريوسكوبي لإعطاء فكرة واضحة عن وجوه الألياف الضوئية.
      ملاحظة: يجب أن يكون التكبير كافية بدقة موقف ماصة حقن أعلاه على وجه الألياف الضوئية.
   7. إدراج يزرع الألياف مع الجانب الدماغ من الألياف الضوئية التي تواجه أسفل حامل.
   8. تحميل ماصة حقن مع حل الحرير/إف، أما بالنسبة لأي معيار الحقن داخل الجمجمة⁵. تحميل المبلغ المطلوب لعدد يزرع تبذل، بالإضافة إلى ~ 30% إضافية لاستيعاب الخسائر بسبب انسداد الماصات. على سبيل المثال، إذا كان يتم إجراء عملية زرع 10، ثم تحميل مع 100 nL الودائع وسحب ~1.3 ميليلتر.
      ملاحظة: قد تجف الحرير/إف في تلميح ماصة بين الانقذافات، التي يمكن أن تسد الماصة. كبيرة قطرها الماصات (50-100 ميكرومتر) أقل احتمالاً لتسد. يمكن فكها قباقيب بالفرشاة لطيف أسفل طرف الماصة مع مسحه مسح أو الكحول ورق رطب.
   9. مناورة ماصة حقن حتى يتم لمس أو لمس تقريبا وسط سطح الألياف الضوئية. إخراج nL 10-20 لحل الحرير/إف. سحب الماصة.
      ملاحظة: أن معدل الولادة ليست حاسمة، ولكن معدلات نموذجية هي 5-20 nL/s.
   10. نلاحظ بولس من الحرير/إف على سطح مسطح الذي يظهر كقبة سائل الذي يجف لفيلم شقة داخل ~ 1 دقيقة (الشكل 1B).
   11. كرر الخطوات 4.1.9-4.1.10 حتى المبلغ المطلوب من الحرير/إف أودعت (أي ما مجموعة 20-200 nL لمعظم التطبيقات). عند إعداد يزرع متعددة، تطبيق الحرير/إف لزرع واحد وثم الانتقال إلى معطف أخرى يزرع قبل العودة إلى الأولى.
   12. تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.
   13. فراغ بين عشية وضحاها ديسيككاتي في ~ 125 عربة (-25 في. Hg)، 4 درجة مئوية. القيام بذلك عن طريق وضع صاحب أسرة التسليح في فراغ غرفة.
   14. تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة. ضمان أن تقتصر الأفلام غيض سطح الألياف الضوئية، وأن تكون رقيقة نسبيا (> 100 ميكرومتر)، ومتناظرة (الشكل 1).
       ملاحظة: قد إزاحة كبيرة أو غير متناظرة من أفلام الحرير/إف من الألياف أثناء غرس (الشكل 1). السبب الأكثر شيوعاً لمشاكل ناشئة عن تطبيق كميات كبيرة واحدة بدلاً من تطبيق العديد من أحجام صغيرة متتالية.
2. طلاء مدبب الألياف البصرية إلى التعبير بالسيارة على طول محور الألياف
   1. الحصول على الألياف الضوئية مدبب يزرع وإجراء الخطوات 4.1.2-4.1.8، إلا أن الألياف مدبب يوضع أفقياً فإنه يكون عمودي على محقن (الشكل 2A). موقف الحاقن أعلاه الألياف مدبب.
      ملاحظة: تحميل قطيرات على ألياف مدبب يشكل إضافة التحديات، نظراً للتوتر السطحي يميل إلى يسبب قطرات القفز إلى الوراء على ماصة الحقن أو ترحيل إعداد الألياف مدبب. أصغر حقن الماصات (30-50 ميكرون القطر) تساعد على التغلب على هذه المشكلة ولكن زيادة الخطر الذي سوف تسد ماصة حقن. بسبب التوتر السطحي، قطرات تميل إلى التمسك بمجال أكبر من المساحة السطحية، لذلك حقن الأمثل "الماصة؛" الحجم يعتمد على حجم الألياف مدبب والتسامح واحد لتسد أحياناً.
   2. ضع ماصة حقن الحرير/إف ضد الجانب من الألياف الضوئية في بداية تفتق. تأكد من أن يلمس ماصة حقن الألياف الضوئية.
   3. إخراج 20 nL من الحرير/إف لبدء عملية الطلاء. ضمان أن الحبرية تتمسك بالألياف الضوئية، وما زال في الواجهة من الألياف/الماصة. فتيلة الحبرية نهاية طرف الألياف بلطف كما يجف الحرير/إف (~ 45 ثانية). تبقى ماصة الحقن على اتصال مع الحبرية التجفيف لتجنب انسداد طرف ماصة.
      ملاحظة: ينبغي أن معطف كل إيداع ما يقارب 400 ميكرون من الألياف مدبب (الشكل 2).
   4. عند بولس الأول قد جفت تماما تقريبا، إخراج آخر 20 nL ومواصلة فتل الحبرية على طول تفتق.
      ملاحظة: سوف تتمسك الحرير السائل بالحرير المجففة، ترسيخ واحدة من نهاية الحبرية ماصة تتحرك على طول تفتق.
   5. كرر الخطوة 4-2-4 بإخراج كميات صغيرة من الحرير/إف، والرسم الحل الذي يصل إلى جانب تفتق تدريجيا. 5-6 الانقذافات تكفي لاجتياز سطح تفتق 2.5 ملم.
   6. لدفع المزيد من التعبير موحدة حول كافة جوانب من الألياف، تدوير الألياف وكرر الخطوات 4.2.2-4.2.5 حتى بعد إيداع المبلغ المطلوب من الحرير/إف.
   7. إذا شنقاً حبلا من المجففة الحرير/إف يمتد إلى أبعد من طرف الألياف، قطع حبلا عناية مع مقص، أو استخدام ماصة الإخراج لثني حبلا العودة والتمسك بأنها تفتق الألياف.
   8. تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.
   9. فراغ بين عشية وضحاها ديسيككاتي في 4 درجات مئوية. يمكن وضع صاحب أسرة التسليح في فراغ غرفة.
   10. تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة.
       ملاحظة: الأفلام لا يلزم أن تكون موحدة تماما ولكن لا ينبغي أن تكون المطبات التي تمتد أكثر من 100 ميكرومتر خارج سطح الألياف للتقليل من الضرر للأنسجة المحيطة من خلال غرس (الشكل 3). لتصغير حجم الفيلم، من الأهمية بمكان أن كل قطره جافة تماما قبل الإيداعات اللاحقة.
3. عملية زرع العدسة ابتسامة طلاء
   1. الحصول على ابتسامة العدسات^6،7 وكرر الخطوات 4.1.2-4.1.8. يمكن تركيبة الحاقن أعلاه.
   2. إيداع الحرير/إف في قذف واحدة (1 ميليلتر لعدسة قطرها 1.0 مم).
      ملاحظة: هذا سيؤدي إلى قبة سائل أن تتمسك بوجه العدسة، ويجفف لإنتاج فيلم موحدة (100-200 ميكرومتر سميكة). ومع ذلك، في حالة ما إذا يجف موزعة قذف كبير واحد وتنتج فيلم الذي أكثر سمكا قرب حواف العدسة ابتسامة، حاول إيداع قطرات أصغر متعددة (100-200 nL) في وسط سطح العدسة (السماح لكل قطره الجافة قبل إيداع القادم) لضمان أن الفيلم سيكون محرك التعبير في مركز مجال الرؤية.
   3. تسمح ح 1 تجفيف قبل أن ينتقل يزرع.
   4. تقييم الشكل والموقف من الفيلم الحرير الناتجة تحت مجهر عالية الطاقة لضمان أن الفيلم يغطي سطح العدسة.
4. طلاء زجاج النوافذ الجمجمة
   1. إعداد الزجاج ويندوز الجمجمة المنضمة قطرها 3 مم اثنين جولة كوفيرسليبس (سمك رقم 1) إلى نافذة واحدة قطرها 5 ملم بمادة لاصقة الضوئية (لمزيد من التفاصيل، انظر جولديي وآخرون عام 2014⁸).
   2. مزيج من الحرير: الفيروس بنسبة 1:4 لتخفيض المبلغ الإجمالي للحرير في الفيلم. لا تذوب كميات مفرطة من الحرير تحت windows الجمجمة بعد زرع. قد يلزم تجارب المعايرة لتحديد نسبة وحجم الذي يعطي الشخصية التعبير المطلوب.
   3. اليد "الماصة؛" معالجة تجميعية 5 ميليلتر على السطح ساترة 3 مم (المواجه للدماغ). وينبغي أن تنتشر الحبرية لتغطية سطح الزجاج كامل (الشكل 3).
   4. تسمح ح 2-3 للتجفيف قبل نقل الإطارات.

5-تخزين يزرع الحرير/إف-المغلفة

1. تخزين الحرير/إف-المغلفة الألياف الضوئية في مجفف فراغ تبريد (~ 125 عربة، 4 درجة مئوية) قبل استخدام (الشكل 4 أ).
2. لا تقم بتخزين windows الجمجمة والعدسات ابتسامة تحت الفراغ، حيث أن الأفلام الحرير الكبيرة المخزنة تحت فراغ لا تذوب تماما بعد زرع. زرع نوافذ الجمجمة والعدسات ابتسامة فورا بعد التجفيف، أو خلال يوم من صنعها إذا كانت مخزنة في الضغط الجوي و 4 درجة مئوية.

6-غرس الأجهزة

1. إعداد الحيوانات لجراحة زرع كما هو موضح سابقا⁴.
   1. بإيجاز، تخدير الفئران مع حقن داخل من الكيتامين/إكسيلازيني (100/10 مغ/كغ) وتحقق من عمق التخدير باستخدام إصبع القدم-قرصه لطيف. يحلق في الجمجمة في مجال الزرع وتنظيف فروة الرأس مع اليود والكحول.
   2. جبل الحيوانات في جهاز ستيريوتاكسيك وتكملة التخدير باستخدام خليط من الأوكسجين وإيسوفلوراني (1-2%). جعل شق في فروة الرأس أكثر من مجال الاهتمام، وتؤدي اوديما كبيرة بما يكفي لاستيعاب عملية الزرع.
2. زرع الألياف البصرية⁹ وميكروندوسكوبي العدسات¹⁰ وفقا لإجراءات سبق نشرها. مقبض يزرع بعناية، كما يمكن أن تربعت إيداع الحرير/إف اوديما ناقصة، أو بزرع الأنظار على حافة الجمجمة. انخفاض عملية الزرع في الدماغ ببطء (~ 2 مم/دقيقة).
3. زرع windows الجمجمة كما وصف سابقا⁸. لا تلمس الجانب المغلفة إطار وتجنب الشطف النافذة مع السائل إذا كان أداء تزقيمية مدتها، كهذا قد يغسل الفيروس. لتحقيق أقصى حد من التعبير، أداء دوروتومي.

7-تقييم التعبير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

1. تقييم تعبير البروتينات أعرب فيروسي، تسمح ~ 2-3 أسابيع بالنسبة للفيروس إلى محرك التعبير، ثم إجراء نضح إينتراكارديال مع بارافورمالدهيد 4 ٪ في الفوسفات مخزنة أنسجة المخ¹¹ وعملية المحلول الملحي في فلوري ¹²من الفحص المجهري.
2. تقييم التعبير باستخدام مجهر فلوري الصورة في نمط التعبير للبروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري.
3. في حالة عدم كفاية مستوى التعبير، زيادة كمية الفيروس في الطلاء أما زيادة الحجم الإجمالي لطلاء الحرير/إف، أو يفضل أن يتم ذلك باستخدام فيروس عيار أعلى.

النتائج

لتقييم نجاح الأفلام الحرير/إف في قيادة التعبير، نحن perfused الحيوانات 2-3 أسابيع بعد زرع وإعداد شرائح الدماغ من المنطقة من الفائدة. صور الأسفار من البروتينات أوبتوجينيتيك معلم فلوروفوري (ChR2-يفب) تقدم مقياسا لمدى تعبير (الشكل 1). الألياف الضوئية النموذجية (230 مي...

Discussion

استخدام الحرير/إف أن تستهدف التعبير عن البروتينات أوبتوجينتيك ويتغلب على القيود المفروضة على النهج التي قيد الاستخدام حاليا. على الرغم من أن العديد من الدراسات بنجاح استخدام حقن إف للتعبير عن البروتينات أوبتوجينيتيك، أنها تمثل تحديا لمحاذاة التعبير إلى غيض الألياف الضوئية وإلى المناطق ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.