In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film

Riepilogo

Qui, presentiamo un metodo per la distribuzione di vettori di espressione virale nel cervello utilizzando seta fibroin film. Questo metodo consente la somministrazione mirata di vettori di espressione utilizzando fibre ottiche rivestite di seta/AAV, fibre ottiche coniche e windows cranica.

Abstract

La ricerca per comprendere i circuiti neurali come informazioni di processo in ordine per pilotare l'uscita comportamentale sono stata notevolmente facilitate da recentemente sviluppato metodi ottici per manipolare e monitoraggio dell'attività dei neuroni in vivo. Questi tipi di esperimenti si basano su due componenti principali: 1) impiantabili che forniscono accesso ottico al cervello e proteine 2) sensibili alla luce che cambiare l'eccitabilità neuronale o forniscono una lettura dell'attività neuronale. Ci sono un certo numero di modi per esprimere proteine sensibili alla luce, ma iniezione stereotassica di vettori virali attualmente è l'approccio più flessibile perché espressione può essere controllato con precisione genetica, anatomica e temporale. Nonostante la grande utilità di vettori virali, consegnando il virus al sito di ottica impianti pone numerose sfide. Iniezioni di virus stereotassiche chiedono interventi che aumentano il tempo chirurgico, aumentano il costo degli studi e costituiscono un rischio per la salute dell'animale. Il tessuto circostante può essere fisicamente danneggiato dalla siringa di iniezione e da immunogeno infiammazione causata dalla brusca somministrare un bolo di alto-titolo virus. Allineando le iniezioni con gli impianti ottici è particolarmente difficile quando la destinazione è piccole regioni profondità nel cervello. Per superare queste sfide, descriviamo un metodo per il rivestimento di più tipi di protesi ottiche con film composto di seta fibroin e Adeno-associato di vettori virali (AAV). Fibroina, un polimero derivato dal bozzolo del Bombyx mori, possibile incapsulare e proteggere biomolecole e possono essere trasformati in forme che vanno dalle pellicole solubile alla ceramica. Quando sono impiantati nel cervello, seta/AAV rivestimenti rilasciare virus all'interfaccia tra elementi ottici e cervello circostante, guida espressione proprio dove serve. Questo metodo viene implementato facilmente e promette di facilitare notevolmente gli studi in vivo della funzione del circuito neurale.

Introduzione

Nell'ultimo decennio ha prodotto un'esplosione di proteine ingegnerizzate sensibili alla luce per il monitoraggio e manipolare l'attività neurale¹. Virus offrono una flessibilità senza paragoni per esprimere questi strumenti optogenetica nel cervello. Confrontato agli animali transgenici, virus sono molto più facili da produrre, trasportare e conservare, garantendo una rapida implementazione dei più recenti strumenti optogenetica. Espressione può essere mirata geneticamente distinte popolazioni neuronali, e virus progettato per il trasporto retrogrado può essere utilizzato anche per espressione basata su connettività neuronale²di destinazione.

Virus di solito vengono introdotti con iniezioni stereotassiche, che possono essere lungo e impegnativo. Targeting con precisione piccole regioni può essere difficile, mentre guidando espressione sopra vasti settori spesso richiede molte iniezioni. Inoltre, quando un dispositivo ottico viene successivamente impiantato nel cervello per fornire luce in vivo, l'impianto deve essere correttamente allineato con l'iniezione virale. Qui, descriviamo un metodo facilmente implementati per la distribuzione di vettori virali per il tessuto intorno un dispositivo impiantato utilizzando seta fibroin film³. Seta fibroin è commercialmente disponibile, ben tollerato dai tessuti neurali e può essere usato per produrre materiali con proprietà diverse. Seta film può essere applicato agli impianti utilizzando attrezzature di laboratorio comuni come microiniezione pipette o pipette a mano. Seta/AAV film eliminare il requisito per due interventi chirurgici e garantire che espressione virus-mediate è correttamente allineato all'impianto ottico. L'espressione risultante è vincolato all'estremità delle fibre e risultati in meno espressione indesiderate lungo la pista di fibra rispetto iniezioni stereotassiche.

Oltre a produrre espressione mirata all'estremità di piccole fibre, seta/AAV film può essere utilizzato per guidare diffusa (> 3 mm di diametro) espressione corticale sotto windows cranica. In vivo imaging 2 fotoni di sensori di movimento fluorescente è diventato uno strumento indispensabile per valutare il ruolo dell'attività neuronale nel guidare l'elaborazione sensoriale e cognitivo. Tuttavia, per guidare uniforme espressione sopra le vaste aree corticali, sperimentatori spesso eseguire iniezioni multiple. Queste iniezioni possono essere estremamente che richiede tempo e possono portare all'espressione incoerente in tutto il campo visivo. Al contrario, seta/AAV-rivestito cranica windows sono estremamente facili da produrre, ridurre notevolmente il tempo richiesto per interventi chirurgici e guidare il più notevolmente espressione centinaia di micron sotto la superficie corticale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato permanente di Harvard su Animal Care seguenti linee guida descritte nella NIH ci Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6 adulti di entrambi i sessi (6-15 settimane di età).

1. ottenere acquosa seta Fibroin

1. Preparare o acquistare acquosa seta fibroin (5-7,5% w/v).

2. Mix seta acquosa con vettori di espressione di AAV

1. Scegliere un vettore di espressione di AAV per guidare la proteina optogenetica o indicatore fluorescente di scelta.
   Nota: Per ridurre al minimo il volume di seta/AAV che devono essere applicate agli impianti durante la guida ancora espressione robusta, stock-titolo AAV (magazzino titoli in genere ottenuti dai nuclei di vettore sono intorno a 10 ~¹³ gc/mL) è consigliabile.
2. Immediatamente prima della protesi di rivestimento, scongelare un'aliquota dell'AAV e combinare con 5-7,5% acquosa seta fibroin (questa miscela verrà denominata a come seta/AAV). In un tubo PCR 200 µ l, mescolare fibroina acquosa e AAV in un rapporto di 1:1 (uso windows cranica 1:4) immediatamente prima dell'applicazione. Delicatamente dispensare la soluzione dentro e fuori più volte per mescolare accuratamente la fibroina e AAV.
3. Mantenere la miscela di seta/AAV sul ghiaccio prima dell'uso.

3. preparare attrezzature per la lavorazione e conservazione dei dispositivi di seta/AAV-rivestito

1. Procurarsi attrezzature per rivestimento fibre ottiche e sfumatura-indice (GRIN) lenti (figure 1, 2).
   1. Costruire un supporto stabile puntale. Per tenere boccole in ceramica, praticare fori di 1,25 mm in un blocco di ¼" acrilico foglio. Fori per inserire viti dal lato per tenere i puntali sul posto.
      Nota: Qualsiasi morsetto può essere utilizzato per questo scopo.
   2. Posizionare un manipolatore con precisione sub-millimetrica per spostare le fibre ottiche (apparato stereotassica o altri micromanipolatore di precisione).
   3. Montare un supporto stabile per posizionare il microinjector.
   4. Utilizzare uno stereoscopio per visualizzare fibre ottiche e gocciolina di seta.
   5. Posizionare una fonte di luce per illuminare le fibre ottiche.
2. Preparare l'apparecchiatura per la verniciatura di finestre craniche (Figura 3).
   1. Scegliere qualsiasi pipettatore P10.
   2. Ottenere un contenitore con coperchio.
      Nota: Qualsiasi contenitore con fondo in silicone è suggerito — fondo morbido facilita il sollevamento Windows cranica.
3. Preparare l'apparecchiatura per memorizzare gli impianti finiti (Figura 4).
   1. Ottenere una piccola camera a vuoto (1-5 L).
   2. Assicurarsi che ci sia spazio per memorizzare gli impianti in un frigorifero a 4 ° C.

4. applicare seta/AAV Film ai dispositivi

1. Rivestimento fibre ottiche per l'espressione focale unità presso la punta della fibra
   1. Preparare gli impianti fibra cronica come descritto in precedenza⁴.
   2. Prima dell'uso risciacquare gli impianti con etanolo, quindi con acqua ultrapura per garantire che le fibre ottiche sono pulite.
      Nota: Film seta aderire in modo più affidabile per la pulizia di superfici in vetro.
   3. Preparare un dispositivo per tenere i puntali della fibra. Per puntali di diametro tipico 1,25 mm, utilizzare un blocco di acrilico trasparente, con ~1.3 ¼ di pollice mm fori e tappata viti entrando dal lato foro sugli impianti saldamente in posizione (Figura 1A).
   4. Monte titolare del puntale in un apparato stereotassica (o qualsiasi soluzione di manipolazione con precisione submillimeter) dotato di un microinjector. Collocare il supporto puntale sopra il microinjector e applicare la miscela di seta/AAV dal basso.
      Nota: Questo è perché le applicazioni di grandi volumi dall'alto ha provocato seta/AAV che non si è limitato alla punta. Tuttavia, l'applicazione di molti piccoli volumi sequenziali dall'alto o basso può produrre depositi AAV/seta che sono confinati alla punta (anche se noi preferiamo applicare dal basso).
   5. Tirare una pipetta di iniezione intracranica standard da vetro borosilicato capillare.
      1. Per renderlo più facile da
      2. Per produrre una punta di iniezione con una punta piana e pulita del diametro desiderato, tenere una pipetta in ogni mano e utilizzare la parte più spessa del cono su una pipetta a segnare altre pipetta nella posizione desiderata pausa.
      3. Strofinare delicatamente avanti e indietro in un movimento della sega (il metodo segnante il vetro).
      4. Dopo aver segnato la pipetta, applicare una leggera pressione alla punta della pipetta ha ottenuta con il corpo di altri pipetta per ottenere un taglio netto.
   6. Posizionare uno stereoscopio per dare una visione chiara delle facce fibra ottica.
      Nota: Ingrandimento dovrebbe essere sufficiente per posizionare con precisione la pipetta di iniezione sopra il volto di fibre ottiche.
   7. Inserire gli impianti della fibra nel supporto con il cervello-lato della fibra ottica rivolta verso il basso.
   8. Caricare la pipetta di iniezione con soluzione di seta/AAV, come per qualsiasi iniezione intracranica standard⁵. Caricare l'importo richiesto per il numero di impianti effettuati, più ~ 30% extra per ospitare le perdite dovute a Pipette intasamento. Ad esempio, se si fanno 10 impianti, quindi caricare con 100 nL depositi e prelevare ~1.3 µ l.
      Nota: Seta/AAV può asciugare presso la punta della pipetta tra espulsioni, che possono ostruire la pipetta. Pipette di grande diametro (50-100 µm) sono meno probabilità di intasare. Zoccoli possono essere sloggiati spazzolandolo giù la punta della pipetta con un tampone di carta bagnata wipe o alcool.
   9. Manovrare la pipetta di iniezione fino a quando è toccare o toccare quasi al centro della superficie della fibra ottica. Espulsione del 10-20 nL di seta/AAV soluzione. Ritirare la pipetta.
      Nota: Il tasso di consegna non è critico, ma i tassi tipici sono di 5-20 nL/s.
   10. Osservare il bolo di seta/AAV sulla superficie piana che appare come una cupola di liquida che si asciuga per una pellicola piana all'interno di ~ 1 min (Figura 1B).
   11. Ripetere i passaggi 4.1.9-4.1.10 fino a quando la quantità desiderata di seta/AAV è depositato (un totale di 20-200 nL per la maggior parte delle applicazioni). Durante la preparazione impianti multipli, applicare seta/AAV per un impianto e poi passare a ricoprire altri impianti prima di tornare al primo.
   12. Consentire 1 h per l'asciugatura prima di spostare gli impianti.
   13. Essiccare sottovuoto pernottamento a ~ 125 Torr (-25 a. Hg), 4 ° C. Farlo inserendo il titolare puntale intero in una camera a vuoto.
   14. Valutare la forma e la posizione del film seta risultante sotto un microscopio ad alta potenza. Garantire che i film sono confinati alla punta della fibra ottica superficie, essere relativamente sottile (> 100 µm) e simmetrica (Figura 1).
       Nota: Asimmetrici o grandi pellicole di seta/AAV possono sloggiare dalla fibra durante l'impianto (Figura 1). La causa più comune dei problemi nasce dall'applicazione di singole grandi volumi anziché l'applicazione sequenza di molti piccoli volumi.
2. Rivestimento conico fibre ottiche per espressione di unità lungo l'asse della fibra
   1. Ottenere gli impianti conici fibra ottica ed eseguire passaggi 4.1.2-4.1.8, tranne per il fatto che la fibra conica è posizionata lateralmente, tale che è perpendicolare all'iniettore (Figura 2A). Posizionare l'iniettore sopra la fibra conica.
      Nota: Goccioline di liquide sul pose fibre conici di carico aggiunto sfide, perché la tensione superficiale tende a causare le goccioline saltare indietro sulla pipetta iniezione o migrare fino la fibra conica. Pipette di iniezione più piccoli (30-50 micron di diametro) aiutano a superare questo problema ma aumenta il rischio che si intasa la pipetta di iniezione. A causa della tensione superficiale, goccioline tendono ad aderire all'area della superficie più grande, quindi l'iniezione ottima Pipettare dimensione è dipende dalla dimensione della fibra conico e la tolleranza per l'impedimento occasionale.
   2. Posizionare la pipetta di seta/AAV iniezione contro il lato della fibra ottica all'inizio del cono. Assicurarsi che la pipetta di iniezione sta toccando la fibra ottica.
   3. Espellere 20 nL di seta/AAV per avviare il processo di rivestimento. Assicurarsi che la gocciolina aderisce alla fibra ottica e rimane a livello di interfaccia della fibra/pipetta. Stoppino delicatamente la gocciolina verso la fine della punta della fibra come la seta/AAV asciuga (~ 45 s). Tenere la pipetta d'iniezione a contatto con la goccia di essiccazione per evitare l'intasamento il puntale della pipetta.
      Nota: Ogni deposito deve rivestire circa 400 µm della fibra conico (Figura 2B).
   4. Quando il primo bolo è quasi completamente asciutto, espellere un altro 20 nL e continuare la goccia lungo il cono di wicking.
      Nota: La seta liquida aderirà alla seta secco, ancoraggio a un'estremità della goccia come la pipetta si muove lungo il cono.
   5. Ripetere il passaggio 4.2.4 espulsione di piccole quantità di seta/AAV, e disegnando gradualmente la soluzione fino al lato del cono. espulsioni di 5-6 sono sufficienti per attraversare la superficie di un cono di 2,5 mm.
   6. Per guidare più espressione uniforme su tutti i lati della fibra, ruotare la fibra e ripetere i passaggi 4.2.2-4.2.5 fino a quando la quantità desiderata di seta/AAV è stata depositata.
   7. Se un appeso filo di seta/AAV secchi si estende oltre la punta della fibra, attentamente tagliata il filo con le forbici, o usare la pipetta di espulsione per piegare il filo indietro e farlo aderire alla rastremazione della fibra.
   8. Consentire 1 h per l'asciugatura prima di spostare gli impianti.
   9. Essiccare sottovuoto overnight a 4 ° C. Titolare del puntale intero possa essere inserito in una camera a vuoto.
   10. Valutare la forma e la posizione del film seta risultante sotto un microscopio ad alta potenza.
       Nota: Il film non deve essere completamente uniforme ma non dovrebbe avere urti che si estendono oltre 100 µm oltre la superficie della fibra per minimizzare i danni ai tessuti circostanti durante l'impianto (Figura 3). Per ridurre le dimensioni della pellicola, è fondamentale che ogni goccia sia completamente asciutto prima che i depositi successivi vengano apportati.
3. Gli impianti di lente GRIN rivestimento
   1. Ottenere smorfia lenti^6,7 e ripetere i passi 4.1.2-4.1.8. L'iniettore può essere montato sopra.
   2. Cassetta di seta/AAV in una singola espulsione (1 µ l per una lente di diametro 1,0 mm).
      Nota: Questo consente di ottenere una cupola di liquido che aderisce alla faccia della lente e si asciuga per produrre una pellicola uniforme (100-200 µm di spessore). Tuttavia, nel caso in cui una singola espulsione di grandi dimensioni si asciuga in modo non uniforme e produce un film che è più spesso vicino ai bordi della lente GRIN, prova del deposito più più piccole goccioline (100-200 nL) nel centro della superficie della lente (consentendo ogni gocciolina asciugare prima di depositare il prossimo) per garantire che il film guidare espressione al centro del campo visivo.
   3. Consentire 1 h per l'asciugatura prima di spostare gli impianti.
   4. Valutare la forma e la posizione del film seta risultante sotto un microscopio ad alta potenza per garantire che il film copre la superficie della lente.
4. Rivestimento di vetro cranica windows
   1. Preparare il vetro windows cranica di diametro 3 mm due aderente turno coprioggetti (n ° 1 di spessore) a una finestra di diametro 5 mm con adesivo ottico (per informazioni dettagliate, vedere Goldey et al 2014⁸).
   2. Mescolare la seta: virus in un rapporto di 1:4 per ridurre la quantità totale di seta nel film. Quantità eccessive di seta non si dissolvono sotto windows cranica dopo l'impianto. Esperimenti di titolazione possono essere necessaria per determinare il rapporto e il volume che dà il profilo desiderato espressione.
   3. Mano una pipetta una goccia di 5 µ l sulla superficie del coprivetrino 3mm (verso il cervello). La goccia dovrebbe stendere per coprire la superficie di vetro intero (Figura 3).
   4. Consentire 2-3 h per l'asciugatura prima di passare a windows.

5. come conservare innesti seta/AAV-rivestiti

1. Negozio di seta/AAV-rivestito di fibre ottiche in un essiccatore sotto vuoto raffreddato (~ 125 Torr, 4 ° C) prima dell'uso (Figura 4A).
2. Non conservare windows cranica e lenti GRIN sotto vuoto, come grandi pellicole seta memorizzati sotto vuoto non riescono a sciogliere completamente dopo l'impianto. Windows cranica e smorfia lenti dell'impianto subito dopo l'asciugatura, o entro un giorno di fabbricazione se conservati a pressione atmosferica e a 4 ° C.

6. l'impianto di dispositivi

1. Preparare gli animali per la chirurgia implantare come descritto in precedenza⁴.
   1. Brevemente, anestetizzare topi con un'iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina (100/10 mg/kg) e controllare la profondità dell'anestesia utilizzando un pizzico di punta delicato. Rasatura del cranio nella zona dell'impianto e pulire il cuoio capelluto con iodio e alcool.
   2. Montare gli animali in un dispositivo stereotassica e integrare l'anestesia usando una miscela di ossigeno e isoflurano (1-2%). Fare un'incisione nel cuoio capelluto sopra l'area di interesse ed eseguire una craniotomia sufficientemente ampia per accogliere l'impianto.
2. Impianto di lenti⁹ e del microendoscope del fibre ottiche¹⁰ secondo procedure pubblicate in precedenza. Gestire gli impianti con cura, come il deposito di seta/AAV può essere buttato giù da una craniotomia imperfetta, o dall'impianto di cattura sul bordo del cranio. Abbassare lentamente l'impianto nel cervello (~ 2 mm/min).
3. Impianto cranica windows come descritto in precedenza⁸. Non toccare il lato patinato della finestra ed evitare la finestra con il liquido di risciacquo se eseguendo "gavage", come questo può lavare via il virus. Per raggiungere la massima espressione, eseguire un durotomy.

7. valutazione dell'espressione e risoluzione dei problemi

1. Per valutare l'espressione delle proteine espresse viralmente, consentire ~ 2-3 settimane per il virus guidare l'espressione, quindi eseguire perfusione intracardiaca con paraformaldeide al 4% in fosfato tampone del tessuto di cervello¹¹ e processo di soluzione salina per fluorescente la microscopia¹².
2. Valutare l'espressione tramite microscopia fluorescente per il modello di espressione delle proteine optogenetica fluorophore-tag di immagine.
3. Se il livello di espressione è insufficiente, aumentare la quantità di virus nei rivestimenti aumentando il volume totale del rivestimento seta/AAV, o preferibilmente utilizzando un virus titolo superiore.

Risultati

Per valutare il successo delle pellicole di seta/AAV in espressione di guida, abbiamo irrorato animali 2-3 settimane dopo l'impianto e preparato fette del cervello dalla regione di interesse. Immagini di fluorescenza del fluoroforo-etichetta optogenetica proteine (ChR2-YFP) fornirono una misura del grado di espressione (Figura 1). Fibre ottiche tipiche (230 µm di diametro) può facilmente ospitare 200 nL di seta/AAV. Con la pratica, gli sperimentatori posson...

Discussione

L'uso di seta/AAV per indirizzare l'espressione delle proteine optogentic supera i limiti degli approcci che sono attualmente in uso. Anche se molti studi correttamente utilizzano iniezioni di AAV per esprimere proteine optogenetica, è difficile da allineare espressione fino alla punta delle fibre ottiche, alle regioni intorno alla lunghezza delle fibre conici e nella regione di visualizzazione di una lente GRIN. A causa di disallineamento tra componenti ottici ed espressione optogenetica, iniezioni stereotassiche posso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.