在 vivosilk/aav 薄膜在光基因表达中的靶向表达

摘要

在这里, 我们提出了一种方法, 提供病毒表达载体到大脑使用丝素薄膜。这种方法允许使用 silk/aav 涂层光纤、锥形光纤和颅窗定向表达向量的传递。

摘要

最近开发的用于操纵和监测神经元体内活动的光学方法极大地帮助了人们了解神经回路如何处理信息以驱动行为输出. 这些类型的实验依赖于两个主要组成部分: 1) 提供对大脑的光学访问的植入设备, 以及 2) 改变神经元兴奋性或提供神经元活动读数的感光蛋白。表达感光蛋白的方法有很多种, 但立体定向注入病毒载体是目前最灵活的方法, 因为表达可以通过遗传、解剖和时间精度来控制。尽管病毒载体的效用很大, 但将病毒传递到光学植入物的位置带来了许多挑战。立体定向病毒注射要求手术增加手术时间, 增加学习费用, 并对动物的健康构成威胁。注射注射器和高滴度病毒突然释放引起的免疫原性炎症会对周围组织造成物理损伤。当针对大脑深处的小区域时, 将注射与光学植入物对齐是特别困难的。为了克服这些挑战, 我们描述了一种用丝素和腺苷相关病毒 (aav) 载体组成的薄膜涂层多种类型光学植入物的方法。纤维蛋白是一种从蚕豆茧中提取的聚合物, 可以封装和保护生物分子, 并可加工成从可溶性薄膜到陶瓷的各种形式。当植入大脑时, silk/aav 涂层会在光学元件与周围大脑之间的界面释放病毒, 准确地将表达推向需要的地方。该方法易于实现, 有望极大地促进神经电路功能的体内研究。

引言

在过去的十年中产生了用于监测和操作神经活动的工程光敏蛋白^的爆炸。病毒为在大脑中表达这些光遗传工具提供了无与伦比的灵活性。与转基因动物相比, 病毒更容易产生、运输和储存, 从而可以快速实施最新的光遗传学工具。表达可以遗传上针对不同的神经元群, 而为逆行运输而设计的病毒甚至可以用于基于神经元连接2的表达目标^.

病毒通常是通过立体定向注射引入的, 这可能既耗时又具有挑战性。精确定位小区域可能会很困难, 而在广阔的区域内推动表达通常需要多次注射。此外, 当一个光学设备随后植入大脑, 在体内提供光, 植入物必须与病毒注射适当对齐。在这里, 我们描述了一种易于实现的方法, 用于使用丝素薄膜3将病毒载体传递给植入设备周围的组织。丝素是市售的, 神经组织耐受性良好, 可用于生产具有不同性能的材料。丝膜可应用于植入物, 使用常见的实验室设备, 如微注射移液器或手移液器。silk/aav 薄膜消除了对两个外科手术的要求, 并确保病毒介导的表达与光学植入物正确对齐。由此产生的表达被限制在纤维的尖端, 并导致较少不需要的表达沿纤维轨道比立体定向注射。

除了在小纤维尖端产生有针对性的表达外, silk/aav 薄膜还可用于驱动颅窗下广泛的 (和 gt;3 毫米直径) 皮质表达。荧光活性传感器的体内 2-光子成像已成为评价神经元活动在驱动感官和认知处理中的作用的不可或缺的工具。然而, 为了推动在广泛的皮质区域的均匀表达, 实验者经常进行多次注射。这些注射可能非常耗时, 并可能导致整个视野中的表达不一致。相比之下, 硅/aav 涂层的颅窗极易制造, 大大减少了手术所需的时间, 最引人注目的是推动在皮质表面以下的数百微米的表达。

研究方案

所有涉及动物的实验都是按照哈佛动物护理常设委员会批准的协议按照美国国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中所述的准则进行的。所有实验均采用成年 c57bl6-男女 (6-15周) 小鼠。

1. 获得水丝纤维蛋白

1. 准备或购买含水丝素 (5-7.5% wv)。

2. 将水丝与 aav 表达载体混合

1. 选择 aav 表达载体来驱动光基因蛋白或荧光指示器的选择。
   注意: 为了最大限度地减少在仍然驱动鲁棒表达式的同时必须应用于植入物的 silk/aav 的体积, 建议将股票滴度 aav (通常从矢量核心获得的股票滴度约为 1013 gc/ml)。
2. 在涂膜植入物之前, 解冻 aav 的脂肪, 并与5-7.5% 的水丝素 (这种混合物将被称为 silk/aav) 结合。在应用前的 200μl pcr 管中, 将水纤维蛋白和 aav 混合在1:1 的比例中 (对于颅内窗户使用 1:1)。轻轻移液溶液进出多次, 将纤维蛋白和 aav 彻底混合。
3. 使用前, 请将丝绸-aav 混合物放在冰上。

3. 硅-aav 涂层设备的制造和储存准备设备

1. 用于镀膜光纤和梯度指数 (grin) 镜片的采购设备 (图 1, 2)。
   1. 构造一个稳定的铁轨支架。要保持陶瓷铁艺, 钻1.25 毫米孔块的-"片丙烯酸。点击孔, 从侧面插入固定螺钉, 以保持铁轨的位置。
      请注意:任何夹具都可以用于此目的。
   2. 定位具有亚毫米精度的机械手来移动光纤 (立体定向器或其他精密微机械手)。
   3. 组装一个稳定的支架来定位微喷射器。
   4. 使用立体显微镜可视化光纤和丝液滴。
   5. 定位光源以照亮光纤。
2. 准备涂装颅窗的设备 (图 3)。
   1. 选择任何 p10 移液器。
   2. 获取带盖子的容器。
      注: 建议使用任何带有硅胶底部的容器-柔软的底部便于提升颅骨窗户。
3. 准备储存成品植入物的设备 (图 4)。
   1. 获得一个小 (1-5 l) 真空室。
   2. 确保在4°c 的冰箱中有存放植入物的空间。

4. 将 silk/aav 薄膜应用于设备

1. 在光纤尖端涂覆光纤以驱动焦点表达
   1. 如前面所述, 准备慢性纤维植入物4。
   2. 使用前, 用乙醇冲洗植入物, 然后用超纯水冲洗, 以确保光纤清洁。
      注: 丝绸薄膜更可靠地粘附在清洁玻璃表面上。
   3. 准备一个设备来保存光纤铁轨。对于典型的 1.25 mm 直径的铁轨, 使用块-英寸透明丙烯酸, 约1.3 毫米孔, 并点击固定螺丝从一侧进入孔植入物牢固地到位 (图 1a)。
   4. 将套圈支架安装在配备微喷射器的立体定向装置 (或任何具有亚毫米精度的操作溶液) 中。将发酵罐支架放在微喷射器上方, 并从下面应用 silk/aav 混合物。
      注意: 这是因为来自上面的大量应用导致了不限于尖端的丝绸 aav。然而, 从上面或下面的许多小的连续体积的应用可以产生 aav/s猴存款, 仅限于尖端 (虽然我们更喜欢从下面申请)。
   5. 从硼硅酸盐玻璃毛细管中提取标准的颅内注射移液器。
      1. 为了更容易
      2. 要生产具有所需直径的干净平尖的注射头, 请在每只手部握住一个移液器, 然后在一个移液器上使用锥形的较厚部分在所需的断开位置对另一个移液器进行评分。
      3. 在锯切运动中轻轻摩擦 (玻璃上的玻璃评分方法)。
      4. 在给移液器打分后, 用另一个移液器的身体对计分的移液器尖端施加温和的压力, 以实现干净的休息。
   6. 定位立体示波器, 以清晰地观察光纤面。
      注: 放大应足以准确定位注射移液器以上的光纤表面。
   7. 将光纤植入物插入支架, 将光纤的脑侧朝下。
   8. 加载注射移液器与丝绸 aav 溶液, 如任何标准颅内注射⁵。加载所需的数量所需的植入物, 加上约30% 的额外, 以适应由于移液器堵塞造成的损失。例如, 如果要进行10个植入物, 则用 100 nl 沉积加载并提取 ~ 1.3μl。
      注: silk/aav 可在喷射器尖端之间干燥, 这可能会堵塞移液器。大直径移液器 (50-100μm) 堵塞的可能性较小。用湿纸擦拭或酒精擦拭轻轻地刷下移液器的尖端, 可以将夹子脱落。
   9. 操纵注射移液器, 直到它接触或接近接触光纤表面的中心。推出10-20 升的丝绸 aav 溶液。拔出移液器。
      注: 交付率并不重要, 但典型的交付率为 5-20 nL/s。
   10. 观察平面上的丝绸 aav 的波珠, 平面上呈液体圆顶, 在 ~ 1分钟内干燥成扁平的薄膜(图 1 b)。
   11. 重复步骤 4.1.9-4.1.10, 直到沉积所需数量的丝绸 aav (大多数应用的总数量为 20-200 nl)。在准备多个植入物时, 将 silk/aav 应用到一个植入物上, 然后继续覆盖其他植入物, 然后返回第一个植入物。
   12. 在移动植入物之前, 允许1小时的干燥时间。
   13. 真空干燥过夜在 ~ 125 torr (-25 英寸。汞), 4°c。为此, 请将整个铁座支架放入真空室。
   14. 在大功率显微镜下评估生成的丝膜的形状和位置。确保薄膜限制在光纤表面的尖端, 相对较薄 (& gt;100 微米), 并对称 (图 1c)。
       注: 大型或非对称的丝绸/aav 薄膜在植入过程中可能会从纤维中移出 (图 1d)。问题最常见的原因来自于单个大容量的应用, 而不是许多小卷的顺序应用。
2. 镀膜锥形光纤, 以推动沿光纤轴的表达
   1. 获得锥形光纤植入物并执行4.1.2 的步骤-4.1.8, 只是锥形光纤的定位是横向的, 使其垂直于注射器 (图 2a)。将喷油器放置在锥形纤维上方。
      注意: 将液滴加载到锥形纤维上会带来额外的挑战, 因为表面张力往往会导致液滴跳回注射移液器或迁移锥形纤维。较小的注射移液器 (直径 30-50μm) 有助于克服这一问题, 但增加了注射移液器堵塞的风险。由于表面张力, 液滴倾向于粘附在最大表面积的区域, 因此最佳的注射移液器尺寸取决于锥形纤维的大小和对偶尔堵塞的耐受性。
   2. 将 silk/AAV 注射移液器放置在锥形的开头, 并将其放在光纤的一侧。确保注射移液器接触的是光纤。
   3. 发射20升的丝绸 aav 开始涂装工艺。确保液滴粘附在光纤上, 并保持在光纤的界面上。当丝绸-aav 干燥 (~ 45秒) 时, 轻轻将液滴指向纤维尖端的末端。保持注射移液器与干燥液滴接触, 以避免堵塞移液器尖端。
      注: 每个矿床应覆盖约400μm 的锥形纤维 (图 2b)。
   4. 当第一个小球几乎完全干燥后, 再弹出 20 nl, 继续沿着锥度抽吸液滴。
      注意: 液体丝将粘附在干燥的丝绸上, 当移液器沿着锥度移动时, 将液滴的一端锚定。
   5. 重复步骤 4.2.4, 喷射少量的丝绸 aav, 并逐渐将溶液拉上锥度的一侧。5-6 喷射量足以穿过 2.5 mm 锥度的表面。
   6. 为了在光纤的所有方面推动更均匀的表达, 旋转光纤并重复步骤 4.2.2-4.2.5, 直到沉积了所需数量的丝绸 aav。
   7. 如果一根悬挂的干丝绸/aav 链超出了纤维尖端, 用剪刀小心地切割钢绞线, 或者使用弹射移液器将钢绞线向后弯曲, 并将其粘附在纤维的锥形上。
   8. 在移动植入物之前, 允许1小时的干燥时间。
   9. 在4°c 内真空干燥过夜。整个套圈支架可放置在真空室中。
   10. 在大功率显微镜下评估生成的丝膜的形状和位置。
       注意: 薄膜不需要完全均匀, 但不应具有超过100μm 的凸起, 以最大限度地减少植入过程中对周围组织的损害 (图 3c)。为了最大限度地缩小薄膜尺寸, 在随后的沉积之前, 每个液滴必须完全干燥。
3. 涂层 grin 晶状体植入物
   1. 获取 grin^{镜头6、7 和}重复步骤 4.1.2-4.1.8。喷油器可以安装在上面。
   2. 将 silk/aav 沉积在一次弹射中 (1.0 mm 直径镜头为 1μl)。
      注意: 这将产生一个粘附在镜片表面的液体圆顶, 并干燥产生均匀的薄膜 (10-200μm 厚)。但是, 如果单个大型弹射干燥不均匀, 并产生在 grin 镜头边缘附近较厚的薄膜, 请尝试在镜头表面中心沉积多个较小的液滴 (100-200 nl) (允许每个液滴在沉积前干燥下一步), 以确保电影将驱动表达在视野的中心。
   3. 在移动植入物之前, 允许1小时的干燥时间。
   4. 在大功率显微镜下评估所产生的丝膜的形状和位置, 以确保薄膜覆盖镜头表面。
4. 镀膜玻璃颅骨窗
   1. 准备玻璃起重机窗口, 通过粘贴两个直径为3毫米的圆形盖板 (不1厚度) 到一个5毫米直径的窗口与光学胶粘剂 (详情见 goldey等人, 2014⁸)。
   2. 混合丝绸: 病毒的比例为 1:4, 以减少薄膜中的丝绸总量。植入后, 过多的丝绸不会溶解在颅窗下。可能需要进行滴定实验, 以确定给出所需表达式轮廓的比率和体积。
   3. 手移液器5μl 液滴到3毫米 (面向大脑) 盖板的表面。液滴应展开, 以覆盖整个玻璃表面 (图 3)。
   4. 在移动窗户前, 允许2-3小时的干燥。

5. 储存丝卡/aav 涂层植入物

1. 使用前将镀银 aav 涂层光纤存放在冷却真空干燥器 (~ 125 torr, 4A) 中 (图 4 a)。
2. 不要将颅窗和 grin 镜片存放在真空下, 因为在真空下储存的大型丝膜在植入后不能完全溶解。干燥后立即植入颅窗和 grin 镜片, 如果存放在大气压力和4°c 下, 则在制造后的一天内植入。

6. 植入设备

1. 准备动物植入手术如前面所述⁴。
   1. 简单地说, 麻醉小鼠腹腔内注射酮胺 (100/10 mg/kg), 并使用温和的脚趾夹紧检查麻醉深度。将头骨在植入物区域中, 用碘和酒精清洁头皮。
   2. 将动物安装在立体定向装置中, 并使用氧气和异氟醚的混合物补充麻醉 (1-2%)。在感兴趣的区域上的头皮上做一个切口, 并进行足够大的开颅手术, 以容纳植入物。
2. 植入光纤⁹和微内窥镜镜片¹⁰根据以前公布的程序。小心处理植入物, 因为丝绸-aav 沉积可以被一个不完美的开颅术, 或植入物捕捉到头骨边缘。慢慢降低植入物进入大脑 (约 2mm/min)。
3. 植入颅骨窗口如以前^描述8。不要触摸窗户的涂层一侧, 如果进行灌胃, 避免用液体冲洗窗户, 因为这可能会冲走病毒。为了达到最大的表达, 进行一次双体切除术。

7. 评估表达式和故障排除

1. 为了评估病毒表达蛋白的表达, 让病毒在2-3周内推动表达, 然后在磷酸盐缓冲盐水11中使用4% 的对苯二甲醛进行心内灌注, 并处理脑组织的荧光显微镜¹²。
2. 用荧光显微镜评价其表达, 以成像荧光标记的光发生蛋白的表达模式。
3. 如果表达水平不足, 通过增加硅/aav 涂层的总体积, 或者最好使用较高的滴度病毒, 增加涂料中的病毒量。

结果

为了评估 silk/aav 薄膜在驱动表达方面的成功, 我们在植入2-3周后对动物进行了灌注, 并从感兴趣的区域制备了大脑切片。荧光图像的氟标记的光遗传蛋白 (chr2-yfp) 提供了一个表达的程度的测量 (图 1d)。典型的光纤 (230μm 直径) 可很容易地容纳 200 nl 的丝绸 aav。通过实践, 实验者可以在植入纤维的尖端周围实现高度可靠的表达 (图 5...

讨论

使用 silk/aav 来定位光原蛋白的表达, 克服了目前正在使用的方法的局限性。尽管许多研究成功地使用 aav 注射来表达光基因蛋白, 但将表达与光纤尖端、锥形纤维长度周围的区域以及 grin 透镜的观察区域对齐是很有挑战性的。由于光学元件和光遗传表达之间的错位, 立体定向注入可能不可靠, 许多实验失败。我们这里描述的 silk/aav 标签方法解决了这个问题。它还简化了手术程序, 消除了第二个手术?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.