Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

Özet

Burada, viral ifade vektörel çizimler ipek fibroin Filmler kullanarak beynine teslim etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem ifade vektörel çizimler ipek/AAV kaplamalı optik lifler, konik optik lifler ve kafatası windows kullanarak hedeflenen teslimini sağlar.

Özet

Ne kadar sinir devreleri işlem bilgileri sürücü davranış çıkış amacıyla büyük ölçüde işleme ve nöronlar içinde vivoetkinliğini izleme için son zamanlarda geliştirilen optik yöntemlerle destekli anlamak için arayışı. Bu tür deneyler iki ana bileşenleri üzerinde bağlıdır: beynin optik erişim sağlamak 1) implante edilebilir cihazların ve nöronal uyarılabilirlik değiştirmek veya bir okuma nöronal aktivitenin sağlayabilirsiniz 2) ışığa duyarlı proteinlerdir. Işığa duyarlı proteinler hızlı yolları vardır, ancak ifade, anatomik, genetik ve zamansal hassasiyetle kontrol edilebilir çünkü viral vektörler stereotaksik enjeksiyon şu anda en esnek yaklaşım. Viral vektörler büyük yarar rağmen virüs sayısız sorunlar optik implantlar pozlar siteye teslim. Stereotaksik virüs enjeksiyonları cerrahi süresini artırmak, çalışmaları maliyetini artırmak ve hayvan sağlığı için riski ameliyatları talep ediyorlar. Çevreleyen doku fiziksel olarak enjeksiyon şırınga ve immünojenik iltihap yüksek titresi virüs bolus ani teslim tarafından neden olduğu zarar görebilir. Enjeksiyonları optik implantlar ile hizalama zor özellikle küçük bölgeleri hedeflerken beynin derinliklerinde. Bu zorlukları aşmak için birden çok türü Filmler Adeno ilişkili viral (AAV) vektörel çizimler ve ipek fibroin oluşan optik implantlarda kaplama yöntemi açıklanmaktadır. Fibroin, Bombiks mori, koza türetilmiş bir polimer Kapsüller ve biomolecules korumak ve çözünür filmlerden seramik için değişen formları içine işlenebilir. Beyne ipek/AAV kaplamalar tam olarak gerektiğinde ifade sürüş arabirimi optik elemanları ve çevresindeki beyin arasında virüs serbest. Bu yöntem kolayca uygulanır ve in vivo çalışmalar nöral devre fonksiyonunun büyük kolaylaştırmak vaat ediyor.

Giriş

Son on yıl için izleme ve sinirsel aktivite¹manipüle mühendislik ışığa duyarlı proteinlerin bir patlama üretti. Virüsler bu optogenetic araçlar beyinde ifade etmek için benzersiz esneklik sunar. Transjenik hayvanlar için karşılaştırıldığında, virüs üretmek, ulaşım ve mağaza, en yeni optogenetic araçların hızlı uygulama izin için daha kolay. İfade için farklı nöron popülasyonları genetik olarak yönlendirilebilir ve retrograd taşıma için tasarlanmış virüs bile nöronal bağlantı²dayalı ifade hedeflemek için kullanılır.

Virüsler genellikle zaman alıcı ve zor olabilir stereotaksik enjeksiyonları ile tanıtılmaktadır. Tam olarak küçük bölgeleri hedefleme-ebilmek var olmak zor, ifade kez geniş alanlar üzerinde sürüş birçok enjeksiyonları gerekirken. Bir optik cihaz daha sonra hafif vivo içindeteslim etmek için beynine yerleştirilmiş iken, Ayrıca, İmplantın doğru viral enjeksiyon ile hizalı gerekir. Burada, kolayca uygulanabilir bir yöntem viral vektörler ipek fibroin Filmler³kullanarak bir implant cihaz etrafında doku teslim etmek için açıklamak. İpek fibroin piyasada bulunan, nöral dokular tarafından iyi tolere ve çeşitli özellikleri ile malzeme üretmek için kullanılabilir. İpek filmleri ya da mikroenjeksiyon Pipetler gibi ortak labaratuar donanımları kullanarak implantlar için uygulanan Pipetler el. İpek/AAV filmleri iki cerrahi işlemler gereksinimini ortadan kaldırmak ve virüs-aracılı ifade düzgün optik implant uyumlu olun. Sonuçta elde edilen ifade lifleri ve lif parça daha az istenmeyen ifadeye stereotaksik enjeksiyonları daha sonuçlarında ucuna sınırlıdır.

Hedeflenen ifade ucundaki küçük liflerinin üreten ek olarak, ipek/AAV filmleri yaygın sürücü için kullanılabilir (> 3 mm çapında) kafatası windows altında kortikal ifade. İn vivo 2-Foton görüntüleme floresan etkinlik sensörler duyusal ve bilişsel işleme sürüş nöronal aktivite rolünün değerlendirilmesi için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Ancak, ifade geniş kortikal alanlarda Denemecileri kez üzerinde üniforma sürücü için birden fazla enjeksiyonları gerçekleştirin. Bu iğneleri son derece zaman alıcı olabilir ve tutarsız ifade görüş alanı açabilir. Buna ek olarak, kafatası windows ipek/AAV-ceket imalatı, büyük ölçüde ameliyatları için gereken süreyi azaltmak ve en dikkat çekici ifade yüz mikron kortikal yüzeyinin altında sürücü son derece kolaydır.

Protokol

Tüm Deney hayvanları içeren Harvard daimi Komitesi aşağıdaki yönergeleri bize NIH bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım kılavuzu' nda tanımlanan hayvan bakımı üzerinde tarafından onaylanmış protokoller uyarınca gerçekleştirilmiştir. Yetişkin C57BL/6 fareler her iki cinsiyetten (yaş 6-15 hafta) tüm deneyler için kullanılmıştır.

1. sulu ipek Fibroin alın

1. Hazırlamak veya sulu ipek fibroin (% 5-7,5 w/v) satın alın.

2. mix AAV ifade vektörel çizimler ile sulu ipek

1. Sürücü optogenetic protein veya floresan göstergesi seçim için bir AAV ifade vektör seçin.
   Not: stok-titresi AAV (~ 10¹³ gc/mL genellikle vektör göbek elde titreleri vardır stok) hala sağlam ifade sürüş sırasında implant uygulanması gerekir ipek/AAV hacmi en aza indirmek için tavsiye edilir.
2. Kaplama implantlar, hemen önce bir aliquot AAV, çözülme ve % 5-7.5 sulu ipek fibroin (bu karışımı için ipek/AAV anılacaktır) ile birleştirir. Bir 200 µL PCR tüp içinde sulu fibroin ve AAV (kafatası windows kullanımı için 1:4) 1:1 oranında hemen önce uygulama karıştırın. Yavaşça çözüm fibroin ve AAV iyice karıştırmak için girip birkaç kez pipette.
3. İpek/AAV karışımı buz üzerinde kullanmak için önceden tutun.

3. ekipman imalat ve ipek/AAV-kaplı aygıt Muhafazası için hazırlayın

1. Ekipman temin etmek kaplama optik elyaf ve gradyan-Index (ECE) lensler (rakamlar 1, 2).
   1. Bir kararlı yüksük tutucu oluşturmak. Seramik halkalar tutmak için 1,25 mm ¼" sayfası akrilik bloğunu delik. Set vida halkalar tutmak için yan eklemek için delik dokunun.
      Not: Herhangi bir kelepçe bu amaç için kullanılabilir.
   2. Bir manipülatör optik fiberler (stereotaksik cihazlar veya diğer hassas micromanipulator) taşımak için alt milimetre hassasiyetle getirin.
   3. Microinjector konumlandırmak için istikrarlı bir tutucu bir araya getirin.
   4. Bir stereoscope optik lifler ve ipek damlacık görselleştirmek için kullanın.
   5. Optik lifler aydınlatmak için ışık kaynağı getirin.
2. Kafatası windows (şekil 3) kaplama için donatım hazırlayın.
   1. Herhangi bir P10 pipettor seçin.
   2. Bir konteyner kapak ile elde edilir.
      Not: Herhangi bir kapsayıcı bir silikon alt ile önerilir — yumuşak alt kranial Windows'u kaldırma kolaylaştırır.
3. Ekipman bitmiş implantları (şekil 4) depolamak için hazırlayın.
   1. Bir küçük (1-5 L) vakum odası edinin.
   2. 4 ° C buzdolabında saklamak için alan implantlar olduğundan emin olun.

4. ipek/AAV Film aygıtlara uygular

1. Sürücü odak ifade fiber uç optik elyaf kaplama
   1. Kronik fiber implantlar yukarıda açıklanan⁴hazırlayın.
   2. Kullanım önce durulama ile etanol implantlar sonra ultrasaf su ile sağlamak için optik lifler temizdir.
      Not: İpek filmleri daha güvenilir bir şekilde cam yüzeyleri temizlemek için uygun.
   3. Fiber halkalar tutmak için bir cihazını hazırlayın. Tipik 1,25 mm çaplı halkalar için kullanmak bir blok ¼ inch ~1.3 ile açık akrilik mm delikler ve set vida kenardan delik implantlar sıkıca yerinde (şekil 1A) girerek vurdu.
   4. Stereotaksik aparatı (veya submillimeter hassas işleme çözümü) yüksük yuvasına bir microinjector ile donatılmış monte edin. Yer microinjector yukarıda yüksük tutucu ve ipek/AAV karışımı aşağıdan uygulayın.
      Not: yukarıda geniş hacimli uygulamalar için belgili tanımlık uç kısıtlı değildi ipek/AAV sonuçlandı olmasıdır. Ancak, birçok küçük sıralı birim yukarıda veya aşağıda uygulanması (biz aşağıdan uygulamak tercih rağmen) ucuna kadar cezalısınız AAV/ipek mevduat üretebilir.
   5. Bir çift kafa içi enjeksiyon pipet borosilikat camdan kapiller çek.
      1. Kolay hale getirmek için
      2. Bir iğne ucu ile istenilen çap temiz düz bir ucu üretmek için bir pipet her elinde tutmak ve konik kalın bölümü üzerinde bir pipet diğer pipet istenen mola yerinde puanı için kullanın.
      3. Hafifçe ileri geri bir testere hareket (cam üzerinde puanlama yöntemi) ovalayın.
      4. Pipet puanlama sonra temiz bir mola elde etmek için diğer pipet gövdesi ile attı pipet ucu hafif basınç uygulayın.
   6. Fiber optik yüzleri net bir görünüm vermek için bir stereoscope getirin.
      Not: Büyütme optik lifler yüzü yukarıda enjeksiyon pipet doğru pozisyon için yeterli olmalıdır.
   7. Tutucu beyin yüzü aşağı bakacak şekilde fiber optik fiber implantlar takın.
   8. Enjeksiyon pipet ile herhangi bir standart kafa içi enjeksiyon⁵gelince ipek/AAV çözüm yükleyin. Ayrıca ~ %30 Pipetler tıkanma nedeniyle kayıpları karşılamak için ilave yaptım implantlar sayısı için gerekli miktar yük. Örneğin, 10 implantları yapılırsa, o zaman 100 nL mevduat ile yük ve ~1.3 µL çekilme.
      Not: İpek/AAV pipet ucu pipet yapışmasına neden olabilir atılanlar arasında kuru. Büyük çaplı Pipetler (50-100 µm) daha az zarar olasılığı. Takunya bir ıslak kağıt mendil ya da alkol bez ile pipet ucu aşağı hafif fırçalayarak yerinden.
   9. Dokunmadan veya neredeyse dokunmadan fiber optik yüzeyi ortasına kadar enjeksiyon pipet manevra. 10-20 nL ipek/AAV çözüm çıkarma. Pipet geri alıyorum.
      Not: Teslimat oranı kritik değildir, ancak tipik oranları 5-20 nL/s vardır.
   10. İpek/AAV ~ 1 dk içinde düz bir film için kurur bir sıvı kubbe olarak görünen düz yüzeye bolus gözlemlemek (şekil 1B).
   11. İpek/AAV istenilen miktarda kadar adımları 4.1.9-4.1.10 yatırılır (20-200 nL çoğu uygulama için toplam) yineleyin. Birden çok implantlar hazırlanırken, ipek/AAV bir implant uygulamak ve ardından dönmeden önce diğer implantlar kat hareket ilk.
   12. 1 h implantlar taşımadan önce kurutma için izin.
   13. Vakum desiccate gecede, ~ 125 Torr (içinde -25. HG), 4 ° C. Bunu tüm yüksük tutucu bir vakum odası yerleştirerek.
   14. Şekil ve yüksek güçlü bir mikroskop altında elde edilen ipek film konumunu değerlendirmek. Filmler fiber optik yüzeyi ucuna kadar cezalısınız sağlamak, nispeten ince (> 100 µm) ve simetrik (şekil 1 c).
       Not: Büyük veya asimetrik ipek/AAV Filmler implantasyonu (şekil 1 d) fiber çıkarmak. Sorunlarının en yaygın nedeni birçok küçük birimlerin sıralı uygulama yerine uygulama tek büyük miktarlar doğar.
2. Kaplama optik lifler lif eksen boyunca sürücü ifade için konik
   1. Konik fiber optik implantlar elde etmek ve enjektör (şekil 2A) dikey öyle ki konik fiber yanal konumlandırılmış dışında bu adımları 4.1.2-4.1.8, gerçekleştirin. Enjektör konik lif üzerinde konumlandırın.
      Not: yüzey gerilimi damlacıkları geri enjeksiyon pipet atlamak veya konik fiber kadar göç neden eğilimi çünkü konik lifleri pozlar üzerine sıvı damlacıkları yükleme sorunları, ekledi. Daha küçük enjeksiyon Pipetler (30-50 µm çapı) üstesinden gelmek bu problem ama enjeksiyon pipet zarar riskini artırmak için yardımcı olur. Yüzey gerilimi, nedeniyle damlacıkları en büyük yüzey alanı alan için uygun eğilimindedir, böylece optimum enjeksiyon pipet boyutu konik lif ve ara sıra takunya için kişinin tolerans boyutunu bağlıdır.
   2. Fiber optik tarafına ipek/AAV enjeksiyon pipet ucu başında yerleştirin. Enjeksiyon pipet fiber optik dokunuyor emin olun.
   3. 20 çıkarma nL ipek/AAV, kaplama işlemi başlatmak için. Damlacık fiber optik bağlı kalır ve lif/pipet arayüzü kalır emin olun. İpek/AAV kurur damlacık fiber uç sonuna doğru yavaşça fitil (~ 45 s). Enjekte etme pipet pipet ucu tıkanmasını önlemek için kurutma damlacığı ile temas halinde tutmak.
      Not: Her mevduat konik fiber (şekil 2B) yaklaşık 400 µm ceket.
   4. Ne zaman ilk bolus neredeyse tamamen kurudu, başka bir 20 çıkarma nL ve konik boyunca damlacık esneklik devam.
      Not: Sıvı ipek bir ucunu ankraj: damlacık pipet olarak konik taşır kurutulmuş ipek için uygun olacaktır.
   5. İpek/AAV küçük miktarlarda dışarı atmak ve yavaş yavaş konik üst çözüm çizim tarafından 4.2.4 arasındaki adımları yineleyin. 5-6 atılanlar 2.5 mm Konik yüzey çapraz geçiş yapmak yeterlidir.
   6. Etrafındaki tüm Tekdüzen ifade daha fiber götürmek için fiber döndürmek ve ipek/AAV istenilen miktarda yatırılır kadar adımları 4.2.2-4.2.5 tekrarlayın.
   7. Eğer, bir asılı strand kurutulmuş ipek/AAV fiber uç genişletir, dikkatle strand makasla kesmek ya fırlatma pipet strand geri katlayın ve lif konik için uygun kullanmak.
   8. 1 h implantlar taşımadan önce kurutma için izin.
   9. Vakum desiccate gecede 4 ° c Tüm yüksük tutucu bir vakum odası yerleştirilebilir.
   10. Şekil ve yüksek güçlü bir mikroskop altında elde edilen ipek film konumunu değerlendirmek.
       Not: Film tamamen tek tip olması gerekmez ancak 100'den fazla µm implantasyonu (şekil 3 c) çevresindeki doku hasarı en aza indirmek için lif yüzeyine ötesinde genişletmek diken diken olmamalıdır. Film boyutu en aza indirmek için sonraki mevduat yapılmadan önce her damlacık tamamen kuru olduğundan önemlidir.
3. Kaplama SIRITIŞ lens implantları
   1. SIRITIŞ lensler^6,7 almak ve adımları 4.1.2-4.1.8 tekrarlayın. Enjektör yukarıda monte edilebilir.
   2. İpek/AAV tek fırlatma (1.0 mm çap lens için 1 µL) havale.
      Not: Bu bir kubbe objektif yüze bağlı kalır ve (100-200 µm kalın) Tekdüzen bir film üretmek için kurur sıvı ortaya çıkarır. Tek bir büyük fırlatma düzensiz kurur ve GÜLÜMSEME objektifin kenarlarına kalın bir film üretir olay bu, ancak, birden çok daha küçük damlacıklar (100-200 nL) yatırma (izin veren yatırma önce kurumasını her damlacık lens yüzeyinde ortasına deneyin Sonraki) film görüş alanı merkezinde ifade sürücü olacaktır emin olmak için.
   3. 1 h implantlar taşımadan önce kurutma için izin.
   4. Şekil ve elde edilen ipek film film lens yüzeyini kapsar emin olmak için yüksek güçlü bir mikroskop altında konumunu değerlendirmek.
4. Kaplama cam kafatası windows
   1. Cam hazırlamak kafatası windows tarafından yapışan iki 3 mm çapında bir 5 mm çap penceresine optik yapıştırıcı ile coverslips (No 1 kalınlık) yuvarlak (ayrıntılı bilgi için bkz: Goldey vd. 2014⁸).
   2. İpek: virüs ipek film toplam miktarını azaltmak için 1:4 oranında karıştırın. Aşırı miktarda ipek kafatası windows altında implantasyon sonra geçiyoruz değil. Titrasyon deneyler oranı ve istenen ifade profil verir birim belirlemek için gerekli.
   3. El 5 µL damlacık 3 mm (beyin bakan) coverslip yüzeyinin pipette. Damlacık tüm cam yüzey (şekil 3) kapsayacak şekilde yaymak.
   4. 2-3 h windows taşımadan önce kurutma için izin.

5. ipek/AAV-kaplamalı implantlar depolama

1. İpek/AAV-kaplamalı optik lifler soğutmalı vakum desiccator (~ 125 Torr, 4 ° C) kullanılmadan önce (şekil 4A) depolar.
2. Vakum altında depolanan büyük ipek filmleri tamamen erimesi implantasyon sonra da kafatası windows ve vakum altında SIRITIŞ lensler depolamayın. Kafatası windows ve SIRITIŞ lensler hemen sonra kurutma veya atmosferik basınç ve 4 ° c depolanmış olsa üretim bir gün içinde implant

6. aygıtların yerleştirilmesi

1. Hayvanlar yukarıda açıklanan⁴implant ameliyat için hazırlayın.
   1. Kısaca, mayi ketamin/xylazine (100/10 mg/kg) enjeksiyonu ile fareler anestezi ve nazik bir ayak çimdik kullanarak anestezi derinliği kontrol edin. İmplantın alan kafatasında tıraş ve iyot ve alkol ile kafa derisi temiz.
   2. Mount hayvan stereotaksik aygıt ve oksijen ve isoflurane (% 1-2) karışımı kullanarak ek anestezi. Bir kesik kafa derisi içinde ilgi alanı yapmak ve implant kapsayacak kadar geniş bir kranyotomi gerçekleştirin.
2. Optik lifler⁹ ve microendoscope lensler daha önce yayımlanmış yordamlara göre belirleme yapılacağı¹⁰ implant. Kolu özenle, silikon ve ipek/AAV mevduat kusurlu bir kranyotomi veya kafatası kenarında yakalamak implant kapalı çaldı gibi. Protez yavaşça beyine indirin (~ 2 mm/dak).
3. Gibi daha önce⁸tarif implant kafatası windows. Pencerenin boyalı tarafındaki dokunmaya değil ve bu virüs silsin gibi sıvı içeren pencereyi sonda ile besleme, performans Eğer durulama kaçının. Maksimal ifade elde etmek için bir durotomy gerçekleştirin.

7. ifade değerlendirme ve sorun giderme

1. İfade virally-proteinlerin değerlendirmek için izin ~ 2-3 hafta için ifade sürücü, daha sonra intracardial perfüzyon ile %4 paraformaldehyde fosfat içinde gerçekleştirmek virüs arabelleğe alınmış floresan tuzlu çözüm¹¹ ve işlem beyin dokusu mikroskopi¹².
2. Ifade fluorophore öğesini optogenetic proteinlerin ifade deseninin görüntüye floresan mikroskopi kullanarak değerlendirmek.
3. İfade düzeyi yetersiz ise, ipek/AAV kaplama toplam hacmini artırarak veya tercihen kullanarak daha yüksek bir titresi virüs virüs kaplamalar içinde miktarını artırın.

Sonuçlar

İfade sürüş ipek/AAV filmleri başarısını değerlendirmek için biz hayvanlar 2-3 hafta implantasyonu sonrası derin ve bölge beyin dilim faiz hazırladı. Floresans görüntüleri (ChR2-YFP) fluorophore öğesini optogenetic proteinlerin ifade (şekil 1 d) kapsamını ölçüsü sağlanan. Tipik optik fiberler (230 µm çapı) kolayca 200 karşılamak ipek/AAV nL. Uygulama ile Denemecileri implante lifleri (şekil 5) ucu...

Tartışmalar

Ifade optogentic proteinlerin hedeflemek için ipek/AAV kullanımı geçerli olarak kullanımda olan yaklaşımlar sınırlamalar üstesinden gelir. Birçok çalışmalar başarıyla AAV enjeksiyonları optogenetic proteinler ifade etmek için kullansa da, ifade optik lifler ucu, bölgeler konik elyaf uzunluğu çevresinde ve bir SIRITIŞ lens görüş bölgenin hizalamak için meydan okuyor. Kayma optik bileşenleri ve optogenetic ifade arasında nedeniyle stereotaksik enjeksiyonları güvenilmez olabilir ve birçok den...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.