In Vivo Ciblé d’Expression des protéines Optogenetic, soie/AAV Films

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour délivrer des vecteurs d’expression virale dans le cerveau en utilisant des films de la fibroïne de soie. Cette méthode permet l’administration ciblée des vecteurs d’expression à l’aide de fibres optiques revêtues de soie/AAV, des fibres optiques effilés et windows crâniennes.

Résumé

La quête pour comprendre comment neurales circuits informations de processus afin de sortie comportementale en voiture a été grandement favorisées par récemment mis au point des méthodes optiques permettant la manipulation et le contrôle de l’activité des neurones in vivo. Ces types d’expériences s’appuient sur deux éléments principaux : 1) les implants qui fournissent l’accès optique vers le cerveau et les protéines 2) sensible à la lumière qui changent l’excitabilité neuronale ou fournissent une lecture de l’activité neuronale. Il y a plusieurs façons d’exprimer les protéines sensibles à la lumière, mais injection stéréotaxique de vecteurs viraux est actuellement l’approche plus souple parce que l’expression peut être contrôlée avec précision temporelle, anatomique et génétique. Malgré la grande utilité de vecteurs viraux, livrant le virus sur le site de poses d’implants optique relever de nombreux défis. Des injections de virus stéréotaxiques réclament des chirurgies qui augmentent le temps chirurgical, augmentent le coût des études et posent un risque pour la santé de l’animal. Les tissus avoisinants peuvent être physiquement endommagés par la seringue d’injection et immunogène inflammation provoquée par la brusque remise d’un bolus de haut-titre virus. Injections d’implants optiques d’alignement sont particulièrement difficile lorsque vous ciblez des petites régions profondément dans le cerveau. Pour surmonter ces défis, nous décrire un procédé de revêtement plusieurs types d’implants optiques avec films composés de soie fibroïne et adéno-associés des vecteurs viraux (AAV). Fibroïne, un polymère dérivé du cocon du Bombyx mori, peut encapsuler et protéger des biomolécules et peuvent être transformés en formes allant des films hydrosolubles à la céramique. Lorsqu’elles sont implantées dans le cerveau, soie/AAV revêtements libèrent des virus à l’interface entre les éléments d’optique et cerveau environnant, conduite expression précisément là où elle est nécessaire. Cette méthode est facilement mis en œuvre et promet de faciliter grandement les études in vivo de la fonction des circuits neuronaux.

Introduction

La dernière décennie a produit une explosion d’ingénierie protéines sensibles à la lumière pour la surveillance et de manipuler l’activité neurale¹. Virus offrent une flexibilité inégalée pour exprimer ces outils d’optogenetic dans le cerveau. Par rapport aux animaux transgéniques, les virus sont beaucoup plus faciles à produire, transporter et stocker, permettant une mise en œuvre rapide des plus récents outils d’optogenetic. Expression peut être ciblée génétiquement à des populations neuronales distinctes et virus conçus pour le transport rétrograde peuvent même être utilisés pour cibler l’expression fondée sur la connectivité neuronale².

Les virus sont généralement introduits avec injections stéréotaxiques, qui peuvent être long et difficile. Visant précisément les petites régions peut être difficile, alors que l’expression de conduite sur les grands domaines souvent nécessite plusieurs injections. En outre, lorsqu’un dispositif optique est ensuite implanté dans le cerveau de livrer léger en vivo, l’implant doit être parfaitement aligné avec l’injection virale. Nous décrivons ici une méthode facilement mises en œuvre pour livrer des vecteurs viraux dans les tissus autour d’un implant à l’aide de soie fibroïne films³. Soie fibroïne est disponible dans le commerce, bien tolérée par les tissus nerveux et peut être utilisé pour produire des matériaux aux propriétés variées. Films en soie peuvent être appliquées aux implants à l’aide d’équipement de laboratoire commun comme les pipettes de micro-injection ou pipettes à la main. Films de soie/AAV éliminent le besoin pour les deux procédures chirurgicales et faire en sorte que l’expression induite par le virus est correctement alignée à l’implant optique. L’expression résultante est contraint à l’extrémité des fibres et des résultats moins expression indésirables le long de la piste de fibre que les injections stéréotaxiques.

En plus de produire une expression ciblée à l’extrémité des petites fibres, soie/AAV films peuvent être utilisés pour piloter généralisée (> 3 mm de diamètre) expression corticale sous fenêtres crâniennes. De l’imagerie in vivo 2 photons de sondes fluorescentes activité est devenu un outil indispensable pour l’évaluation du rôle de l’activité neuronale dans la conduite de traitement sensoriel et cognitif. En revanche, pour conduire uniforme expression sur les grandes aires corticales, expérimentateurs souvent effectuer multi-injections. Ces injections peuvent être extrêmement longues et peuvent conduire à l’expression incompatible à travers le champ de vision. En revanche, soie/AAV-enduit crâniennes windows sont extrêmement faciles à fabriquer, de réduire considérablement le temps nécessaire pour les interventions chirurgicales et conduire plus remarquable expression des centaines de micromètres au-dessous de la surface corticale.

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisés conformément aux protocoles approuvés par le Comité permanent Harvard animalier directives suivantes décrites dans le NIH nous Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les souris C57BL/6 adultes des deux sexes (6 à 15 semaines d’âge) ont été utilisés pour toutes les expériences.

1. obtenir la fibroïne de soie aqueux

1. Préparer ou acheter aqueuse fibroïne de soie (5 à 7,5 % p/v).

2. mélange soie aqueuse avec des vecteurs d’AAV Expression

1. Choisir un vecteur d’expression AAV pour piloter la protéine optogenetic ou indicateur fluorescent de choix.
   Remarque : Pour réduire le volume de soie/AAV qui doivent être appliquée aux implants pendant que vous conduisez toujours expression robuste, stock-titre AAV (stock titres généralement obtenus à partir des carottes de vecteur sont autour de 10 ~¹³ CG/mL) est recommandé.
2. Immédiatement avant le revêtement des implants, décongeler une partie aliquote d’AAV et se combinent avec la fibroïne de soie aqueuse 5 à 7,5 % (ce mélange va être dénommé soie/AAV). Dans un tube de PCR 200 µL, mélange aqueux fibroïne et AAV dans un rapport 1:1 (usage windows crânienne 1:4) immédiatement avant l’application. Pipetez doucement la solution à plusieurs fois pour bien mélanger la fibroïne et AAV.
3. Garder le mélange soie/AAV sur la glace avant de les utiliser.

3. préparer le matériel pour la Fabrication et le stockage des dispositifs soie/AAV-enduit

1. Se procurer du matériel pour revêtement des fibres optiques et lentilles de Gradient-indice (GRIN) (Figures 1, 2).
   1. Construire un support de bague stable. Pour tenir les bagues en céramique, percer des trous de 1,25 mm dans un bloc de ¼" acrylique de feuille. Touchez les trous pour insérer les vis de réglage sur le côté pour maintenir les viroles en place.
      Remarque : Une pince peut être utilisé à cet effet.
   2. Positionner un manipulateur avec précision submillimétrique pour déplacer les fibres optiques (appareil stéréotaxique ou autre micromanipulateur de précision).
   3. Monter un support stable pour positionner la microinjector.
   4. Un stéréoscope permet de visualiser les fibres optiques et gouttelettes de soie.
   5. Placer une source lumineuse pour éclairer les fibres optiques.
2. Préparer le matériel pour le revêtement de fenêtres crâniennes (Figure 3).
   1. Choisissez n’importe quel multipipette P10.
   2. Obtenir un récipient avec couvercle.
      Remarque : N’importe quel récipient avec un fond de silicone est suggéré — le fond mou facilite soulevant windows crâniennes.
3. Préparer le matériel pour stocker les implants finis (Figure 4).
   1. Obtenir une petite chambre à vide (1-5 L).
   2. Assurez-vous qu’il n’y a l’espace pour stocker les implants dans un réfrigérateur à 4 ° C.

4. appliquer le Film de soie/AAV aux dispositifs

1. Revêtement de fibres optiques à expression focal en voiture à l’extrémité de la fibre
   1. Préparer les implants fibre chronique comme décrit précédemment⁴.
   2. Avant utilisation, rincer les implants avec de l’éthanol, puis avec de l’eau ultrapure pour s’assurer que les fibres optiques sont propres.
      Remarque : Films de la soie adhèrent plus fiable pour nettoyer les surfaces vitrées.
   3. Préparer un dispositif pour tenir les bagues de fibre. Pour viroles de typique de 1,25 mm de diamètre, utiliser un bloc acrylique transparent, avec ~1.3 de ¼ po mm trous et tapé vis entrant du côté aux implants trou fermement en place (Figure 1 a).
   4. Monter le support de bague dans un appareil stéréotaxique (ou n’importe quelle solution de manipulation avec une précision de Planck) équipé d’un microinjector. Placez le support de bague au-dessus de la microinjector et appliquer le mélange de soie/AAV par-dessous.
      Remarque : C’est parce que résultaient de demandes de grands volumes d’en haut en soie/AAV qui n’était pas limité à la pointe. Toutefois, la demande de nombreux petits volumes séquentielles par dessus ou en dessous peut produire des dépôts AAV/soie qui se limitent à la pointe (bien que nous préférons à appliquer par le bas).
   5. Tirez une pipette d’injection intracrânienne standard de verre borosilicaté capillaire.
      1. Pour le rendre plus facile à
      2. Pour produire un embout d’injection avec un bout plat propre du diamètre désiré, prenez une pipette dans chaque main et utilisez la partie la plus épaisse du cône sur une pipette pour marquer des autre la pipette à l’emplacement du saut souhaité.
      3. Frottez doucement en arrière dans un mouvement de sciage (la méthode de notation de verre sur verre).
      4. Après avoir marqué la pipette, appliquez une légère pression à l’extrémité de la pipette a marqué avec le corps de l’autre pipette pour réaliser une rupture nette.
   6. Positionner un stéréoscope pour donner une vue dégagée sur les visages de la fibre optique.
      Remarque : Le grossissement devrait suffire positionner avec précision la pipette d’injection au-dessus du visage de fibres optiques.
   7. Insérer les implants de fibre dans porte-le cerveau-côté de la fibre optique vers le bas.
   8. Charger la pipette d’injection avec solution de soie/AAV, comme pour toute injection intracrânienne standard⁵. Charger le montant requis pour le nombre d’implants réalisés, majoré de ~ 30 % supplémentaire pour tenir compte des pertes dues à l’obstruction de pipettes. Par exemple, si 10 implants sont faits, puis chargez avec 100 nL dépôts et retirer ~1.3 µL.
      Remarque : Soie/AAV peuvent sécher à l’embout de la pipette entre les éjections, qui peuvent boucher la pipette. Pipettes de grand diamètre (50-100 µm) sont moins susceptibles de boucher. Sabots peuvent être délogés par un brossage doux vers le bas de l’embout de la pipette avec un tampon de chiffon ou de l’alcool de papier mouillé.
   9. Manœuvrer la pipette d’injection jusqu'à ce qu’il est touchant ou en touchant presque au centre de la surface de la fibre optique. 10-20 nL de soie/AAV solution d’éjection. Retirer la pipette.
      Remarque : Le taux de livraison n’est pas critique, mais les taux typiques sont de 5 à 20 nL/s.
   10. Observer le bolus de soie/AAV sur une surface plane qui apparaît comme un dôme liquid qui sèche un film plat en ~ 1 min (Figure 1 b).
   11. Répétez les étapes 4.1.9-4.1.10 jusqu'à ce que la quantité désirée de soie/AAV est déposé (un total de 20 à 200 nL pour la plupart des applications). Lors de la préparation des implants multiples, faire un implant de soie/AAV et puis passer à enrober d’autres implants avant de retourner à la première.
   12. Laisser 1 h pour le séchage avant de passer les implants.
   13. Sous vide nuit dessécher à ~ 125 Torr (-25 à. Hg), 4 ° C. Cela, en plaçant le titulaire de la virole ensemble dans une chambre à vide.
   14. Évaluer la forme et la position du film soie sous un microscope de haute puissance qui en résulte. Veiller à ce que les films sont confinées à l’extrémité de la surface de la fibre optique, être relativement mince (> 100 µm) et symétrique (Figure 1).
       Remarque : Des films de soie/AAV grands ou asymétriques peuvent déloger de la fibre pendant l’implantation (Figure 1). La cause la plus fréquente des problèmes découle de l’application du seul gros volumes plutôt que l’application séquentielle de plusieurs petits volumes.
2. Revêtement coniques de fibres optiques à l’expression de la promenade le long de l’axe de la fibre
   1. Obtenir des implants coniques de fibre optique et effectuer les étapes 4.1.2-4.1.8, sauf que la fibre conique est placée latéralement tel qu’il est perpendiculaire à l’injecteur (Figure 2 a). Position de l’injecteur au-dessus de la fibre effilée.
      Remarque : Chargement des gouttelettes de liquide sur la pose de fibres coniques ajouté défis, parce que la tension superficielle tend à provoquer des gouttelettes sauter sur la pipette d’injection ou de migrer vers le haut de la fibre effilée. Les pipettes d’injection plus petites (30 à 50 µm de diamètre) aident à surmonter ce problème, mais augmentent le risque que la pipette d’injection s’obstrueront. En raison de la tension superficielle, gouttelettes ont tendance à adhérer à la zone de plus grande surface, donc l’injection optimale pipetter taille est dépend de la taille de la fibre effilée et sa tolérance pour sabot occasionnel.
   2. Placez la pipette d’injection de soie/AAV contre les parois de la fibre optique au début du cône. S’assurer que la pipette d’injection est en contact avec la fibre optique.
   3. Éjectez 20 nL de soie/AAV pour démarrer le processus de revêtement. S’assurer que la goutte adhère à la fibre optique et qu’il reste à l’interface de la fibre/pipette. Mèche délicatement la goutte vers la fin de l’extrémité de la fibre comme de la soie/AAV dries (~ 45 s). Tenir la pipette d’injection au contact de la gouttelette de séchage pour éviter l’obstruction de l’embout de la pipette.
      Remarque : Chaque dépôt doit enrober environ 400 µm de la fibre effilée (Figure 2 b).
   4. Lorsque le premier bolus est presque complètement sec, éjecter un autre 20 nL et continuer la mèche de la goutte le long de la dépouille.
      Remarque : La soie liquide adhérera à la soie séchée, ancrage à une extrémité de la goutte comme la pipette se déplace le long du cône.
   5. Répétez l’étape 4.2.4 par éjection de petites quantités de soie/AAV ainsi qu’en tirant progressivement la solution sur le côté du cône. 5-6 éjections sont suffisantes pour traverser la surface d’un cône de 2,5 mm.
   6. Pour conduire plus expression uniforme autour de tous les côtés de la fibre, faire pivoter la fibre et répétez les étapes 4.2.2-4.2.5 jusqu'à ce que la quantité désirée de soie/AAV a été déposée.
   7. Si un accrochage chapelet de soie/AAV séchée s’étend au-delà de l’extrémité de la fibre, découpez soigneusement le fil avec des ciseaux, ou utilisez la pipette d’éjection pour plier le brin arrière et il adhère à la conicité de la fibre.
   8. Laisser 1 h pour le séchage avant de passer les implants.
   9. Sous vide dessécher pendant la nuit à 4 ° C. Le titulaire de la virole entière peut être placé dans une chambre à vide.
   10. Évaluer la forme et la position du film soie sous un microscope de haute puissance qui en résulte.
       Note : Les Films ne sont pas nécessairement entièrement uniformes mais n’aient pas de bosses qui s’étendent à plus de 100 µm au-delà de la surface de la fibre afin de minimiser les dommages aux tissus avoisinants pendant l’implantation (Figure 3). Pour minimiser la taille du film, il est essentiel que chaque gouttelette est parfaitement sec avant les dépôts ultérieurs sont effectués.
3. Lentille GRIN revêtement implants
   1. Obtenir le sourire lentilles^6,7 et répétez les étapes 4.1.2-4.1.8. L’injecteur peut être monté dessus.
   2. Déposer soie/AAV dans une éjection unique (1 µL d’une lentille de diamètre 1,0 mm).
      Remarque : Ceci permettra d’obtenir un dôme de liquide qui adhère à la surface de la lentille et sèche pour produire un film uniform (100 à 200 µm d’épaisseur). Cependant, les dans le cas où une seule éjection grande sèche inégalement et réalise un film qui est plus épais près des bords de la lentille GRIN, essayez déposer plusieurs plus petites gouttelettes (100-200 nL) dans le centre de la surface de la lentille (permettant à chaque goutte de sécher avant le dépôt de le prochain) pour s’assurer que le film sera conduirait expression au centre du champ de vision.
   3. Laisser 1 h pour le séchage avant de passer les implants.
   4. Évaluer la forme et la position du film soie résultant sous microscope haute puissance pour s’assurer que le film couvre la surface de la lentille.
4. Revêtement de vitraux crânienne
   1. Préparer le verre windows crâniennes par deux adhérentes de diamètre 3 mm rond lamelles couvre-objet (épaisseur n ° 1) à une fenêtre de diamètre 5 mm avec adhésif optique (pour plus de détails, voir Goldey Al 2014⁸).
   2. Mélange de soie : virus dans une proportion de 1:4 pour réduire le montant total de soie dans le film. Des quantités excessives de la soie ne se dissolvent pas sous windows crâniennes après l’implantation. Expériences de titrage peuvent être nécessaire pour déterminer le ratio et le volume qui donne le profil d’expression désirée.
   3. Main pipette une goutte de 5 µL sur la surface de la lamelle de 3 mm (parement de cerveau). La goutte doit étaler pour couvrir la surface entière (Figure 3).
   4. Laisser 2-3 h de séchage avant de passer à windows.

5. stockage des implants soie/AAV-enduit

1. Stocker soie/AAV-enduit de fibres optiques dans un dessiccateur à vide refroidi (~ 125 Torr, 4 ° C) avant utilisation (Figure 4 a).
2. Ne stockez pas de fenêtres crâniennes et sourire lentilles sous vide, comme grands films soie stockés sous vide ne parviennent pas à se dissoudre complètement après l’implantation. L’implant de windows crâniennes et sourire lentilles immédiatement après le séchage, ou dans une journée de fabrication si stocké à la pression atmosphérique et de 4 ° C.

6. l’implantation des dispositifs

1. Préparer les animaux pour la chirurgie implantaire comme décrit précédemment⁴.
   1. En bref, offrir une souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (100/10 mg/kg) et vérifier la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un orteil-pinch doux. Se raser le crâne dans la zone de l’implant et nettoyer le cuir chevelu avec l’iode et l’alcool.
   2. Monter les animaux dans un appareil stéréotaxique et de compléter l’anesthésie à l’aide d’un mélange d’oxygène et isoflurane (1-2 %). Faire une incision dans le cuir chevelu au-dessus de la zone d’intérêt, puis effectuez une craniotomie assez grande pour accueillir l’implant.
2. Fibres optiques⁹ et microendoscope de lentilles¹⁰ selon les procédures précédemment publiées de l’implant. Les implants de poignée avec soin, comme le dépôt de la soie/AAV peut faire tomber une craniotomie imparfait ou l’implant attraper sur le bord du crâne. Abaissez l’implant dans le cerveau lentement (~ 2 mm/min).
3. Des implants crâniens windows comme décrivent précédemment⁸. Ne pas toucher le côté enduit de la fenêtre et éviter de rincer la fenêtre avec le fluide si vous effectuez le gavage, comme cela peut enlever le virus. Pour atteindre l’expression maximale, effectuer un durotomy.

7. évaluation de l’Expression et de dépannage

1. Afin d’évaluer l’expression de protéines exprimées virally, laisser environ 2-3 semaines pour le virus conduire l’expression, puis effectuer perfusion intracardial avec 4 % de paraformaldéhyde en phosphate tamponnée solution saline¹¹ et processus les tissus cérébraux pour fluorescent ¹²de microscopie.
2. Évaluer l’expression en utilisant la microscopie fluorescente pour image le modèle d’expression des protéines de fluorophore-le tag optogenetic.
3. Si le niveau d’expression est insuffisant, augmenter la quantité de virus dans les revêtements en soit en augmentant le volume total de l’enduit soie/AAV, ou de préférence en utilisant un virus de titre plus élevé.

Résultats

Pour évaluer le succès des films de soie/AAV dans l’expression de la conduite, nous perfusés animaux 2-3 semaines après l’implantation et préparé des coupes de cerveau de la région d’intérêt. Images de fluorescence des protéines fluorophore-le tag optogenetic (ChR2-YFP) a fourni une mesure de l’étendue de l’expression (Figure 1). Fibres optiques typiques (230 µm de diamètre) peut facilement accueillir 200 nL de soie/AAV. Avec la pratiqu...

Discussion

L’utilisation de la soie/AAV pour cibler l’expression des protéines optogentic surmonte les limites des approches qui sont actuellement en cours d’utilisation. Bien que de nombreuses études utilisent avec succès les injections AAV pour exprimer les protéines optogenetic, il est difficile d’aligner l’expression jusqu'à l’extrémité des fibres optiques, aux régions autour de la longueur des fibres coniques et à la région regarde un d’une lentille de sourire. À cause de défaut d’alignement entre l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.