Na Vivo Alvo expressão de proteínas de Optogenetic usando seda/AAV filmes

Resumo

Aqui, apresentamos um método de distribuição de vetores de expressão viral no cérebro usando filmes de seda da fibroína. Esse método permite que o alvo entrega de vetores de expressão usando windows cranianas, cônico de fibras ópticas e fibras ópticas revestidas de seda/AAV.

Resumo

A busca da compreensão de circuitos neurais como informações do processo em ordem à saída comportamental de unidade tem sido grandemente ajudadas pela recentemente desenvolvidos métodos ópticos para manipular e monitorar a atividade de neurônios em vivo. Esses tipos de experiências dependem de dois componentes principais: 1) implantáveis dispositivos que fornecem acesso óptico para o cérebro e proteínas 2) sensíveis à luz que fornecem uma leitura da atividade neuronal ou alterar a excitabilidade neuronal. Há um número de maneiras de expressar proteínas sensíveis à luz, mas injeção estereotáxica de vetores virais é atualmente a abordagem mais flexível, porque a expressão pode ser controlado com precisão temporal, genética e anatômica. Apesar da grande utilidade de vetores virais, entregando o vírus para o site de implantes óptico poses inúmeros desafios. Injeções de vírus estereotáxica exigem cirurgias que aumentam o tempo cirúrgico, aumentam o custo dos estudos e representam um risco para a saúde do animal. O tecido circundante pode ser fisicamente danificado pela seringa de injeção e por imunogênica inflamação causada pela entrega abrupta de uma cápsula de alta concentração de vírus. Alinhar as injeções com implantes ópticos é especialmente difícil quando o direcionamento de pequenas regiões profundas no cérebro. Para superar estes desafios, nós descrevemos um método para revestir vários tipos de implantes ópticos com filmes compostos de seda da fibroína e Adeno-associado vetores virais de (AAV). Fibroin, um polímero derivado de Bombyx mori, o casulo pode encapsular e proteger biomoléculas e podem ser transformadas em formas que variam de filmes solúveis a cerâmica. Quando implantado no cérebro, revestimentos de seda/AAV liberar o vírus na interface entre os elementos de óptica e o cérebro circundante, dirigindo a expressão precisamente onde é necessário. Este método é facilmente implementado e promete facilitar grandemente na vivo estudos da função do circuito neural.

Introdução

Na última década tem produzido uma explosão de engenharia proteínas sensíveis à luz para monitoramento e manipulação neural atividade¹. Vírus para oferecer incomparável flexibilidade para expressar essas ferramentas optogenetic no cérebro. Em comparação com animais transgénicos, vírus são muito mais fáceis de produzir, transportar e armazenar, permitindo a rápida implementação das ferramentas do mais novos optogenetic. Expressão pode ser alvo geneticamente distintas populações neuronal, e vírus projetados para o transporte retrógrado ainda podem ser usados para direcionar a expressão baseada na conectividade neuronal².

Vírus são normalmente introduzidas com injeções estereotáxicos, que podem ser demorado e desafiador. Precisamente como alvo pequenas regiões pode ser difícil, enquanto expressão de condução sobre grandes áreas muitas vezes requer muitas injeções. Além disso, quando um dispositivo óptico é posteriormente implantado no cérebro para fornecer luz na vivo, o implante deve ser alinhado com a injeção de viral. Aqui, descrevemos um método facilmente implementados para a entrega de vetores virais para o tecido em torno de um dispositivo implantado usando seda da fibroína filmes³. Fibroin seda é bem tolerado pelos tecidos neurais, comercialmente disponível e pode ser usado para produzir materiais com propriedades variadas. Filmes de seda podem ser aplicadas aos implantes utilizando equipamentos comuns de laboratório como pipetas microinjeção ou pipetas de mão. Filmes de seda/AAV eliminam a exigência de dois procedimentos cirúrgicos e garantir que a expressão mediada por vírus está corretamente alinhado ao implante óptico. A expressão resultante é restrito à ponta das fibras e resulta em menos expressão indesejado ao longo da trilha de fibra do que injeções estereotáxicos.

Além de produzir alvo expressão na ponta de pequenas fibras, filmes de seda/AAV podem ser usados para conduzir generalizada (> 3 mm de diâmetro) expressão cortical sob windows cranianas. Na vivo imagem 2-fóton de sensores fluorescente atividade tornou-se uma ferramenta indispensável para avaliar o papel da atividade neuronal na condução do processamento sensorial e cognitivo. No entanto, para conduzir uniforme expressão sobre as áreas corticais amplas, experimentadores frequentemente executar múltiplas injeções. Essas injeções podem ser extremamente demoradas e podem levar a expressão inconsistente do outro lado do campo de visão. Em contraste, seda/AAV-revestido cranianas windows são extremamente fáceis de fabricar, reduzir significativamente o tempo necessário para cirurgias e dirigir mais notavelmente a expressão centenas de micra abaixo da superfície cortical.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo animais foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pela Harvard Comité permanente Cuidado Animal, seguir as orientações descritas no NIH nos guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Ratos de C57BL/6 adultos de ambos os sexos (6-15 semanas de idade) foram usados para todos os experimentos.

1. obter aquosa da fibroína de seda

1. Preparar ou comprar aquosa da fibroína de seda (5-7,5% p/v).

2. mistura aquosa seda com vetores de expressão de AAV

1. Escolha um vetor de expressão de AAV para conduzir a proteína optogenetic ou fluorescente indicador de escolha.
   Nota: Para minimizar o volume de seda/AAV que devem ser aplicada aos implantes durante a condução ainda expressão robusto, estoque-título AAV (ações títulos normalmente obtidos de núcleos de vetor são em torno de 10 ~¹³ gc/mL) é recomendado.
2. Imediatamente antes do revestimento de implantes, descongelar uma alíquota de AAV e combinar com 5-7,5% aquosa seda da fibroína (esta mistura será referida como seda/AAV). Em um tubo PCR 200 µ l, misture fibroin aquosa e vírus adeno-associados na proporção de 1:1 (para uso de windows craniana 1:4) imediatamente antes da aplicação. Pipete suavemente a solução dentro e para fora várias vezes para homogeneizar completamente o fibroin e AAV.
3. Manter a mistura de seda/AAV no gelo antes de usar.

3. preparar o equipamento para fabricação e armazenamento de dispositivos de seda/AAV-revestido

1. Adquirir equipamentos para fibras ópticas de revestimento e lentes degradê-índice (sorriso) (figuras 1, 2).
   1. Construa um suporte estável virola. Para segurar a cerâmicas virolas, furos 1,25 milímetros em um bloco de acrílico de folha ¼". Toque em buracos para inserir os parafusos do lado para prender virolas no lugar.
      Nota: Qualquer braçadeira pode ser usada para essa finalidade.
   2. Posicione o manipulador com precisão de milímetros sub para mover as fibras ópticas (aparelho estereotáxica ou outro micromanipulador de precisão).
   3. Monte um suporte estável para posicionar o microinjector.
   4. Use um estereoscópio, para visualizar as fibras ópticas e gotículas de seda.
   5. Coloque uma fonte de luz para iluminar as fibras ópticas.
2. Prepare o equipamento para revestimento de janelas cranianas (Figura 3).
   1. Escolha qualquer pipeta P10.
   2. Obter um recipiente com tampa.
      Nota: Qualquer recipiente com uma parte inferior do silicone é sugerido — fundo macio facilita levantando windows cranianas.
3. Prepare o equipamento para armazenar acabados implantes (Figura 4).
   1. Obter uma pequena câmara de vácuo (L. 1-5).
   2. Certifique-se de que não há espaço para armazenar implantes em um frigorífico de 4 ° C.

4. aplicar filme de seda/AAV aos dispositivos

1. Fibras ópticas de revestimento a expressão focal de unidade na ponta de fibra
   1. Prepare a fibra crônica implantes como descrito anteriormente,⁴.
   2. Antes do uso, enxágue implantes com etanol e, em seguida, com água ultrapura para garantir que as fibras ópticas são limpas.
      Nota: Filmes de seda aderirem mais confiável para limpar as superfícies de vidro.
   3. Prepare um dispositivo para segurar virolas de fibra. Para virolas de diâmetro típico de 1,25 mm, uso um bloco de acrílico transparente, com ~1.3 ¼ de polegada mm furos e aproveitado parafusos inserindo do lado para implantes de buraco firmemente no lugar (figura 1A).
   4. Monte o suporte do terminal um aparato estereotáxica (ou qualquer solução de manipulação com precisão submillimeter) equipado com um microinjector. Coloque o suporte de virola acima o microinjector e aplique a mistura de seda/AAV de baixo.
      Nota: Isto é porque a aplicações de grandes volumes de cima resultaram em seda/AAV que não se limitava à ponta. No entanto, a aplicação de muitos pequenos volumes sequenciais de acima ou abaixo pode produzir depósitos AAV/seda que estão confinados à ponta (embora nós preferimos aplicar por baixo).
   5. Puxe uma pipeta de injeção intracraniana padrão de vidro de borosilicato capilar.
      1. Para facilitar a
      2. Para produzir uma ponta de injeção com uma ponta limpa lisa do diâmetro desejado, segure uma pipeta em cada mão e usar a parte mais grossa da conicidade em uma pipeta para marcar outra pipeta no local desejado descanso.
      3. Esfrega suavemente para a frente e para trás em um movimento de serragem (o método de Pontuação de vidro sobre vidro).
      4. Depois de marcar a pipeta, aplique uma pressão suave até a ponta da pipeta marcou com o corpo da outra pipeta para obter um corte limpo.
   6. Posicione um estereoscópio para obter uma visão clara das faces da fibra óptica.
      Nota: A ampliação deve ser suficiente para precisão a posição da pipeta de injeção sobre a face de fibras ópticas.
   7. Inserir os implantes de fibra titular com o lado do cérebro da fibra óptica voltada para baixo.
   8. Carrega a pipeta de injeção com solução de seda/AAV, quanto a qualquer injeção intracraniana padrão⁵. Carrega a quantidade necessária para o número de implantes, sendo feitas, mais extra para acomodar as perdas devido ao entupimento de pipetas de ~ 30%. Por exemplo, se 10 implantes estão sendo feitos, em seguida, carregar com 100 nL depósitos e retirar ~1.3 µ l.
      Nota: Seda/AAV pode secar a ponta da pipeta entre as ejeções, que pode obstruir a pipeta. Pipetas de grande diâmetro (50-100 µm) são menos susceptíveis de obstruir. Tamancos podem ser desalojados por escovação suave para baixo a ponta da pipeta com um cotonete de limpeza ou álcool de papel molhado.
   9. Manobre a pipeta de injeção até que está tocando ou quase tocando o centro da superfície da fibra óptica. Ejete nL 10-20 da solução de seda/AAV. Retire a pipeta.
      Nota: A taxa de entrega não é crítica, mas as taxas típicas são 5-20 nL/s.
   10. Observar o bólus de seda/AAV a superfície plana que aparece como uma cúpula de líquido que seca para uma película plana dentro de min ~ 1 (figura 1B).
   11. Repita etapas 4.1.9-4.1.10 até a quantidade desejada de seda/AAV é depositado (um total de 20-200 nL, a maioria dos aplicativos). Ao preparar vários implantes, aplicar seda/vírus adeno-associados a um implante e em seguida, passar para revestir outros implantes antes de retornar ao primeiro.
   12. Permitir que 1 h para secar antes de passar os implantes.
   13. Vácuo ressecam pernoite no ~ 125 Torr (-25 em. Hg), 4 ° C. Fazer isso, colocando o titular virola inteira em uma câmara de vácuo.
   14. Avalie a forma e a posição do filme seda resultante sob um microscópio de alta potência. Certifique-se de que filmes estão confinados à ponta da superfície da fibra óptica, ser relativamente fina (> 100 µm) e simétrica (Figura 1).
       Nota: Filmes de seda/AAV grandes ou assimétricas podem desalojar da fibra durante o implante (Figura 1). A causa mais comum de problemas surge a partir da aplicação do único grandes volumes ao invés da aplicação sequencial de muitos pequenos volumes.
2. Revestimento cônicos de fibras ópticas para expressão de unidade ao longo do eixo da fibra
   1. Obter os implantes cônicos de fibra óptica e executar etapas 4.1.2-4.1.8, exceto que a fibra cônica é posicionada lateralmente, tal que é perpendicular do injector (Figura 2A). Posição o injetor acima a fibra cônico.
      Nota: Carregar as gotas líquidas em poses de fibras afiladas adicionado desafios, porque a tensão superficial tende a causar as gotas saltar sobre a pipeta de injeção ou migrar até a fibra cônica. Pipetas de injeção menores (30-50 µm de diâmetro) ajudam a superar esse problema, mas aumentam o risco de que a pipeta de injeção vai entupir. Devido à tensão superficial, as gotas tendem a aderir à área de superfície maior, então a ideal injeção Pipetar tamanho é dependente do tamanho da fibra cônica e a tolerância para a obstrução ocasional.
   2. Posição da pipeta de injeção de seda/AAV contra o lado da fibra óptica no início da conicidade. Certifique-se que a pipeta de injeção é tocando a fibra óptica.
   3. Ejetar 20 nL de seda/AAV para iniciar o processo de revestimento. Certifique-se que a gota adere à fibra óptica e permanece na interface de fibra/pipeta. Pavio suavemente a gota no final da ponta da fibra, como a seda/AAV seca (~ 45 s). Manter a pipeta injetando em contacto com a secagem da gota para evitar entupimento a ponta da pipeta.
      Nota: Cada depósito deve revestir aproximadamente 400 µm da fibra afilada (Figura 2B).
   4. Quando o primeiro bolo secou quase completamente, ejetar mais 20 nL e continuar a absorção da gota ao longo do atarraxamento.
      Nota: A seda líquida irá aderir a seda seca, ancoragem uma ponta de gota como a pipeta se move ao longo da conicidade.
   5. Repita a etapa 4.2.4 ejetando quantidades pequenas de seda/AAV, e gradualmente, desenho da solução até o lado da conicidade. 5-6 ejeções são suficientes para atravessar a superfície de um cone de 2,5 mm.
   6. Para conduzir mais expressão uniforme por todos os lados da fibra, girar a fibra e repita etapas 4.2.2-4.2.5 até a quantidade desejada de seda/AAV tenha sido depositada.
   7. Se um enforcamento vertente de seda/AAV seca se estende para além da ponta de fibra, cuidadosamente, cortar o fio com tesoura, ou usar a pipeta de ejeção para dobrar o fio volta e observem a conicidade da fibra.
   8. Permitir que 1 h para secar antes de passar os implantes.
   9. Vácuo ressecam pernoite em 4 ° C. O titular de virola inteira pode ser colocado em uma câmara de vácuo.
   10. Avalie a forma e a posição do filme seda resultante sob um microscópio de alta potência.
       Nota: Filmes não precisam ser inteiramente uniformes, mas não devem ter saliências que se estendem a mais de 100 µm para além da superfície da fibra para minimizar os danos ao tecido circundante durante o implante (Figura 3). Para minimizar o tamanho do filme, é fundamental que cada gota está completamente seca antes dos depósitos posteriores são feitos.
3. Implantes de lentes de sorriso de revestimento
   1. Obter o sorriso lentes^6,7 e repita etapas 4.1.2-4.1.8. O injetor pode ser montado acima.
   2. Depósito de seda/AAV em uma única ejeção (1 µ l para uma lente de diâmetro de 1,0 mm).
      Nota: Isto irá produzir uma cúpula de líquido que adere à face da lente e seca para produzir um filme uniforme (100-200 µm de espessura). No entanto, no caso em que um única grande ejeção seca desigualmente e produz um filme que é mais grosso perto das bordas da lente GRIN, tente depositar várias gotículas menores (100-200 nL) no centro da superfície da lente (permitindo que cada gota secar antes de depositar o próximo) para garantir que o filme irá conduzir a expressão no centro do campo de visão.
   3. Permitir que 1 h para secar antes de passar os implantes.
   4. Avalie a forma e a posição do filme seda resultante sob um microscópio de alta potência para garantir que o filme cobre a superfície da lente.
4. Revestimento de vidro windows craniana
   1. Prepare o vidro windows cranianas por aderente dois de 3 mm de diâmetro redondo lamelas (espessura do n º 1) para uma janela de diâmetro de 5 mm com adesivo óptico (para obter detalhes, consulte Goldey et al . 2014⁸).
   2. Misture seda: vírus em uma relação de 1:4 para reduzir a quantidade total de seda no filme. Quantidades excessivas de seda não se dissolve sob windows cranianas após o implante. Experimentos de titulação podem ser necessária para determinar a relação e o volume que dá o perfil de expressão desejada.
   3. Mão Pipetar uma gotícula de 5 µ l para a superfície da lamela 3 mm (face do cérebro). A gota deve espalhar para cobrir a superfície inteira de vidro (Figura 3).
   4. Permitir que 2-3 h para secar antes de se mudar de windows.

5. armazenamento de implantes de seda/AAV-revestido

1. Loja de seda/AAV-revestido de fibras ópticas num exsicador de vácuo refrigerado (~ 125 Torr, 4 ° C) antes da sua utilização (Figura 4A).
2. Não armazene windows cranianas e sorriso lentes sob vácuo, como grandes filmes seda armazenados sob vácuo deixam dissolver-se totalmente após o implante. Implante o windows cranianas e sorriso lentes imediatamente após a secagem, ou dentro de um dia de fabricação, se armazenado a pressão atmosférica e a 4 ° C.

6. implantação de dispositivos de

1. Prepare os animais para cirurgia de implante como descrito anteriormente⁴.
   1. Brevemente, anestesiar os ratos com a injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina (100/10 mg/kg) e verifique a profundidade da anestesia, usando uma dedo do pé-pitada suave. Raspar a cabeça na área do implante e limpar o couro cabeludo com iodo e álcool.
   2. Montagem de animais em um dispositivo estereotáxica e anestesia suplemento usando uma mistura de oxigênio e isoflurano (1-2%). Fazer uma incisão no couro cabeludo, sobre a área de interesse e executar uma craniotomia suficientemente grande para acomodar o implante.
2. Implante de fibras ópticas⁹ e microendoscope lentes¹⁰ de acordo com os procedimentos anteriormente publicados. Identificador de implantes com cuidado, como o depósito de seda/AAV pode ser derrubado por uma craniotomia imperfeita ou o implante pegando na borda do crânio. Abaixe o implante no cérebro lentamente (~ 2 mm/min).
3. Implante o windows craniano como descrever anteriormente⁸. Não toque o lado revestido da janela e evitar lavagem a janela com fluido se realizando gavagem, como isto pode lavar o vírus. Para alcançar a máxima expressão, realize um durotomy.

7. avaliar a expressão e solução de problemas

1. Para avaliar a expressão de proteínas expressas Viralmente, permitir ~ 2-3 semanas para o vírus dirigir a expressão e, em seguida, executar a perfusão intracardíaca com paraformaldeído 4% em fosfato tamponado tecido de cérebro¹¹ e processo de solução salina para fluorescente microscopia de¹².
2. Avalie a expressão usando microscopia fluorescente para o padrão de expressão de proteínas optogenetic fluoróforo-com a tag de imagem.
3. Se o nível de expressão for insuficiente, aumente a quantidade de vírus em revestimentos, aumentando o volume total do revestimento de seda/AAV, ou, preferencialmente, usando um vírus de título superior.

Resultados

Para avaliar o sucesso dos filmes de seda/AAV na condução de expressão, nós perfundidos animais 2-3 semanas após o implante e preparado com fatias de cérebro da região de interesse. Imagens de fluorescência das proteínas fluoróforo-tag optogenetic (YFP-ChR2) forneceu uma medida da extensão da expressão (Figura 1). Fibras ópticas típicas (230 µm de diâmetro) pode facilmente acomodar 200 nL de seda/AAV. Com a prática, experimentadores podem alc...

Discussão

O uso de seda/AAV para atingir a expressão de proteínas optogentic supera as limitações das abordagens que estão atualmente em uso. Embora muitos estudos com sucesso usam injeções de AAV para expressar proteínas optogenetic, é desafiador para alinhar a expressão para a dica de fibras ópticas, para regiões de todo o comprimento das fibras afiladas e à região de visualização de uma lente de sorriso. Por causa do desalinhamento entre componentes ópticos e optogenetic expressão, estereotáxicos injeções p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.