В естественных условиях Целевые выражение Optogenetic белков с помощью шелка/AAV фильмы

Резюме

Здесь мы представляем метод доставки векторы экспрессии вирусных в мозга с помощью пленки Фиброин шелка. Этот метод позволяет адресности векторы выражения с использованием шелка/AAV покрытием оптического волокна, коническая оптических волокон и черепной windows.

Аннотация

Стремление понять как нейронных цепей, обрабатывать информацию в целях поведенческих мощность привода значительно способствовало недавно разработанных оптических методов для манипулирования и мониторинга активности нейронов в естественных условиях. Эти типы экспериментов полагаться на двух основных компонентов: 1) имплантируемых устройств, которые обеспечивают оптический доступ к мозгу и 2) светочувствительные белки, которые изменить возбудимости нейронов или предоставить индикация активности нейронов. Существует ряд способов выразить светочувствительные белков, но стереотаксического инъекции вирусных векторов в настоящее время наиболее гибкий подход, потому что выражение может управляться с точностью, генетические, анатомические и временных. Несмотря на большую полезность вирусных векторов доставлять вирус на сайт оптических имплантатов создает многочисленные проблемы. Стереотаксическая вирусом инъекции требуют хирургических операций, которые увеличивают время хирургических, увеличить стоимость исследований и представляют опасность для здоровья животных. Окружающие ткани могут быть физически повреждены путем инъекций шприц и иммуногенные воспаления, вызванного резким доставки болюс высокий титр вируса. Выравнивание инъекции с оптическим имплантаты особенно трудно, при таргетинге малых регионов глубоко в головном мозге. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы описываем метод для покрытия различных типов оптических имплантатов с фильмов состоит из Фиброин шелка и аденоассоциированный вирусных векторов (AAV). Фиброин, полимер производный из кокона Тутовый шелкопряд, может инкапсулировать и защищать биомолекул и могут быть обработаны в формах, начиная от растворимых фильмов для керамики. При имплантированных в мозг, шелк/AAV покрытия выпустить вирус на стыке оптических элементов и окружающих мозг, вождение выражение точно, где она необходима. Этот метод легко реализуется и обещает значительно облегчить в vivo исследования нейронной цепи функции.

Введение

За последнее десятилетие подготовил взрыв инженерии светочувствительные белков для мониторинга и манипулирования нейронной активности¹. Вирусы предлагают непревзойденную гибкость для выражения этих инструментов optogenetic в мозге. По сравнению с трансгенных животных, вирусы являются гораздо проще для производства, транспортировки и хранения, что позволяет быстрое внедрение новейших инструментов optogenetic. Выражение может быть выполнено генетически различных нейрональных популяций, и вирусы, предназначенные для ретроградного транспорта может использоваться даже для выражения на базе нейрональных подключения².

Вирусы обычно вводятся с стереотаксического инъекции, которые может быть длительным и сложным. Именно против малых регионов может быть трудно, в то время как вождение выражение более широких областей часто требует много инъекции. Кроме того когда оптическое устройство впоследствии имплантированных в мозг, чтобы доставить свет в естественных условиях, имплантат должен быть должным образом выровнен с вирусной инъекции. Здесь мы описываем легко реализован метод доставки вирусных векторов в ткани вокруг имплантированного устройства использование Фиброин шелка фильмы³. Фиброин шелка коммерчески доступных, хорошо переносится нервных тканей и может использоваться для производства материалов с разнообразными свойствами. Шелковые фильмы могут быть применены к имплантатов с использованием общего лабораторного оборудования как микроинъекции пипетки или ручной пипетки. Шелк/AAV фильмы устранить требование о двух хирургических процедур и убедитесь, что вирус опосредованной выражение должным образом выравнивается оптический имплант. Результирующее выражение ограничивается кончик волокон и результаты в менее нежелательных выражение вдоль волокна трек чем стереотаксического инъекции.

В дополнение к производству целевых выражение на кончике мелких волокон, шелк/AAV пленки могут использоваться для привода широко (> 3 мм диаметром) корковых выражение под черепной windows. В естественных условиях 2-Фотон изображений датчиков флуоресцентные деятельность стала незаменимым инструментом для оценки роли нейронной активности в автошколах чувств и когнитивной обработки. Однако диск единообразных выражение более широких областей коры головного мозга, экспериментаторы часто выполняют множественные инъекции. Эти инъекции может быть очень много времени и может привести к несовместимым выражение через поле зрения. В отличие от этого шелк/AAV-покрытием черепной окна являются очень легко производить, значительно сократить время, необходимое для операции, и наиболее удивительно выражение сотен микрон ниже поверхности коры.

протокол

Все эксперименты с участием животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденных Постоянным комитетом Гарварда по животных уход следующие руководящие принципы, описанные в низ нас руководство по уходу и использованию лабораторных животных. Взрослых мышей C57BL/6 обоего пола (6-15 недель возраста) были использованы для всех экспериментов.

1. получить водный Фиброин шелка

1. Подготовка или приобрести водный Фиброин шелка (5-7,5% w/v).

2. смешать водный шелка с векторы AAV выражение

1. Выберите выражение вектора AAV водить optogenetic белка или флуоресцентный индикатор выбора.
   Примечание: Чтобы свести к минимуму объем шелк/AAV, которые должны быть применены для имплантатов рулем надежные выражение по-прежнему рекомендуется фондовая титр AAV (бульон, титры, обычно получается из вектора ядер находятся вокруг ~ 10¹³ gc/мл).
2. Непосредственно перед покрытие имплантов оттепель Алиготе AAV и объединить с 5-7,5% водный Фиброин шелка (эта смесь будет именоваться шелк/AAV). В 200 мкл ПЦР-пробирку Смешайте в соотношении 1:1 (для использования черепной windows 1:4) водный Фиброин и AAV непосредственно перед применением. Аккуратно Пипетка решение и несколько раз тщательно смешать Фиброин и AAV.
3. Держите шелк/AAV смесь на льду перед использованием.

3. Подготовка оборудования для изготовления и хранения шелк/AAV-покрытием устройств

1. Закупить оборудование для покрытие оптических волокон и градиент-индекс (GRIN) линзы (рисунки 1, 2).
   1. Постройте стабильное обойма держателя. Провести керамические наконечники, отверстия 1,25 мм в блоке ¼" листовой акрил. Выпускных отверстий для вставки винты со стороны провести наконечники на месте.
      Примечание: Для этой цели может использоваться любой зажим.
   2. Позиция манипулятора с суб-миллиметровой точностью для перемещения оптических волокон (стереотаксического аппарата или других микроманипулятор точности).
   3. Соберите стабильного держатель для размещения microinjector.
   4. Позволяет визуализировать оптических волокон и шелковые капли стереоскоп.
   5. Положение источника света для освещения оптических волокон.
2. Подготовка оборудования для покрытия головы windows (Рисунок 3).
   1. Выберите любой P10 дозаторов.
   2. Получите контейнер с крышкой.
      Примечание: Любой контейнер с дном силиконовые предлагается — мягкое дно способствует, подняв черепной windows.
3. Подготовка оборудования для хранения готовой имплантатов (рис. 4).
   1. Получите небольшой (1-5 L) вакуумной камеры.
   2. Убедитесь, что есть пространство для хранения имплантатов в холодильнике 4 ° C.

4. Примените фильм шелк/AAV для устройств

1. Покрытие оптических волокон диск фокуса выражение на кончике волокна
   1. Подготовьте хронический волокна имплантантов как описано⁴.
   2. Перед использованием промыть имплантаты с этанолом, а затем с ультрачистая вода для обеспечения того, чтобы чистые оптических волокон.
      Примечание: Шелковые фильмов придерживаться более надежно очистить стеклянных поверхностей.
   3. Подготовьте устройство провести волокна втулки. Для типичных 1,25 мм диаметр втулки использование блока ¼ дюйма акриловый, с ~1.3 мм отверстия и постучал стопорные винты, въезд со стороны отверстие имплантаты твердо в месте (Рисунок 1A).
   4. Крепление держателя обойма в стереотаксического аппарата (или раствор любые манипуляции с точностью субмиллиметровом) оснащены microinjector. Установите держатель обойма выше microinjector и применять смесь шелк/AAV снизу.
      Примечание: Это потому, что приложения больших объемов сверху привело к шелк/AAV, который не был ограничен к кончику. Однако применение многих небольших последовательных томов сверху или снизу может производить AAV/шелк депозитов, которые приурочены к кончику (хотя мы предпочитаем применять ниже).
   5. Вытащите Стандартный внутричерепных инъекций пипетку из боросиликатного стекла капилляров.
      1. Чтобы сделать его легче
      2. Производить инъекции наконечник с чистой плоским наконечником нужного диаметра, удерживая одной пипетки в каждой руке и использовать толще часть конуса на одной пипетки набрать другой пипеткой в месте желаемых перерыва.
      3. Аккуратно протрите взад и вперед в распиловки движения (метод забил на стекло).
      4. После забив пипеткой, приложите мягкое давление до кончика забил пипетку с телом другой дозатор для обеспечения порвать.
   6. Расположите стереоскоп дать четкое представление о волоконно-оптических лица.
      Примечание: Увеличение должно быть достаточно точно позиционировать инъекции пипетку выше лицо оптических волокон.
   7. Вставьте держатель с мозга стороной вниз волоконно-оптических волокна имплантатов.
   8. Загрузите инъекции пипетку с решением шелк/AAV, что касается любых стандартных внутричерепных инъекций⁵. Загрузите сумма, необходимая для количество имплантатов, предпринимаются, плюс ~ 30% дополнительно для размещения потери из-за засорения пипетки. Например если 10 имплантаты изготавливаются, затем загрузить с 100 nL депозиты и вывести мкл ~1.3.
      Примечание: Шелк/AAV может сухой на наконечник пипетки между извержений, которые могут засорить пипеткой. Большого диаметра пипетки (50-100 мкм) имеют меньше шансов забить. Сабо могут быть смещены нежной чистки вниз кончиком пипетки с мокрой бумаге алкоголя или протрите тампоном.
   9. Маневр инъекции пипетки, до тех пор, пока он трогательно или почти трогательно центре поверхности оптического волокна. Извлечь 10-20 nL шелк/AAV решения. Снять пипеткой.
      Примечание: Стоимость доставки не является критическим, но типичный ставки являются 5-20 nL/сек.
   10. Соблюдать болюс шелк/AAV на плоской поверхности, которая появляется в виде жидкого купол, который сохнет Плоская пленка в течение ~ 1 мин (рис. 1B).
   11. Повторите шаги 4.1.9-4.1.10 до тех пор, пока нужное количество шелка/AAV на хранение (в общей сложности 20-200 nL для большинства приложений). При подготовке нескольких имплантатов, применять шелк/AAV для одного имплантата и затем перейти к пальто других имплантантов, прежде чем вернуться к первой.
   12. Разрешить 1 h для сушки перед перемещением имплантатов.
   13. Вакуумные пересушивается ночлег в ~ 125 Торр (-25 в. Hg), 4 ° C. Сделать это, поместив весь обойма держателя в вакуумной камере.
   14. Оцените, форму и положение результате шелковые фильма под микроскопом мощных. Убедитесь, что фильмы, ограничиваются кончик поверхности оптического волокна, быть сравнительно тонкий (> 100 мкм) и симметрично (рис. 1 c).
       Примечание: Большие или асимметричные шелк/AAV фильмов может выбить из волокна во время имплантации (рис. 1 d). Наиболее распространенной причиной проблем проистекает из применения единого больших объемов, вместо того, чтобы последовательное применение многих небольших объемов.
2. Покрытие с коническими оптических волокон выражение езды вдоль оси волокна
   1. Получить конический волоконно-оптических имплантатов и выполнить шаги 4.1.2-4.1.8, за исключением того, что коническая волокна позиционируется боково, таким образом, что это перпендикулярно инжектор (рисунок 2A). Позиция форсунки выше конические волокна.
      Примечание: Загрузкой жидких капель на конической волокна позы добавил проблем, потому что поверхностное натяжение, как правило, вызывают капельки перейти обратно на пипетку инъекций или мигрировать вверх конические волокна. Меньше инъекции пипетки (диаметр 30-50 мкм) помогают преодолеть эту проблему, но увеличить риск того, что инъекции пипетки будет забивать. Из-за поверхностного натяжения капельки склонны придерживаться области большой площади поверхности, поэтому оптимальный инъекции Пипетка размер зависит от размера конические волокна и один терпимость к иногда забивают.
   2. Положение пипеткой шелк/AAV инъекции против стороны оптического волокна в начале конуса. Убедитесь, что инъекции пипеткой соприкасается оптического волокна.
   3. Извлечь 20 nL шелк/AAV для запуска процесса покрытия. Убедитесь, что капли придерживается волоконно-оптических и остается на стыке пипеткой волокна. Аккуратно фитиль капелька в конце кончика волокна как шелк/AAV высохнет (~ 45 s). Держите впрыскивая пипеткой контакт с сушки капли, чтобы избежать засорения наконечник пипетки.
      Примечание: Каждый депозит должен покрыть примерно 400 мкм конические волокна (рис. 2B).
   4. Когда почти полностью высохнет первый Болус, извлечь еще 20 nL и продолжить влагу капелька вдоль конуса.
      Примечание: Жидкий шелк будет придерживаться сушеный Шелкового, анкерные один конец капельки виде дозатор перемещается вдоль конуса.
   5. Повторите шаг 4.2.4 эжекционные небольшое количество шелка/AAV, и постепенно Рисование решение вверх в сторону конуса. 5-6 выбрасывания достаточно для прохождения поверхности 2,5 мм конус.
   6. Водить более равномерное выражение вокруг всех сторон волокна, поверните волокна и повторите шаги 4.2.2-4.2.5 до тех пор, пока необходимое количество шелка/AAV была передана.
   7. Если висит прядь из сушеный Шелкового/AAV выходит за пределы кончика волокна, тщательно стренгового с ножницами или используйте пипетку отстрела согнуть стренги обратно и придерживаться конусности волокна.
   8. Разрешить 1 h для сушки перед перемещением имплантатов.
   9. Вакуумные пересушивается ночь при 4 ° C. Держатель весь обойма могут быть помещены в вакуумной камере.
   10. Оцените, форму и положение результате шелковые фильма под микроскопом мощных.
       Примечание: Пленки не должны быть полностью однородным, но не должны шишки, которые простираются более чем 100 мкм за пределами поверхности волокна для сведения к минимуму повреждения окружающих тканей во время имплантации (рис. 3 c). Чтобы свести к минимуму размер фильма, важно, что каждая капля полностью сухой, прежде чем последующие депозиты производятся.
3. Покрытие улыбкой объектив имплантаты
   1. Получить улыбкой линзы^6,7 и повторите шаги 4.1.2-4.1.8. Инжектор может быть установлен выше.
   2. Месторождения шелк/AAV в одном отстрела (1 мкл для объектива диаметром 1,0 мм).
      Примечание: Это даст купол жидкости, которая придерживается облик линзы и сушит произвести равномерную пленку (толщиной 100-200 мкм). Однако в случае, если один большой отстрел сохнет неравномерно и производит фильм, который толще по краям линзы улыбкой, попробуйте внести депозит, несколько мелких капель (100-200 nL) в центре поверхности объектива (позволяя каждой капли высохнуть до сдачи на хранение Далее), чтобы обеспечить, что фильм будет стимулировать выражение в центре поля зрения.
   3. Разрешить 1 h для сушки перед перемещением имплантатов.
   4. Оцените, форму и положение результате шелковые фильма под микроскопом мощных обеспечить, что фильм покрывает поверхность объектива.
4. Покрытие стекла черепа
   1. Подготовка стекла черепной windows путем присоединения двух диаметром 3 мм раунд coverslips (№ 1 толщина) для одного окна диаметром 5 мм с оптическим клей (подробности см. в Goldey et al. 2014⁸).
   2. Сочетание шелка: вирус в соотношении 1:4, чтобы уменьшить общее количество шелка в фильме. Чрезмерное количество шелка не растворяются под черепной windows после имплантации. Титрование экспериментов может потребоваться определить отношение и объем, который дает профиль нужное выражение.
   3. Рука Пипетка 5 мкл капелька на поверхность coverslip 3 мм (мозг облицовки). Капелька следует разложить для покрытия всего стеклянной поверхности (рис. 3).
   4. Разрешить 2-3 ч для сушки перед перемещением windows.

5. хранение шелк/AAV-покрытием имплантатов

1. Магазин шелка/AAV-покрытием оптических волокон в охлажденный вакуумного эксикатора (~ 125 Торр, 4 ° C) до использования (рис. 4A).
2. Не храните черепной окон и линз Грина в вакууме, как большой шелковые фильмов, хранящихся под вакуумом не полностью растворить после имплантации. Имплантата черепной окон и линз улыбкой сразу после высыхания, или в течение дня производства, если хранится при атмосферном давлении и 4 ° C.

6. имплантации устройства

1. Готовить животных для имплантации, как описано⁴.
   1. Кратко анестезировать мышей с внутрибрюшинного введения кетамина/Ксилазина (100/10 мг/кг) и проверьте глубину обезболивание с помощью щепотку нежные ноги. Брить черепа в области имплантата и очистить скальп с йодом и алкоголя.
   2. Гора животных в стереотаксического устройство и дополнения анестезии, используя смесь кислорода и изофлюрановая (1-2%). Сделать надрез в коже головы над районом интерес и выполнять краниотомии достаточно большим, чтобы вместить имплантата.
2. Имплантат оптических волокон⁹ и microendoscope линзы¹⁰ согласно ранее опубликованных процедур. Ручка имплантатов с осторожностью, как шелк/AAV депозит можно сбил несовершенной краниотомии или имплантат, ловя на краю черепа. Медленно опустите имплантата в мозг (~ 2 мм/мин).
3. Имплантат черепной windows, которые описывают ранее⁸. Не трогайте мелованной стороне окна и избежать промывки окна с жидкостью, если выполнение принудительного кормления, как это может смыть вирус. Для достижения максимального выражения, выполните durotomy.

7. оценки выражения и устранение неполадок

1. Чтобы вычислить выражение вирусно выразил белков, позволяют ~ 2-3 недели для вируса привода выражение, а затем выполнить intracardial перфузии с параформальдегида 4% в фосфат буфер солевой раствор¹¹ и процесс мозговой ткани для люминесцентных микроскопия¹².
2. Вычислить выражение с помощью флуоресцентной микроскопии изображений выражения с меткой Флюорофор optogenetic белков.
3. Если уровень выражение является недостаточным, увеличьте количество вируса в покрытиях, увеличив общий объем покрытия шелк/AAV, или предпочтительно с помощью высокий титр вируса.

Результаты

Для оценки успеха шелк/AAV фильмов в автошколах выражение, мы увлажненную животных 2-3 недель после имплантации и подготовлен срезы мозга от региона интерес. Флуоресценции изображения с меткой Флюорофор optogenetic белков (ChR2-рекламы ЯФП) предоставил определенную степень сам...

Обсуждение

Использование шелк/AAV для выражения optogentic белков преодолевает ограничения подходов, которые в настоящее время используются. Хотя многие исследования успешно использовать AAV инъекции, чтобы выразить optogenetic белков, это сложно выровнять выражение кончик оптических волокон, регионы вокру...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aqueous silk fibroin	Sigma	5154-20ML	Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films
Microinjector to deposit silk/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III nanoliter injector
Manipulator to hold implants	Narashige	MM-33	Micromanipulator
Stereoscope to visualize silk deposits	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light
Vacuum chamber to store implants	Ablaze	N/A	3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber
Optional, implant holder for storage	N/A	N/A	To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block.
Optical fiber	Thorlabs	FT200EMT	Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants
Ferrules	Kientec	FZI-LC-230	LC Zirconia Ferrule for fiber implants
Various materials for manufacturing chronic fiber implants	Various	N/A	For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68).
Tapered fiber implants	Optogenix	Lambda-B	Tapered fiber implants
GRIN lenses	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	GRIN lenses
Small glass cranial windows	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Large glass cranial windows	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Small round cover glass, #0 thickness
Various materials for manufacturing cranial windows	Various	N/A	For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515.