JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول إنتاجية عالية للتقييم الوظيفي لتنشيط فعالية فيروس نقص المناعة البشرية وتخليصها من بروفيروسيس الكامنة الموصوفة ويطبق اختبار أثر التدخلات بشأن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط. وترد نتائج تمثيلية لتأثير الكمون عكس الوكلاء على النسخ التي يحركها لتر والربط.

Abstract

وما زال فيروس نقص المناعة البشرية المستعصية بسبب وجود مستودع للخلايا التي تأوي شكل مستقر والكامنة للفيروس، الذي يبقى غير مرئية للجهاز المناعي، وهي ليست موجهة بالعلاج المضاد للفيروسات الرجعية الحالية (عربة). قد ثبت النسخ والربط إلى تعزيز زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية-1 في استراحة خلايا CD4 + T. عكس الكمون باستخدام الكمون عكس وكلاء (لراس) في النهج "الصدمة وقتل" درست على نطاق واسع في محاولة لتطهير هذا الخزان ولكن لم تظهر حتى الآن أي نجاح في التجارب السريرية بسبب الافتقار إلى التنمية الصغيرة الكافية الجزيئات التي يمكن التشويش كفاءة هذا الخزان. ينص البروتوكول على المقدمة هنا طريقة لموثوقية وكفاءة تقييم الكمون عكس وكلاء (لراس) في النسخ فيروس نقص المناعة البشرية والربط. ويستند هذا النهج استخدام يحركها لتر لون مزدوج مراسل وكالة فرانس أنه في نفس الوقت يمكن قياس الأثر جيش الرب للمقاومة على النسخ والربط بالتدفق الخلوي. بروتوكول الموصوفة هنا كاف للخلايا ملتصقة، فضلا عن الخلايا الموجودة في التعليق. أنها مفيدة لاختبار عدد كبير من الأدوية في نظام إنتاجية عالية. الأسلوب من الناحية التقنية البسيطة لتنفيذ وفعالية من حيث التكلفة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام التدفق الخلوي يسمح تقييم سلامة الخلية وهكذا المخدرات سمية في نفس الوقت.

Introduction

وعلى الرغم من فعالية العلاج المضاد للفيروس طويلة الأجل، استمرت فيروس نقص المناعة البشرية في حالة كامنة بروفيروس متكاملة في الذاكرة خلايا CD4 + "تي"1. هيكل الكروماتين من فيروس نقص المناعة البشرية-1 5 ' المروج تكرار طويلة طرفية (لاتينية) وتعديلات جينية مثل مثلايشن هيستون وديسيتيلاتيون بالحمض النووي ميثيلترانسفيراسيس (دنمت) وهيستون ديسيتيلاسيس (هداك) هي آليات هامة تؤدي إلى النسخي القمع ومن ثم التكامل بعد الكمون2،3. مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكمون عكس وكلاء (لراس) قد تم التحقيق لفعاليتها للحث على إنتاج الفيروس في المختبر وخفية في المجراة من المصابين في استراحة CD4 + "تي" الخلايا4،،من56،7 ،8. بين لراس اختبارها، هداسي (مثبطات HDAC) وبيت برومودومين مثبطات (بيتيس) حمل ديكوندينسيشن الكروماتين والإفراج عن النسخ الإيجابية استطالة عامل ب (P-تيفب) على التوالي، والمؤدية إلى اللاحقة التخفيف من النسخي القمع في 5 ' لتر والتنشيط لفيروس نقص المناعة البشرية التعبير9،،من1011،،من1213. بيد أن حجم إعادة التنشيط التي حققتها هذه لراس كانت محدودة، كما لوحظ زيادة متواضعة فقط في الخلية المرتبطة أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (الرنا لنا)، يدل على النسخ الفيروسية، السابقين فيفو14،15. الأهم من ذلك، فشلت هذه لراس أيضا للحث على تخفيض تواتر الخلايا المصابة خفية.

فيروس نقص المناعة البشرية التعبير لا يجوز تقييده كذلك بعدم كفاءة الربط16 فضلا عن عيوب في الصادرات النووية لضرب المقسمة "فيروس الحمض النووي الريبي" (الرنا MS)17. وبالتالي، هناك حاجة إلى تحديد فئات جديدة من لراس التي هي أكثر قوة، ويمكن أن تؤثر على جوانب متميزة من الفيروسات التكامل ما بعد الإنتاج. وبالإضافة إلى ذلك، مطلوب وضع فحوصات الرواية التي تساعد على تحديد المركبات الأمثل لكفاءة عكس الكمون.

ويرد هنا، بروتوكول، التي تستخدم نهجاً الفائق للوظيفية تقييم أثر التدخلات على النسخ التي يحركها "لتر فيروس نقص المناعة البشرية" والربط. وباختصار، لون مزدوجة جديدة يحركها لتر مراسل نظام pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/دسريد (الشكل 1) يستخدم لتقييم إعادة تنشيط فيروس نقص المناعة البشرية بالتدفق الخلوي. في هذا المراسل الفلورسنت، التعبير عن أونسبليسيد فيروس نقص المناعة البشرية مرناً (4 كيلوبايت) يؤدي إلى التعبير البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)، بينما التعبير عن مرناً المقسمة (2 kb) سيؤدي إلى تعبير البروتينات الفلورية ديسكوسوما sp. الحمراء (دسريد). بإيجاز، استخدمنا بروتين فلوري انصهار الحياة الفطرية-اجفب، gp140unc. اجفب، حيث كان وضع تسلسل الترميز اجفب في الإطار مع نموذج الأمم المتحدة ملصوق ومبتورا المغلف (الحياة الفطرية). وأدخلت تغييرات يجتذ الموقع الانقسام ومنع الانفصال من الحياة الفطرية في gp120 و gp41-اجفب، واقتطاع البروتين gp160 قبل المجال transmembrane خلق تناظرية الحياة الفطرية القابلة لذوبان، مما يسهل الطي الصحيحة و التعبير عن اجفب. عند التعبير داخل خلية، يموضع Rev لنواة حيث أنها تتوسط الصادرات النووية هيولى من 4 كيلو بايت الحياة الفطرية مرناً عن طريق التفاعل مع عنصر استجابة القس (رر). الاقتطاع من الحياة الفطرية لا يضر رر، التي تقع بين gp120 و gp41، وموقع الوصلة 3 ' A7. وفي هذا النظام، الربط في فيروس نقص المناعة البشرية-1 لصق المانحة 4 (SD4) ولصق يقبلون 7 (SA7) النتائج في إنتاج 2 ك. بايت تنصهر مرناً ترميز بروتين Rev غير وظيفية اقتطاع في 38 من الأحماض الأمينية للبروتينات الفلورية دسريد، RevΔ38-دسريد. بإيجاز، كان دسريد إدراج إكسون 2nd من رؤيا في الأحماض الأمينية 38 بتداخل ملحق18. لتسهيل الصادرات النووية مرناً أونسبليسيد، transfected ناقل تعبير الثدييات ترميز Rev (بكمف-القسNL4.3) كان يشترك مع بناء مراسل الفلورسنت (الشكل 2). هذا البناء الفريد مراسل الموصوفة هنا مفيدة في تقييم الفائق لفيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط، دون الحاجة إلى استخدام النواقل الفيروسية.

Protocol

ملاحظة: التحول وتسلسل الإجراءات للاستنساخ، ناقش18،19في أماكن أخرى. البروتوكولات هنا تبدأ من تعداء ناقلات التعبير الثدييات (الشكل 3).

1-تعداء الخلايا HEK293T مع مراسل اللون المزدوج بناء

  1. زراعة الخلايا HEK293T في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) وتستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين (100 U/mL) ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل) في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية. بعد ذوبان الجليد، تجارب الخلايا HEK293T مرور 2-3 مرات قبل استخدامها في تعداء. وهذا سيعطي الوقت الخلايا للتعافي من الإجراء ذوبان.
    تنبيه: تلوث مفطورة من الثقافات الخلية لا يزال يمثل مشكلة خطيرة. الممارسة الجيدة للمختبرات والفحص الروتيني للثقافات الخلية ضرورية لتقليل خطر التلوث مفطورة، وتجنب نشر20.
  2. تقسيم الخلايا 1:2 يوم واحد قبل البذر وتحويلها إلى الطازجة دميم المتوسطة. زراعة الخلايا ح 24 في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
  3. إزالة المتوسطة من قارورة بتطلع اليوم قبل تعداء، وتغسل الخلايا مع دولبيكو للفوسفات مخزنة (دببس) المحلول الملحي خالية من الكالسيوم (Ca2 +) والمغنيسيوم (Mg2 +) لإزالة آثار المصل.
  4. الاستغناء عن 5 مل محلول يدتا التربسين (0.05%-10 ملم في برنامج تلفزيوني) في سفينة الثقافة ووضعه في 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لمدة 2 إلى 5 دقائق.
  5. عندما يتم فصل الخلايا، إضافة 5 مل دميم وتستكمل مع 10% (v/v) FBS تمنع زيادة النشاط التربسين التي قد تلحق الضرر الخلايا.
  6. ريسوسبيند بلطف من بيبيتينج تعليق خلية صعودا وهبوطاً لكسر في كتل.
  7. تضعف الخلايا 01:10 بوصمة عار تريبان الأزرق (0.4 في المائة).
  8. عد الخلايا الحية التي لا يستغرق تريبان الأزرق باستخدام مجهر (10 x الهدف) وهايموسيتوميتير.
  9. حساب عدد الخلايا قادرة على البقاء في المليلتر بأخذ متوسط عدد الخلايا وضرب من قبل 10,000 ومعامل التخفيف (01:10) من تريبان الأزرق بوصمة عار.
  10. لوحة 2 × 104 خلايا في 100 ميكروليتر من دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS دون المضادات الحيوية في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا ح 24.
  11. لكل بئر، تمييع 400 نانوغرام pLTR.gp140/EGFP. RevD38/دسريد، 20 نانوغرام من القس بكمفNL4.3 و 100 نانوغرام من بكمف-Tat101AD8-"علم الحمض النووي" في 50 ميكروليتر من المصل المتوسطة الحرة. المزيج بلطف. لإجراء التجارب دون تأت، استخدم مطابقة فارغة تأت متجه pcDNA3.1 (-).
    ملاحظة: ينصح بشدة استخدام الحمض النووي خالية من الذيفان. لذلك، تعد خالية من الذيفان الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية ميدي أو ماكسيبريب في حمض النووي. تحديد نقاء الحمض النووي عن طريق قياس نسبة OD 260/280، التي ينبغي أن تكون بين 1.7 و 1.9.
  12. خلط الكاشف الدهون بلطف قبل استخدام، ثم يضعف ميكروليتر 0.65 في 50 ميكروليتر من المصل المتوسطة الحرة. المزيج بلطف واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. الجمع بين الحمض المخفف مع الكاشف الدهون المخفف.
  14. المزيج بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قد يبدو الحل الملبدة بالغيوم.
    ملاحظة: تابع إلى الخطوة 1، 15. خلال 30 دقيقة.
  15. الاستغناء عن 100 ميكروليتر كل بئر المجمعات الحمض النووي كاشف دهن دروبويسي أعلى الخلايا.
  16. المزيج بلطف هزاز لوحة ذهابا وإيابا.
  17. احتضان لوحة ح 5 في 5% CO حاضنة هوميديفيد2 في 37 درجة مئوية.
    1. كل رد فعل مزيج غير كافية تعداء بئر واحدة (96-أيضا). ضبط مقدار وحجم المكونات وفقا للعدد من المخدرات وتركيبة التي سيتم اختبارها، وحسابات للاختلافات بيبيتينج. وعادة ما يتم اختبار كافة الشروط في تريبليكاتيس.
    2. ترانسفيكت آبار إضافية مع 100 نانوغرام من يحركها CMV بلازميد اجفب ودسريد في التعبير عن الحمض النووي لأغراض التعويض.

2-معاملة Transfected HEK293T الخلايا مع الكمون عكس وكلاء

ملاحظة: قبل كل فحص، تحديد الحالة الفسيولوجية لكل جيش الرب للمقاومة عن طريق قياس صلاحية الخلايا بعد التعرض لجرعة عالية ومنخفضة من المخدرات مع خلية انتشار المقايسة.

  1. تمييع كل جيش الرب للمقاومة إلى تركيز العمل المناسبة مع متوسط النمو (مثل، 1 ميكرومتر ل JQ1(+)).
    تنبيه: إعادة تشكيل الأدوية المجففة بالتبريد مع المذيب المناسب لتركيز من 10 ملم. تخزين جميع الأسهم لراس في-80 درجة مئوية واحدة استخدم قاسمة (5 ميكروليتر في كل) تفاديا لتكرار دورات ذوبان التجميد.
  2. بعناية نضح المتوسطة تعداء مع القنوات المتعددة واستبدال 100 ميكروليتر المتوسطة التي تحتوي على جيش الرب للمقاومة المناسبة (الجدول 1). إضافة المتوسطة بلطف جداً جنبا إلى جنب مع جدار البئر لتجنب فصل الخلايا HEK293T ترانسفيكتيد، التي هي معروفة لفصلها بسهولة من سطح لوحة الثقافة.
  3. احتضان لوحة ح 48 في 5% CO حاضنة هوميديفيد2 في 37 درجة مئوية.

3-تلطيخ Transfected الخلايا مع صبغة الجدوى يمكن حلها لتحليل التدفق الخلوي

تنبيه: إزالة الخلايا الميتة والحطام ضروري للقضاء على إيجابيات كاذبة، والحصول على نتائج ذات جودة أعلى.

  1. فصل الخلايا في وسائل الإعلام استخدام 100 ميكروليتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كل بئر وقبل بلطف بيبيتينج صعودا ونزولاً (5 مرات ~) مع القنوات المتعددة، مع تجنب مزبد لوسائل الإعلام. إذا لزم الأمر، قم بفصل الخلايا من لوحة استخدام 35 ميليلتر لكل بئر الحل يدتا التربسين (0.05%-10 ملم في برنامج تلفزيوني) وتفرخ 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية، قبل تحييد مع المتوسطة التي تحتوي على المصل.
  2. نقل الخلايا إلى لوحة الخامس-أسفل 96-جيدا.
  3. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ز في 4 درجات مئوية، ثم نضح المتوسطة/برنامج تلفزيوني بعناية دون لمس الخلايا.
  4. تغسل الخلايا مرة واحدة على الأقل مع 200 ميكروليتر من البروتين/المصل مجاناً برنامج تلفزيوني.
  5. الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية بإمالة اللوحة وإزالة المخزن المؤقت يغسل دون لمس الخلايا.
  6. يعد إيجاد حل عملي لصبغ صلاحية يمكن حلها بتمييع صلاحية صبغ 1: 1000 في البروتين/المصل مجاناً برنامج تلفزيوني. إعداد 50 ميليلتر من وصمة عار المخفف كل بئر.
    ملاحظة: الجدوى الأصباغ متوفرة في مجموعة من الألوان مناسبة للاستخدام مع أجهزة الليزر الأزرق والأحمر والبنفسجي. إعداد حل أسهم لصبغ صلاحية يمكن حلها قبل ريسوسبيندينج قنينة واحدة من الصبغة المجففة بالتبريد (المكون A) مع محرك القرص الصلب (العنصر ب) 50 ميكروليتر اللامائى [دمس]. مخزن في-20 درجة مئوية في الكوة استخدام الفردي (1 ميكروليتر في كل)، محمية من الضوء.
  7. إضافة 50 ميكروليتر من الصبغة صلاحية المخفف لكل بئر وخلط الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع القنوات المتعددة.
  8. وصمة عار لمدة 10-15 دقيقة على 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
  9. أغسل 1-2 مرات مع 150 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (برنامج تلفزيوني مع يدتا الزلال ومم 2 الأبقار 1%).
  10. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  11. إصلاح الخلايا مع 100 ميكروليتر من طازجة 1% فورمالدهايد في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 10-15 دقيقة في 4 درجات مئوية في الظلام.
    تنبيه: الفورمالديهايد سامة جداً. إعداد 1% فورمالدهايد الحل في غطاء دخان لتجنب استنشاق أثناء ارتداء القفازات ونظارات السلامة للحماية.
  12. تغسل الخلايا 1-2 مرات مع 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  13. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  14. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 70 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. يمكن تخزين خلايا ثابتة عند 4 درجة مئوية في الظلام للتحليل في اليوم التالي في سيتوميتير تدفق.

4-اجفب والقياسات دسريد بالتدفق الخلوي وتحليل البيانات

ملاحظة: تحليل فيروس النسخ (% اجفب) والربط (% دسريد) في سيتوميتير تدفق. تصفية العينة قبل التشغيل مع خلية-مصفاة ميكرومترات 70 أو 100 ميكرومتر النايلون شبكة لتجنب انسداد الفوهة.

  1. بدء تشغيل سيتوميتير والكمبيوتر على الأقل 10 دقيقة قبل استخدامها للتأكد من أشعة الليزر الاحماء.
  2. قبل تشغيل عينات والبدء في الحصول على البيانات، ملء خزان غمد مع المحلول الملحي 0.9% وضمان أن تتم إضافة قرص تحت كلوريت الصوديوم إلى خزان النفايات.
  3. فحص الخلية تدفق لفقاعات الهواء.
  4. تحقق من أن كاشفات وعوامل التصفية المناسبة للتجربة.
    ملاحظة: بالنسبة اجفب، استخدم الليزر الأزرق (488 نانومتر) وممر الموجه 530/30، بينما يتم الكشف عن استخدام الليزر الأصفر على النحو الأمثل إكسبريس دسريد (561 nm) وممر الموجه 610/20. ليزر أزرق (488 نانومتر) ويمكن أيضا استخدام ممر الموجه 610/20 للكشف عن التعبير دسريد.
  5. التحقق من الأداء سيتوميتير وحساسية عبر أجهزة الكشف عن طريق تشغيل الخرز المعايرة.
  6. ضبط الأمام (منتدى التعاون الأمني-أ) والجانب مبعثر (SSC-أ) الفولتية مع أونستاينيد عينة حيث يكون السكان الرئيسية التي تظهر على الشاشة ووضوح ملموس.
    ملاحظة: منتدى التعاون الأمني (ضوء متناثرة إلى الأمام) مقياس الضوء الحيود في زاوية مسطحة، الذي يعتمد على حجم الخلية (خلية المساحة أو الحجم)، بينما SSC (الجانب-متناثرة الضوء) هو قياس حيود الضوء في زاوية الحق، الذي يتناسب مع مستوى الخلية والتعقيد الداخلي.
  7. إجراء تعويض اليدوي أو التلقائي باستخدام عينات الملطخة بمفرده كفالة امتداد الحد الأدنى من اجفب + السكان إلى كاشف دسريد والعكس بالعكس.
    تنبيه: ولأغراض التعويض، استخدام عينة خلايا معربا عن كل من البروتين الفلورسنت لون واحد، فضلا عن خلايا منفردة ملطخة بصبغة الجدوى يمكن حلها. لا تستخدم الخرز التعويض فيتك والمؤسسة العامة للتعويضات البروتينات الفلورية اجفب ودسريد بسبب الخصائص الطيفية المختلفة. يجب أن تكون ضوابط التعويض مشرق بما فيه الكفاية لحل السكان الإيجابية والسلبية.
  8. خلق المؤامرات وتعيين غيتس fluorescence ناقص واحد (FMO) عناصر التحكم باستخدام.
  9. حيازة وتسجيل الحد ني أحداث خلية صالحاً 10,000 كل عينة. تشغيل عينات بسرعة متوسطة أو منخفضة لتجنب doublets مرورا باعتراض الليزر. استخدام نبض الهندسة النابضة مثل التعاون بين بلدان الجنوب-أ مقابل ح ال SSC للقضاء على دوبليتس. تحقق الاستقرار للتشغيل برسم الوقت مقابل SSC-أ لترى كيف حتى يتم التدفق أثناء التشغيل.
  10. في نهاية الشوط، تنظيف فلويديكس الخلوي التدفق مع وكلاء التنظيف المركزة ثم الماء لمدة 5 دقائق.
  11. إيقاف تشغيل النظام، التخلص من النفايات وإعادة ملء خزان غمد بعد اكتساب.
  12. تحليل البيانات استخدام برنامج تحليل بيانات تدفق الخلوي. استبعاد الخلايا الحطام واجمه (دوبليتس) استناداً إلى مبعثر إلى الأمام والجانب، ثم القضاء على الخلايا الميتة استخدام صلاحية صبغ وصمة عار (سلبية السكان = الخلايا الحية). تحديد الخلايا وإذ تعرب عن اجفب ودسريد (الشكل 4)، فضلا عن النسبة المئوية للمنتج المقسمة دسريد/(DsRed + EGFP) (الشكل 5).
  13. تحديد تأثير جيش الرب للمقاومة على النسخ فيروس نقص المناعة البشرية، والربط بمقارنة خلايا غير المعالجة والخلايا المعرضة لفرد أو مجموعة من لراس (الشكل 5).

النتائج

وتظهر نتائج الممثل في الشكل 5 للتعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 أونسبليسيد (اجفب)، وتقسم المنتجات (دسريد) بعد المعالجة بمثبطات برومودومين JQ1. JQ1(+) وتأت زيادة كبيرة في النسبة المئوية للخلايا معربا عن اجفب (FC 2.18 و 4.13 عبر [دمس] على التوالي; n = 3) يدل على النصوص...

Discussion

نظراً لصعوبة قياس تنشيط الفيروس السابقين فيفو، طائفة واسعة من المختبر ووضعت نماذج مع مرور الوقت من أجل دراسة زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية بما في ذلك خفية المصابة خطوط الخلايا T (J-لاتس لاتفيا، ACH2، U1)، النماذج الأولية للعدوى الكامنة ليستريح ( نماذج O'Doherty، لوين، وغرين والمشقوقه) أو خل?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

أيد هذا العمل المشروع منحة APP1129320 ومنحة برنامج APP1052979 من "تمويل لأستراليا". ونحن نشكر الدكتور آدم ويتلي، الدكتور ألكسندر مارينا، والدكتور جيني L. أندرسون وميشيل يوسف لي لتقديم المشورة والبنيات الأساسية للنجاح في إنجاز هذا العمل. ونشكر أيضا موظفي مرفق تدفق DMI لتقديم المشورة والمساعدة السخية للحفاظ على سيتوميتير تدفق المستخدمة في هذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)ATCCCRL-3216Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serumGibco10099-141Origin Australia
Penicillin-StreptomycinSigmaP4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumGibco14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum mediumGibco31985-070Serum free medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)Cayman Chemical11232Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)RemelHA15/R30852701Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)TRCP180500Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow cytometry reagents
LSR FortessaBD BiosciencesFlow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR IIBD BiosciencesFlow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Sheath solutionChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L water
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)LabcoSODHYPO-5LConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7xMPBioIM76670Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)Corning430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)Costar3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)Costar3896
Centrifuge tubes (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterileCorningCLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterileCorningCLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterileCorningCLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterileCorningCLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer capCorning35223512 x 75 mm style, 70 mm
Nylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titertube Micro test tubes, bulkBIO-RAD2239391microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without capCorning35200812x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test TubesCorning352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MicroscopeNikon TMS310528
Centrifuge 5810R refrigeratedEppendorf5811000487with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate readerBMG LabtechN/APlate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
NameCompanyCatalog NumberComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data AnalysisBMG LabtechMARSFLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011version 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7version 7.0c

References

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved