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Résumé

Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.

Résumé

Le VIH reste incurable en raison de l’existence d’un réservoir de cellules qui recèle une forme stable et latente du virus, qui reste invisible pour le système immunitaire et n’est pas ciblée par l’antirétroviraux actuels (cART). Transcription et épissage ont démontré que renforcer la latence du VIH-1 au repos des cellules T CD4 +. Inversion de la latence de l’utilisation d’agents de renversement de latence (ALE) dans l’approche de « choc et d’abattage » a été largement étudiée dans le but de purger ce réservoir mais n’a jusqu'à présent pas montré aucun succès dans les essais cliniques en raison du manque de développement des petits adéquate molécules qui peuvent perturber efficacement de ce réservoir. Le protocole présenté ici fournit une méthode pour efficacement et de façon fiable évaluer les agents de renversement de latence (alr) sur la transcription du VIH et l’épissage. Cette approche repose sur l’utilisation d’un journaliste bicolore axée sur le LTR qui permet de mesurer simultanément les effets d’un LRA transcription et épissage par cytométrie en flux. Le protocole décrit ici est suffisant pour les cellules adhérentes, mais aussi les cellules en suspension. Il est utile pour tester un grand nombre de médicaments dans un système à haut débit. La méthode est techniquement simple à mettre en œuvre et économique. En outre, l’utilisation de la cytométrie permet l’évaluation de la viabilité cellulaire et toxicité des médicaments donc en même temps.

Introduction

Malgré un traitement antirétroviral à long terme efficace, le VIH persiste dans un état latent comme un provirus intégré dans la mémoire de cellules T CD4 +1. La structure de la chromatine du VIH-1 5 « promoteur de longue répétition terminale (LTR) et des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et désacétylation par ADN méthyltransférases (DNMT) et les histones désacétylases (HDAC) sont des mécanismes importants conduisant à la répression transcriptionnelle et donc post-intégration latence2,3. Une grande variété d’agents d’inversion (ALE) de la latence a été étudiée pour leur efficacité induire la production de virus in vitro et in vivo de manière latente infectés au repos T CD4 + cellules4,5,6,7 ,,8. Parmi les LRA testés, HDACi (inhibiteurs d’HDAC) et inhibiteurs de la côté du pari (BETis) induisent la décondensation de la chromatine et la libération de la transcription positive élongation facteur b (P-TEFb) respectivement, conduisant aux soulager de la transcription répression à la 5' LTR et activation du VIH expression9,10,11,12,13. Toutefois, l’ampleur de la réactivation atteindre par ces collectivités locales et régionales ne se limitait qu’une modeste augmentation associée aux cellules unspliced VIH ARNm (nous RNA), indicatif de transcription virale, a été observée ex vivo14,15. Ce qui est important, ces collectivités locales et régionales a également omis d’induire une diminution de la fréquence des cellules infectées de façon latente.

Expression du VIH peut être encore plus restreint par épissage inefficace16 ainsi que les défauts dans les exportations nucléaires de multiplier épissés ARN VIH (MS RNA)17. Ainsi, l’identification de nouvelles catégories de collectivités locales et régionales qui sont plus puissants et peuvent affecter des aspects distincts de virus production après intégration sont nécessaires. En outre, le développement de nouveaux tests qui aident à définir les composés optimales pour contrer efficacement les temps de latence est nécessaire.

Ici, un protocole est présenté, qui utilise une approche de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de l’impact des interventions axées sur le VIH LTR transcription et épissage. En bref, un nouveau duel axée sur le LTR couleur journaliste système pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figure 1) est utilisé pour évaluer la réactivation du VIH par cytométrie en flux. Dans ce journaliste fluorescent, l’expression de l’ARNm de VIH unspliced (4Ko) conduit à l’expression de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), tandis que l’expression de l’ARNm épissé (2KO) conduirait à Acropora SP rouge (DsRed) expression de la protéine fluorescente. En bref, nous avons utilisé une protéine de fusion Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, où la séquence codante de EGFP a été mises en image avec une forme non clivée et tronquée de l’enveloppe (Env). Modifications ont été apportées pour l’ablation du site de clivage empêche la dissociation des Env en gp120 et gp41-EGFP et de tronquer les protéines gp160 avant le domaine transmembranaire créent un analogue Env soluble qui facilite le pliage correct et expression de EGFP. Lors de l’expression dans une cellule, Rev se localise dans le noyau où il intervient dans les exportations nucléaires et cytoplasmiques 4Ko env ARNm via l’interaction avec l’élément sensible de rev (RRE). La troncation d’Env ne compromet pas le RRE, qui se trouve entre le site d’épissage A7 3' gp120 et gp41. Dans ce système, épissure au VIH-1 donneur 4 (SD4) d’épissure et épisser accepteur 7 (SA7) entraîne la production d’un 2KO ARNm codant pour une protéine Rev non fonctionnels sont tronquée lorsque l’acide aminé 38 fusionnée à la protéine fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. En bref, DsRed a été inséré dans l’exon 2nd de Rev à acides aminés 38 par chevauchement extension18. Afin de faciliter l’exportation nucléaire des ARNm unspliced, un vecteur d’expression mammifère encodage Rev (cmvp-RevNL4.3) a été conjointement transfecté avec la construction de journaliste fluorescent (Figure 2). Cette construction unique journaliste décrite ici est utile dans l’évaluation de haut débit de transcription de VIH et d’épissage, sans la nécessité d’utiliser des vecteurs viraux.

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Protocole

Remarque : Procédures de clonage, séquençage et transformation sont traitées ailleurs18,19. Les protocoles aux présentes commencent de la transfection des vecteurs d’expression chez les mammifères (Figure 3).

1. la transfection de cellules HEK293T avec bicolore journaliste construire

  1. Cultiver des cellules HEK293T au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 μg/mL) dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C. Après décongélation, expériences de cellules HEK293T passage 2 ou 3 fois avant de les utiliser dans la transfection. Cela donnerait le temps de cellules pour récupérer de la procédure de décongélation.
    Mise en garde : La contamination des cultures de cellules de mycoplasmes demeure un problème grave. Bonnes pratiques de laboratoire et de tests de routine des cultures de cellules sont indispensables pour diminuer le risque de contamination par mycoplasmes et éviter la diffusion20.
  2. Fractionner les cellules 1:2 un jour avant de semer et de les transférer dans un milieu DMEM frais. Cultiver les cellules pendant 24 h dans une étuve à2 CO 5 % à 37 ° C.
  3. La veille de la transfection, retirer le support de la fiole par aspiration et laver les cellules avec tamponnée au phosphate (SPD) du sérum physiologique de Dulbecco sans calcium (Ca2 +) et magnésium (Mg2 +) pour éliminer les traces de sérum.
  4. Diluer 5 mL de solution de trypsine-EDTA (10 mM dans du PBS 0,05 %) dans le récipient de culture et placez-le à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2 à 5 min.
  5. Lorsque les cellules sont détachés, ajouter 5 mL de DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF encore inhibe l’activité de la trypsine qui peut-être endommager les cellules.
  6. Resuspendre doucement en pipettant également, la suspension cellulaire up et down pour briser les agrégats.
  7. Diluer les cellules 01:10 dans tache bleu trypan (0,4 %).
  8. Compter les cellules vivantes qui ne prennent pas place trypan bleus à l’aide d’un microscope (objectif x 10) et un hémocytomètre.
  9. Calculer le nombre de cellules viables par millilitre en prenant la moyenne du nombre d’éléments et en multipliant par 10 000 et par le facteur de dilution (01:10) depuis le bleu trypan tacher.
  10. Plaque de 2 x 104 cellules dans 100 μl de milieu DMEM supplémenté avec 10 % FBS sans antibiotiques dans une plaque à 96 puits à fond plat pendant 24 h.
  11. Pour chaque puits, diluer 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng du cmvp-RevNL4.3 et 100 ng du cmvp-Tat101AD8-drapeau ADN dans 50 μl de milieu sans sérum. Mélanger doucement. Pour les expériences sans Tat, utilisez un correspondant vide Tat vector pcDNA3.1 (-).
    Remarque : L’utilisation de l’ADN exempte d’endotoxine est fortement recommandée. Pour cela, préparer exempte d’endotoxine ADN à l’aide d’un kit de purification d’acides nucléiques midi ou maxiprep. Déterminer la pureté de l’ADN en mesurant le ratio 260/280 OD, qui devrait se situer entre 1,7 et 1,9.
  12. Mélanger le réactif de lipides doucement avant utilisation, puis diluer 0.65 μL dans 50 μl de milieu sans sérum. Mélanger doucement et laisser incuber 5 min à température ambiante.
  13. Combiner l’ADN dilué avec le réactif de lipides dilué.
  14. Mélanger doucement et laisser incuber pendant 20 min à température ambiante. La solution peut sembler nuageuse.
    Remarque : Passez à l’étape de 1,15. moins de 30 min.
  15. Pipeter 100 μL / puits des complexes ADN-réactif lipides goutte-à-goutte sur le dessus des cellules.
  16. Mélanger doucement en balançant la plaque avant et en arrière.
  17. Incuber la plaque pendant 5 h dans une étuve humide 5 % CO2 à 37 ° C.
    1. Chaque mélange réactionnel est suffisant pour une transfection de puits unique (96 puits). Ajustez le montant et volume des composants selon le nombre de médicaments et de combinaison qui serait testé et les comptes de variations de pipetage. Toutes les conditions sont habituellement testées en géométrie.
    2. Transfecter puits supplémentaires avec 100 ng de plasmide EGFP et ADN DsRed-Express pilotée par le CMV fins d’indemnisation.

2. traitement de HEK293T transfectées cellules avec une latence inversion des Agents

Remarque : Avant chaque essai, déterminer l’état physiologique de chaque Ars en mesurant la viabilité des cellules après une exposition à haute et basse dose du médicament avec analyse de prolifération cellulaire.

  1. Diluer chaque LRA à la concentration appropriée de travail avec le milieu de culture (p. ex., 1 μM pour JQ1(+)).
    Mise en garde : Reconstituer les médicaments lyophilisés avec le solvant approprié à une concentration de 10 mM. Magasin stock toutes les collectivités locales et régionales à-80 ° C dans une aliquote à usage unique (5 μL) afin d’éviter les cycles de gel-dégel répétés.
  2. Aspirer moyen de transfection avec un multicanal avec précaution et remplacer par 100 milieu μL contenant approprié LRA (tableau 1). Ajouter médium très doucement aux côtés de la paroi du puits afin de détacher les cellules HEK293T transfectées, qui sont connus pour détacher facilement de la surface de plaque de culture.
  3. Incuber les plaques pendant 48 heures dans une étuve humide 5 % CO2 à 37 ° C.

3. la coloration des cellules transfectées avec le colorant de viabilité Fixable pour analyse en cytométrie en flux

Mise en garde : Enlever les débris et les cellules mortes est essentiel pour éliminer les faux positifs et d’obtenir des résultats de haute qualité.

  1. Détacher les cellules dans les médias à l’aide de 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits et par doucement pipetage va-et-vient (~ 5 fois) avec un multicanal, tout en évitant de faire mousser des médias. Le cas échéant, détacher les cellules de la plaque avec 35 µL / puits d’une solution de trypsine-EDTA (10 mM dans du PBS 0,05 %) et en laissant incuber 5 min à 37 ° C, avant de neutraliser avec milieu contenant du sérum.
  2. Les cellules de transfert à une plaque de fond en V 96 puits.
  3. Faites tourner les cellules pendant 5 min à 500 x g à 4 ° C, puis aspirer soigneusement le support/PBS sans toucher les cellules.
  4. Laver les cellules au moins 1 fois avec 200 μL de sérum protéine libre PBS.
  5. Centrifuger à 500 g pendant 5 min à 4 ° C, puis jeter le surnageant en inclinant la plaque et en supprimant le tampon de lavage sans toucher les cellules.
  6. Préparer une solution de colorant de viabilité fixable par dilution au 1/1000 de colorant viabilité dans du PBS libre de protéine/sérum. Préparer 50 µL de la tache diluée par puits.
    Remarque : Colorants de viabilité sont disponibles dans une gamme de couleurs appropriés pour l’usage avec des lasers bleus, rouges et violettes. Préparer une solution de colorant de viabilité fixable par resuspendant un flacon de teinture lyophilisée (composant A) avec 50 μL de DMSO anhydre (composant B). Conserver à-20 ° C dans un aliquote de l’usage unique (1 μL), abri de la lumière.
  7. Ajouter 50 μL de la teinture de viabilité dilué dans chaque puits et mélanger les cellules par pipetage de haut en bas avec un multicanal.
  8. Détachant pendant 10-15 min à 4 ° C, abri de la lumière.
  9. Laver 1 ou 2 fois avec 150 μl de tampon de lavage (PBS 1 % bovine serum albumine et 2 mM EDTA).
  10. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
  11. Fixer les cellules avec 100 μL de fraîchement préparée 1 % de formaldéhyde dans le tampon de lavage pendant 10-15 min à 4 ° C dans l’obscurité.
    Mise en garde : Le formaldéhyde est très toxique. Préparer la solution de formaldéhyde de 1 % dans une hotte aspirante pour éviter toute inhalation tout en portant des gants et des lunettes de protection.
  12. Laver les cellules 1 - 2 fois avec 100 μL de tampon de lavage.
  13. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
  14. Resuspendre le culot dans 70 μL de tampon de lavage.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les cellules fixes pourraient être stockés à 4 ° C dans l’obscurité pour analyse le lendemain sur le cytomètre en flux.

4. EGFP et mesures DsRed par cytométrie en flux et analyse des données

Remarque : Analyser la transcription du VIH (% EGFP) et épissage (% DsRed) sur un cytomètre en flux. Filtrer l’échantillon avant la course avec une cellule-crépine 70 μm ou mailles de nylon 100 μm pour éviter d’obstruer la buse.

  1. Démarrer le cytomètre et l’ordinateur au moins 10 min avant de l’utiliser pour réchauffer les lasers.
  2. Avant exécution exemples et commençant d’acquisition de données, remplissez le réservoir de la gaine avec la solution saline à 0,9 % et faire en sorte qu’un comprimé d’hypochlorite de sodium est ajouté pour le réservoir à matières.
  3. Vérifier les cellules de circulation pour les bulles d’air.
  4. Vérifiez que les détecteurs et les filtres sont appropriés pour l’expérience.
    Remarque : Pour EGFP, utilisation de laser bleu (488 nm) et passe-bande 530/30, tandis que DsRed Express est parfaitement détecté en utilisant le laser jaune (561 nm) et passe-bande 610/20. Un laser bleu (488 nm) et passe-bande 610/20 peut également être utilisé pour détecter l’expression DsRed.
  5. Vérifier le cytomètre performance et la sensibilité à travers des détecteurs en exécutant les perles de l’étalonnage.
  6. Ajuster l’attaquant (FSC-A) et des tensions de dispersion (SSC-A) côté avec non souillées enregistré l’échantillon alors que la population principale est à l’écran et clairement discernable.
    Remarque : FSC (lumière diffusée vers l’avant) est une mesure de la lumière par diffraction dans un angle plat, qui dépend du volume de la cellule (cell surface ou taille), tandis que SSC (côté-la lumière diffusée) est une mesure de diffraction de la lumière à angle droit, qui est proportionnelle à granularité de la cellule et de la complexité interne.
  7. Effectuer une compensation manuelle ou automatique en utilisant les échantillons colorés à l’unique assurant des retombées minimes de population EGFP + dans la DsRed détecteur et vice versa.
    Mise en garde : À des fins d’indemnisation, utiliser un échantillon de cellules exprimant chacun de la protéine fluorescente de couleur unique, mais aussi les cellules colorées individuellement avec le colorant de viabilité réparable. Ne pas utiliser les perles de compensation FITC et PE pour EGFP et DsRed compensations de protéines fluorescentes en raison des caractéristiques spectrales différentes. Contrôles de compensation devraient être suffisamment lumineux pour résoudre positive et négative de la population.
  8. Créez des parcelles et définissez les portes à l’aide de fluorescence moins un contrôles (FMO).
  9. Acquérir et enregistrer un minimum de 10 000 événements de cellules viables par exemple. Exécution d’échantillons à vitesse moyenne ou basse pour éviter les doublets en passant par l’intersection de laser. Utiliser l’impulsion géométrie gating tels que SSC-A contre SSC-H pour éliminer les doublets. Vérifier la stabilité de la course et en temps / SSC-A pour voir que même le flux est pendant la course.
  10. À la fin de la course, nettoyer la fluidique de cytométrie en flux avec les agents de nettoyage concentrés puis d’eau de 5 min chacun.
  11. Arrêter le système, jeter les déchets et re-remplir le réservoir de la gaine après acquisition.
  12. Analyser les données à l’aide d’un logiciel d’analyse de données écoulement cytometry. Exclure les débris cellulaires et touffe (doublets) basé sur la diffusion vers l’avant et latérale, puis éliminer les cellules mortes à l’aide de la tache de colorant de viabilité (négatif population = cellules vivantes). Identifier les cellules exprimant EGFP et DsRed (Figure 4), ainsi que le pourcentage du produit épissé DsRed /(DsRed + EGFP) (Figure 5).
  13. Déterminer l’effet de la LRA sur la VIH transcription et épissage en comparant des cellules non traitées et les cellules exposées à la personne physique ou une combinaison des ALE (Figure 5).

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Résultats

Résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 5 pour l’expression de HIV-1 unspliced (EGFP) et épissé (DsRed) produits après le traitement par l’inhibiteur de la côté du JQ1. Fois JQ1(+) et Tat a augmenté significativement le pourcentage de cellules exprimant EGFP (2.18 et 4.13 FC au DMSO respectivement ; n = 3) indicatifs des transcriptions unspliced. Par ailleurs, JQ1(+) a considérablement augmenté le pourcentage de cellules exprimant...

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Discussion

Compte tenu de la difficulté de mesurer une réactivation du virus ex vivo, un large éventail d’in vitro modèles ont été développés au fil du temps afin d’étudier la latence du VIH, y compris de manière latente infectée lignées de cellules T (J-Lats, ACH2, U1), modèles primaires de l’infection latente de repos) O ' Doherty, Lewin, Greene et Spina modèles) ou des cellules T CD4 + pré-activé (Samir, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modèles) avec simple ronde ou réplication journaliste compétente v...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet APP1129320 et programme de subvention APP1052979 par le NHMRC australien. Nous remercions le Dr Adam Wheatley, Dr Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson et Michelle Y. Lee pour fournir les concepts essentiels et des conseils pour la réussite de ce travail. Nous remercions également le personnel de DMI Flow Facility pour leurs conseils et leur aide généreuse à maintenir le cytomètre en flux utilisé dans cette étude.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)ATCCCRL-3216Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serumGibco10099-141Origin Australia
Penicillin-StreptomycinSigmaP4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumGibco14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum mediumGibco31985-070Serum free medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)Cayman Chemical11232Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)RemelHA15/R30852701Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)TRCP180500Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow cytometry reagents
LSR FortessaBD BiosciencesFlow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR IIBD BiosciencesFlow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Sheath solutionChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L water
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)LabcoSODHYPO-5LConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7xMPBioIM76670Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)Corning430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)Costar3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)Costar3896
Centrifuge tubes (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterileCorningCLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterileCorningCLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterileCorningCLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterileCorningCLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer capCorning35223512 x 75 mm style, 70 mm
Nylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titertube Micro test tubes, bulkBIO-RAD2239391microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without capCorning35200812x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test TubesCorning352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MicroscopeNikon TMS310528
Centrifuge 5810R refrigeratedEppendorf5811000487with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate readerBMG LabtechN/APlate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
NameCompanyCatalog NumberComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data AnalysisBMG LabtechMARSFLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011version 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7version 7.0c

Références

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