Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing

Riepilogo

Un protocollo di throughput elevato per la valutazione funzionale di riattivazione efficiente HIV e clearance del provirus latenti è descritto e applicato dalla prova dell'impatto di interventi sulla trascrizione di HIV e di splicing. Risultati rappresentativi dell'effetto di latenza inversione agenti sulla trascrizione LTR-driven e splicing sono forniti.

Abstract

L'HIV rimane incurabile a causa dell'esistenza di un serbatoio di cellule che nutre forma stabile e latente del virus, che rimane invisibile al sistema immunitario e non è mirato dall'attuale terapia antiretrovirale (cART). Trascrizione e splicing sono stati indicati per rafforzare la latenza di HIV-1 nelle cellule T CD4 + di riposo. Inversione di latenza mediante l'uso di agenti di inversione di latenza (LRA) nell'approccio "shock and kill" è stata studiata estesamente nel tentativo di eliminare questo serbatoio ma finora non ha dimostrato alcun successo negli studi clinici a causa della mancanza di sviluppo di piccoli adeguato molecole che possono perturbare in modo efficiente questo serbatoio. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per attendibilmente ed efficientemente valutare gli agenti di inversione di latenza (LRA) sulla trascrizione di HIV e giunzione. Questo approccio si basa sull'uso di un reporter di doppio colore LTR-driven che consente di misurare contemporaneamente l'effetto di un LRA sulla trascrizione e splicing tramite flusso cytometry. Il protocollo descritto qui è adeguato per le celle aderenti, come pure le cellule in sospensione. È utile per il testing di un gran numero di farmaci in un sistema di alta velocità di trasmissione. Il metodo è tecnicamente semplice da implementare ed economicamente vantaggiosa. Inoltre, l'uso di citometria a flusso permette la valutazione di attuabilità delle cellule e così droga tossicità allo stesso tempo.

Introduzione

Nonostante la terapia antiretrovirale a lungo termine efficace HIV persiste in uno stato latente come un provirus integrato in memoria di cellule T CD4 +¹. La struttura della cromatina del HIV-1 5' promotore di ripetizione terminale lunga (litro) e modificazioni epigenetiche come metilazione dell'istone e deacetilazione di methyltransferases del DNA (DNMT) e istone deacetilasi (HDAC) sono importanti meccanismi che conducono alla repressione trascrizionale e così post-integrazione latenza^2,3. Una grande varietà di agenti inversione di latenza (LRA) è stata studiata per la loro efficacia per indurre la produzione di virus in vitro e in vivo da latente infettati riposo T CD4 + cellule^{4,5,6,7 ,8}. Tra gli enti locali e regionali testato, HDACi (inibitori HDAC) e scommessa bromodomain inibitori (BETis) inducono decondensazione della cromatina e rilascio della trascrizione positivo allungamento fattore b (P-TEFb) rispettivamente, che porta a successive alleviare il trascrizionale repressione a 5' LTR e attivazione di HIV espressione^{9,10,11,12,13}. Tuttavia, la grandezza della riattivazione raggiunta da questi enti era limitata, come è stato osservato solo un modesto aumento associato unspliced HIV mRNA (RNA noi), indicativo della trascrizione virale, ex vivo^14,15. D'importanza, questi enti anche non è riuscito a indurre una riduzione della frequenza delle cellule latente infettate.

L'espressione di HIV può essere ulteriormente limitata da splicing inefficiente¹⁶ , nonché i difetti in export nucleare di moltiplicare impiombato HIV RNA (RNA MS)¹⁷. Così, sono necessari identificazione nuove classi di enti locali e regionali che sono più potenti e possono interessare diversi aspetti di post-integrazione produzione del virus. Inoltre, lo sviluppo di nuovi saggi che aiutano a definire i composti ottimali per invertire in modo efficiente la latenza è richiesto.

Qui, un protocollo è presentato, che utilizza un approccio ad alta produttività per la valutazione funzionale dell'impatto degli interventi su trascrizionale LTR di HIV e splicing. In breve, un nuovo dual LTR-driven colore reporter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) viene utilizzato per valutare la riattivazione di HIV tramite flusso cytometry. In questo reporter fluorescente, l'espressione del mRNA di unspliced HIV (4 kb) conduce all'espressione migliorata della proteina fluorescente verde (EGFP), mentre l'espressione di mRNA splicing (2Kb) porterebbe all'espressione della proteina fluorescente di Discosoma sp. rosso (DsRed). In breve, abbiamo usato una proteina di fusione di Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, dove la sequenza codificante di EGFP è stata posizionata nel telaio con una forma non-spaccata e troncata della busta (Env). Le modifiche sono state introdotte per l'ablazione del sito di clivaggio impedendo la dissociazione di Env in gp120 e gp41-EGFP e troncare la proteina gp160 prima il dominio transmembrana creando un analogo solubile di Env, che facilita la piegatura corretta e espressione di EGFP. Al momento l'espressione all'interno di una cella, Rev si localizza nel nucleo dove media l'esportazione nucleare-citoplasmico di 4KB env mRNA tramite l'interazione con l'elemento sensibile rev (RRE). Il troncamento di Env non compromette la RRE, che si trova tra gp120, gp41 e A7 3' luogo della giuntura. In questo sistema, splicing a HIV-1 splice donatore 4 (SD4) e della giuntura acceptor 7 (SA7) risultati nella produzione di un 2 kb mRNA che codifica per una proteina non funzionale di Rev troncata all'amminoacido 38 fusa alla proteina fluorescente di DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed è stato inserito in essone 2^nd di Rev all'amminoacido 38 da sovrapposizione estensione¹⁸. Per facilitare l'esportazione nucleare di unspliced mRNA, un vettore di espressione mammifera codifica Rev (pCMV-Rev^NL4.3) è stato co-trasfettato con la costruzione del reporter fluorescenti (Figura 2). Questo costrutto unico reporter qui descritto è utile nella valutazione di alto-rendimento di trascrizione di HIV e intestature, senza la necessità di utilizzare vettori virali.

Protocollo

Nota: Procedure per la clonazione, trasformazione e sequenziamento sono discussi altrove^18,19. I protocolli qui iniziano dalla trasfezione di vettori di espressione mammifera (Figura 3).

1. transfezione delle cellule HEK293T con doppio colore Reporter costruire

1. Coltivare le cellule HEK293T nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL) in un 5% CO₂ incubatore a 37 ° C. Dopo lo scongelamento, gli esperimenti di cellule HEK293T passaggio 2 - 3 volte prima di utilizzarli nella transfezione. Questo darebbe il tempo di cellule per recuperare dalla procedura di scongelamento.
   Attenzione: Contaminazione del micoplasma di colture cellulari rimane un problema serio. Buona pratica di laboratorio e test di routine di colture cellulari sono essenziali per ridurre il rischio di contaminazione del micoplasma ed evitare diffusione²⁰.
2. Dividere le celle 1:2 un giorno prima della semina e trasferirli nel terreno DMEM fresco. Coltivare le cellule per 24 h in un 5% CO₂ incubatore a 37 ° C.
3. Il giorno prima di transfezione, rimuovere il supporto dal pallone dall'aspirazione e lavare le cellule con tamponato fosfato salino (DPBS) soluzione di Dulbecco priva di calcio (Ca^{2 +}) e magnesio (Mg^{2 +}) per rimuovere tracce di siero.
4. Pipettare 5 mL della soluzione di tripsina-EDTA (0.05% - 10 mM in PBS) nel recipiente di cultura e posizionarlo a 37 ° C in un incubatore di 5% CO₂ per 2-5 min.
5. Quando le cellule sono disconnessi, aggiungere 5 mL di DMEM supplementato con 10% (v/v) FBS ulteriormente inibire l'attività della tripsina che può danneggiare le cellule.
6. Risospendere delicatamente pipettando la sospensione cellulare su e giù per rompere i grumi.
7. Diluire le celle 01:10 in trypan blu macchia (0,4%).
8. Contare le cellule vive che non occupano trypan blue utilizzando un microscopio (obiettivo 10x) e un emocitometro.
9. Calcolare il numero di cellule vitali per millilitro prendendo la media del conteggio delle cellule e moltiplicandolo per 10.000 e per il fattore di diluizione (01:10) dal trypan blu macchia.
10. Piastra 2 x 10⁴ cellule in 100 μL di medium DMEM supplementato con 10% FBS senza antibiotici in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto per 24 h.
11. Per tutti i pozzetti, diluire 400 ng di pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng di pCMV-Rev^NL4.3 e 100 ng di pCMV-Tat101^AD8-bandiera DNA in 50 μL di mezzo libero del siero. Mescolare delicatamente. Per gli esperimenti senza Tat, utilizzare un vuoto abbinati Tat vettore pcDNA3.1 (-).
    Nota: Si consiglia vivamente l'uso di DNA privo di endotossina. Per questo, preparare il DNA privo di endotossina utilizzando un kit di purificazione dell'acido nucleico midi o maxiprep. Determinare la purezza di DNA misurando il rapporto di 260/280 OD, che dovrebbe essere compreso tra 1,7 e 1,9.
12. Mix il reagente del lipido delicatamente prima dell'uso, diluire 0.65 μL in 50 μL di mezzo libero del siero. Mescolare delicatamente e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
13. Combinare il DNA diluito con il reagente del lipido diluito.
14. Mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. La soluzione potrebbe apparire nuvolosa.
    Nota: Passare al punto 1.15. entro 30 min.
15. Pipettare 100 μL per pozzetto dei complessi lipidici reagente-DNA drop-wise in cima le cellule.
16. Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra.
17. Incubare la piastra per 5 h in una 5% CO₂ incubatrice umidificata a 37 ° C.
    1. Ogni miscela di reazione è sufficiente per la transfezione un singolo pozzo (96-well). Regolare la quantità e volume dei componenti secondo il numero di droga e combinazione che sarebbe stato testato e conti per pipettaggio variazioni. Tutte le condizioni sono solitamente testate in triplici copie.
    2. Transfect ulteriori pozzi con 100 ng di CMV-driven EGFP e DsRed-Express DNA plasmidico fini di compensazione.

2. trattamento di HEK293T Transfected le cellule con latenza agenti di retromarcia

Nota: Prima di ogni analisi, è possibile determinare lo stato fisiologico di ogni LRA misurando la vitalità delle cellule dopo l'esposizione ad alta e bassa della dose della droga con analisi delle cellule di proliferazione.

1. Diluire ciascuna LRA alla concentrazione di lavoro appropriato con il mezzo di crescita (ad esempio, 1 μM per JQ1(+)).
   Attenzione: Ricostituire i farmaci liofilizzati con il solvente appropriato a una concentrazione di 10 mM. Conservare Stock in tutti gli enti locali e regionali a-80 ° C in un'uso singola aliquota (5 µ l) per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
2. Attentamente aspirare mezzo di transfezione con un multicanale e sostituire con 100 μL contenente appropriato LRA (tabella 1). Aggiungere il terreno molto delicatamente lungo la parete del pozzo per evitare di staccare le cellule transfected HEK293T, che sono conosciute per staccare facilmente dalla superficie della placca di cultura.
3. Incubare la piastra per 48 h in una 5% CO₂ incubatrice umidificata a 37 ° C.

3. colorazione delle cellule transfettate con tintura di attuabilità risolvibile per analisi di citometria a flusso

Attenzione: Rimozione detriti e cellule morte è indispensabile per eliminare i falsi positivi e di ottenere risultati di altissima qualità.

1. Staccare le cellule nei mezzi usando 100 μL di tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto e pipettando delicatamente alti e Bassi (~ 5 volte) con un multicanale, evitando la bava dei media. Se necessario, staccare le cellule dalla piastra utilizzando 35 µ l per pozzetto di soluzione di tripsina-EDTA (0.05% - 10 mM in PBS) e incubare 5 min a 37 ° C, prima neutralizzazione con mezzo contenente siero.
2. Trasferire le cellule a una piastra a 96 pozzetti fondo V.
3. Girare le cellule per 5 min a 500 x g a 4 ° C, quindi aspirare accuratamente il medio/PBS senza toccare le cellule.
4. Lavare le cellule almeno 1 volta con 200 µ l di PBS gratis proteina/del siero.
5. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante inclinando la piastra e rimuovere il tampone di lavaggio senza toccare le cellule.
6. Preparare una soluzione di lavoro di attuabilità risolvibile colorante diluendo l'attuabilità tintura 1: 1000 in proteina/siero libero PBS. Preparare 50 µ l della macchia diluita per pozzetto.
   Nota: Attuabilità coloranti sono disponibili in una gamma di colori adatti per l'utilizzo con laser blu, rossi e violetto. Preparare una soluzione stock di attuabilità risolvibile tintura di risospensione un flaconcino di liofilizzato tintura (componente A) con 50 μL di DMSO anidro (componente B). Conservare a-20 ° C in un uso singola aliquota (1 μL), al riparo dalla luce.
7. Aggiungere 50 μL di colorante diluito vitalità ad ogni pozzetto e mescolare le cellule pipettando su e giù con un multicanale.
8. Macchia per 10-15 min a 4 ° C, al riparo dalla luce.
9. Lavare 1 - 2 volte con 150 µ l di tampone di lavaggio (PBS con 1% bovino dell'albumina di siero e 2 mM EDTA).
10. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
11. Fissare le cellule con 100 μL di preparati 1% formaldeide nel tampone di lavaggio per 10-15 min a 4 ° C al buio.
    Attenzione: La formaldeide è molto tossica. Preparare la soluzione di 1% di formaldeide in una cappa per evitare l'inalazione indossando guanti e occhiali di sicurezza per la protezione.
12. Lavare le cellule 1 - 2 volte con 100 μL di tampone di lavaggio.
13. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
14. Risospendere il pellet cellulare in 70 μL di tampone di lavaggio.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Fissa le cellule potrebbero essere conservate a 4 ° C al buio per l'analisi il giorno successivo il citofluorimetro.

4. EGFP e DsRed misure di citometria a flusso e analisi dei dati

Nota: Analizzare la trascrizione di HIV (% EGFP) e splicing (% DsRed) su un citometro a flusso. Filtrare il campione prima della corsa con un cellulare-setaccio di 70 μm o maglia di nylon 100 μm per evitare di intasare l'ugello.

1. Avviare il citometro e il computer almeno 10 minuti prima dell'uso per garantire laser scaldare.
2. Prima di eseguire i campioni e iniziare l'acquisizione dei dati, è necessario riempire il serbatoio di guaina con soluzione fisiologica 0,9% e assicurarsi che il serbatoio di scarico viene aggiunta una tavoletta di ipoclorito di sodio.
3. Controllare la cella di flusso per le bolle d'aria.
4. Verificare che i filtri e i rivelatori siano appropriati per l'esperimento.
   Nota: Per EGFP, l'utilizzo del laser blu (488 nm) e 530/30 passa-banda, mentre DsRed Express viene rilevato in modo ottimale utilizzando il laser giallo (561 nm) e 610/20 passa-banda. Un laser blu (488 nm) e passa-banda 610/20 può essere utilizzato anche per rilevare DsRed espressione.
5. Controllare il citometro prestazioni e sensibilità attraverso rivelatori eseguendo perle di calibrazione.
6. Regolare il forward (FSC-A) e tensioni (SSC-A) dispersione laterale con senza macchia campione affinché la popolazione principale è sullo schermo e chiaramente percepibile.
   Nota: FSC (luce diffusa diretta) è una misura della luce diffrazione in un angolo piatto, che dipende dal volume della cella (cella superficie o dimensione), mentre SSC (lato-sparsi luce) è una misura di diffrazione della luce in un angolo retto, che è proporzionale alla granularità cellulare e complessità interna.
7. Eseguire la compensazione manuale o automatica utilizzando i campioni di singolo-macchiato garantendo minimo spillover di EGFP + popolazione nella DsRed rivelatore e viceversa.
   Attenzione: Ai fini della compensazione, è necessario utilizzare un campione di cellule che esprimono ciascuno della proteina fluorescente colore singolo così come le cellule singolarmente colorate con il colorante di attuabilità risolvibile. Non utilizzare perline di compensazione FITC e PE per compensazioni di proteine fluorescenti EGFP e DsRed a causa di differenti caratteristiche spettrali. Controlli di compensazione dovrebbero essere abbastanza brillanti da risolvere popolazione positiva e negativa.
8. Creare trame e impostare le porte usando la fluorescenza meno uno (FMO) controlli.
9. Acquisire e registrare un minimo di 10.000 eventi di cellule vitali per campione. Eseguire gli esempi a media o bassa velocità per evitare doppietti passando per l'intercetta di laser. Utilizzare impulsi geometria gating come SSC-A contro SSC-H per eliminare doppietti. Verificare la stabilità della corsa tracciando tempo contro SSC-A per vedere come anche il flusso è durante l'esecuzione.
10. Alla fine della corsa, pulire la fluidica di citometria a flusso con detergenti concentrati poi acqua per 5 minuti ciascuno.
11. Arresto del sistema, eliminare i rifiuti e ri-riempire il serbatoio di guaina dopo l'acquisizione.
12. Analizzare i dati utilizzando un software di analisi dati di citometria a flusso. Escludere i detriti cellulari e ciuffo (doppiette) basato su dispersione avanti e laterali, quindi eliminare le cellule morte usando la macchia di tintura di redditività (negativo della popolazione = cellule vive). Identificare le cellule che esprimono EGFP e DsRed (Figura 4), così come la percentuale di prodotto impiombato DsRed /(DsRed + EGFP) (Figura 5).
13. Determinare l'effetto del LRA sulla trascrizione di HIV e splicing confrontando le cellule non trattate e le cellule esposte a individuo o una combinazione di enti locali e regionali (Figura 5).

Risultati

Risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 5 per l'espressione di HIV-1 unspliced (EGFP) e impiombato (DsRed) prodotti dopo il trattamento con l'inibitore bromodomain JQ1. Sia JQ1(+) e Tat ha aumentato significativamente la percentuale di cellule che esprimono EGFP (2.18 e 4.13 FC sopra DMSO rispettivamente; n = 3) indicativo di unspliced trascrizioni. Inoltre, JQ1(+) aumentato significativamente la percentuale di cellule esprimenti DsRed (46,6 FC...

Discussione

Data la difficoltà nel misurare la riattivazione del virus ex vivo, una vasta gamma di in vitro sono stati sviluppati modelli nel tempo al fine di studiare la latenza di HIV tra cui latente infettato linee a cellula T (J-Lats, ACH2, U1), modelli primari dell'infezione latente di riposo ( Modelli o ' Doherty, Lewin, Greene e Spina) o pre-attivato le cellule T CD4 + (Serafini, Marini, Planelles, Siliciano, modelli di Karn) con singolo turno o replica competente reporter virus²². Per modellare le co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)	ATCC	CRL-3216	Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)	Gibco	10569-010	+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum	Gibco	10099-141	Origin Australia
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%	Gibco	15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium	Gibco	31985-070	Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi	Marcherey-Nagel	740414.50
pEGFP-N1 plasmid	Clontech (TaKaRa)	6085-1	Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1	Clontech (TaKaRa)	632429	Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed	Addgene	115775
pCMV-RevNL4.3	Addgene	115776
pCMV-Tat101AD8-Flag	Addgene	115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore	67-68-5
JQ1(+)	Cayman Chemical	11187	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)	Cayman Chemical	11232	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	16561-29-8	Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)	Remel	HA15/R30852701	Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)	Cayman Chemical	10009929	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)	TRC	P180500	Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	63581
Venor GeM Classic	Minerva Biolabs	11-1100	Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa	BD Biosciences		Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II	BD Biosciences		Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34976	Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
EDTA 0.5M pH8	Gibco	15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)	Chem-Supply	FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)	BD Biosciences	559123	3.0 - 3.4 mm
Sheath solution	Chem-Supply	SA046	90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs	Guest Medical	H8801	Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90	Decon Laboratories Limited	N/A	Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)	Labco	SODHYPO-5L	Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x	MPBio	IM76670	Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)	Corning	430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)	Costar	3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)	Costar	3896
Centrifuge tubes (10 mL)	SARSTEDT	62.9924.284	100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)	CellStar	227261	30x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Corning Axygen	MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile	Corning	CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile	Corning	CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile	Corning	CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile	Corning	CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap	Corning	352235	12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh	SEFAR	03-100/32	100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk	BIO-RAD	2239391	microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap	Corning	352008	12x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes	Corning	352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)	ProSciTech	SVZ4NIOU	3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)	Grale Scientific	HCS2026	20 x 26 mm
Microscope	Nikon TMS	310528
Centrifuge 5810R refrigerated	Eppendorf	5811000487	with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader	BMG Labtech	N/A	Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
FACS Diva	BD Biosciences		Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo	FlowJo	FlowJo 10.4.2	Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega	BMG Labtech		FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data Analysis	BMG Labtech	MARS	FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel	Microsoft	Excel:mac 2011	version 14.0.0
Prism	GraphPad	Prism 7	version 7.0c