JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

Abstract

HIV נותר ללא מרפא בשל קיומה של מאגר של תאים זה בנמלים טופס החבויים ויציבה של הנגיף, אשר נשאר בלתי נראה המערכת החיסונית, לא מכוון על ידי טיפול תרופתי הנוכחי (עגלה). שעתוק ו שחבור הוכחו לחזק את השהיה HIV-1 בנח תאי CD4 + T. היפוך של השהיה על ידי שימוש השהיה סוכנים היפוך (LRAs) הגישה "הלם ולהרוג" נחקר בהרחבה, בניסיון לטהר את המאגר הזה, אבל עד כה לא הראה כל הצלחה בניסויים קליניים עקב חוסר התפתחות נאותה קטנים מולקולות יכול ביעילות perturb את המאגר הזה. פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה אמינה ויעילה הערכת השהיה היפוך סוכנים (LRAs) ב- HIV שעתוק של שחבור. גישה זו מבוססת על השימוש הכתב צבע כפול מונחה משמאל לימין בו זמנית יכול למדוד את ההשפעה של חשבון גמלאות אישי על שעתוק ו שחבור על ידי cytometry זרימה. הפרוטוקול המתואר כאן מספיקה עבור תאים חסיד, כמו גם את התאים ההשעיה. זה שימושי לבדיקת מספר רב של תרופות במערכת תפוקה גבוהה. השיטה היא טכנית פשוטה ליישום וחסכונית. בנוסף, השימוש של cytometry זרימה מאפשר להערכת הכדאיות התא, ובכך תרופות רעילות באותו זמן.

Introduction

למרות טיפול תרופתי ארוך טווח יעיל, HIV נמשכת במצב נסתר כמו provirus משולב בזיכרון CD4 + T תאים1. המבנה כרומטין של HIV-1 5' מסוף זמן חוזר (משמאל לימין) יזם שינויים epigenetic היסטון מתילציה ו deacetylation על ידי ה-DNA methyltransferases (DNMT) ו היסטון deacetylases (HDAC) הם מנגנוני חשוב המוביל דיכוי גנים ברמת השעתוק ובכך השהיה פוסט-אינטגרציה2,3. מגוון גדול של סוכנים היפוך השהיה (LRAs) נחקר על היעילות שלהם לעודד ייצור וירוס במבחנה, לחשוף ויוו מן נגוע מנוחתו CD4 + T תאים4,5,6,7 ,8. בין LRAs נבדק, HDACi (מעכבי HDAC), מעכבי bromodomain ההימור (בו בטיס) זירוז כרומטין decondensation ושחרור של b גורם התארכות שעתוק חיובי (P-TEFb) בהתאמה, שמוביל הבאים להקל על תעתיק דיכוי-5' LTR והפעלה של HIV ביטוי9,10,11,12,13. עם זאת, סדר הגודל של הפעלה מחדש מושגת על ידי אלה LRAs היה מוגבל רק עלייה צנועה הקשורים תא unspliced HIV mRNA (אותנו RNA), מעידה על שעתוק ויראלי, נצפתה ex-vivo14,15. חשוב לציין, LRAs אלה גם נכשל לזירוז ירידה בשכיחות של תאים נגועים לחשוף.

הביטוי HIV עשוי מוגבלת עוד יותר באמצעות splicing לא יעיל16 , כמו גם פגמים גרעיני הייצוא של הכפל משולבים HIV RNA (MS RNA)17. לפיכך, נדרשים זיהוי שיעורים חדשים של LRAs זה יותר חזקות והוא יכול להשפיע על היבטים שונים של נגיף אינטגרציה שלאחר הייצור. בנוסף, נדרש הפיתוח של מבחני הרומן המסייעים הגדרת תרכובות האופטימלית להפוך ביעילות את זמן השהיה.

. הנה, פרוטוקול מוצג, אשר משתמשת בגישה תפוקה גבוהה להערכה תפקודית של ההשפעה של התערבויות על שעתוק מונחה HIV LTR ו שחבור. בקצרה, דואלי מונחה-LTR חדש צבע הכתב מערכת pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (איור 1) משמש כדי להעריך HIV הפעלה מחדש על ידי cytometry זרימה. כתבת פלורסנט, הביטוי של HIV unspliced mRNA (4kb) מוביל לביטוי משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP), ואילו הביטוי של mRNA משולבים (2 kb) יוביל ביטוי חלבון פלואורסצנטי Discosoma sp. אדום (DsRed). בקצרה, השתמשנו של חלבון כימרי פלורסנט Env-EGFP, gp140unc. ? EGFP, איפה רצף קידוד של EGFP בוצעה במסגרת עם צורה cleaved האו ם, קטום של המעטפה (מעטפה). הוכנסו שינויים כדי ablate האתר המחשוף מונע את הדיסוציאציה של מעטפה עבה לתוך gp120, gp41-EGFP, וכדי לעגל את החלבון gp160 לפני התחום transmembrane יצירת אנלוגי Env מסיסים, המאפשרת את הקיפול הנכון, ביטוי של EGFP. על הביטוי בתוך תא, Rev. רגישה את הגרעין איפה זה שמתווכת גרעיני cytoplasmic הייצוא של 4 kb env mRNA דרך האינטראקציה עם הרכיב להגיב rev (הכנה). העיגול של מעטפה לא מתפשרים על הכנה, הנמצא בין gp120, gp41 A7 3' אחוי באתר. במערכת זו, החדרת ב- HIV-1 אחוי התורם 4 (SD4), אחוי מקבל 7 (SA7) תוצאות בייצור של 2 קילובתים mRNA קידוד חלבון Rev פונקציונלי נקטע בנקודת חומצת אמינו 38 דבוקה חלבון פלואורסצנטי DsRed, RevΔ38-DsRed. בקצרה, DsRed הוכנס לתוך אקסון 2nd של Rev-חומצת אמינו 38 מאת חפיפה סיומת18. כדי להקל על הייצוא הגרעין של unspliced mRNA, וקטור ביטוי בתרבית של קידוד Rev (pCMV-RevNL4.3) היה שותף transfected עם הבונה כתב פלורסנט (איור 2). המבנה הזה, כתב ייחודי המתוארים כאן הוא שימושי תפוקה גבוהה הערכה של HIV שעתוק שחבור, ללא הצורך להשתמש וקטורים ויראלי.

Protocol

הערה: נהלי שכפול, שינוי, רצף הם דנו במקום18,19. הפרוטוקולים בזאת מתחילים מ תקנים של הווקטורים בתרבית של הביטוי (איור 3).

1. תרביות תאים תאים HEK293T עם כתבת צבע כפול לבנות

  1. לטפח HEK293T תאים הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין (100 U/mL), סטרפטומיצין (100 μg/מ"ל) בחממה2 CO 5% ב 37 º C. לאחר מפשיר, מעבר תאים HEK293T 2 - 3 פעמים לפני השימוש בהם תקנים ניסויים. זה ייתן את הזמן תאים כדי להתאושש מההליך שהביקושים.
    התראה: Mycoplasma זיהום של תרביות תאים נשאר בעיה רצינית. מעבדה ובדיקות שגרתיות של תרביות תאים חיוניים כדי להקטין את הסיכון של זיהום mycoplasma למנוע דיפוזיה20.
  2. לפצל את התאים 1:2 יום אחד לפני זריעה, להעביר אותם לתוך בינוני DMEM טריים. לטפח את התאים עבור 24 שעות ביממה בחממה2 CO 5% ב 37 º C.
  3. יום לפני תרביות תאים, להסיר את המדיום של הבקבוק על ידי השאיפה ולשטוף את התאים עם פוספט buffered (DPBS) תמיסת Dulbecco חינם של סידן (Ca2 +), מגנזיום (Mg2 +) כדי להסיר שאריות של סרום.
  4. לוותר על 5 מ של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% - 10 מ מ ב- PBS) לתוך כלי תרבות ולמקם אותו ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 5% למשך 2-5 דקות.
  5. כאשר התאים מנותקים, הוסף 5 מ של DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS נוסף לעכב פעילות טריפסין אשר עלולה לגרום נזק לתאים.
  6. Resuspend בעדינות על-ידי pipetting התליה תא למעלה ולמטה כדי לשבור את הגושים.
  7. לדלל 1:10 תאים ב- trypan blue הכתם (0.4%).
  8. לסמוך על תאים חיים זה לא תופסים trypan blue באמצעות מיקרוסקופ (המטרה x 10) ו- haemocytometer.
  9. לחשב את מספר התאים קיימא למיליליטר על-ידי לקיחת הממוצע של ספירת הכפלת זה 10,000, על-ידי הגורם דילול (1:10) מ trypan blue כתם.
  10. לוחית רישוי 2 x 10 תאים4 ב 100 μL בינוני DMEM בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה עבור 24 שעות.
  11. עבור כל טוב, לדלל 400 ננוגרם של pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng של pCMV-RevNL4.3 ו- 100 ננוגרם של pCMV-Tat101AD8-דגל DNA ב μL 50 בינוני חינם סרום. מערבבים בעדינות. לניסויים ללא Tat, להשתמש שהותאמו ריק Tat וקטור pcDNA3.1 (-).
    הערה: השימוש של DNA ללא אנדוטוקסין מומלץ מאוד. בשביל זה, להכין ללא אנדוטוקסין DNA באמצעות ערכת טיהור חומצת גרעין midi או maxiprep. לקבוע את הטוהר DNA על ידי מדידת היחס OD 260/280, אשר צריכה להיות בין 1.7 1.9.
  12. לערבב הכימית השומנים בעדינות לפני השימוש, ולאחר מכן לדלל 0.65 μL ב μL 50 בינוני חינם סרום. לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. לשלב את ה-DNA מדולל עם הכימית השומנים מדולל.
  14. לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. הפתרון עשוי להופיע מעונן.
    הערה: המשך לצעוד 1.15. בתוך 30 דקות.
  15. לוותר על μL 100 לכל טוב של מתחמי ריאגנט-DNA השומנים drop-wise על גבי התאים.
  16. מערבבים בעדינות במוזיקת את הצלחת אחורה וקדימה.
  17. דגירה את הצלחת. בשביל 5 ש ח בחודש 5% CO2 humidified החממה ב 37 º C.
    1. כל תערובת התגובה מספיקה עבור תרביות תאים ובכן יחיד (96-ובכן). התאימו את כמות הנפח של רכיבים לפי מספר תרופות ושילוב זה להיבדק ואת חשבונות עבור וריאציות pipetting. כל התנאים נבדקים בדרך כלל ב- triplicates.
    2. Transfect בארות נוספות עם 100 ננוגרם של מונחי-CMV פלסמיד EGFP ו- DsRed-אקספרס DNA למטרות פיצויים.

2. טיפול Transfected HEK293T תאים עם השהיה היפוך סוכנים

הערה: לפני כל assay, לקבוע מצב פיזיולוגי כל איירה על ידי מדידת הכדאיות של התאים לאחר חשיפה למינון גבוה ונמוך של התרופה עם תא התפשטות וזמינותו.

  1. לדלל כל איירה לריכוז עבודה המתאימה עם מדיום הגידול (למשל, μM 1 עבור JQ1(+)).
    התראה: לשקם את הסמים lyophilized עם הממס המתאים כדי ריכוז של 10 מ מ. החנות כל המניות LRAs ב-80 מעלות צלזיוס אחת להשתמש aliquot (5 μL כל אחד) על מנת להימנע חזר מחזורי מפשיר לקפוא.
  2. בזהירות תשאף תרביות תאים בינוני עם רב-ערוצי והחלף 100 בינוני μL המכיל המתאים איירה (טבלה 1). הוסף בינוני מאוד בעדינות לצד הקיר היטב כדי למנוע ניתוק התאים HEK293T transfected, אשר ידועים להתנתק בקלות מהמשטח צלחת תרבות.
  3. דגירה את הצלחת. בשביל 48 ש ח בחודש 5% CO2 humidified החממה ב 37 º C.

3. צביעת תאי Transfected עם הכדאיות ניתן לתיקון צבע לניתוח Cytometry זרימה

התראה: הסרת תאים מתים ופסולת חיוני כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות וכדי להשיג תוצאות באיכות הגבוהה ביותר.

  1. ניתוק התאים לתוך המדיה באמצעות μL 100 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לכל טוב ועל ידי בעדינות pipetting שיהיה (~ 5 פעמים) עם רב-ערוצי תוך הימנעות קצף של המדיה. אם יש צורך, ניתוק התאים מהצלחת באמצעות 35 µL לאדם טוב של טריפסין-EDTA פתרון (0.05% - 10 מ מ ב- PBS) ו המקננת 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לפני נטרול בינונית המכיל סרום.
  2. העבר את התאים צלחת V-התחתון 96-ובכן.
  3. לסובב את התאים עבור 5 דקות ב x 500 גרם ב 4 ° C, אז בזהירות וארוקן את בינוני/PBS בלי לגעת בתאים.
  4. לשטוף את התאים זמן לפחות 1 עם μL 200 ל- PBS חינם חלבון/סרום.
  5. צנטריפוגה ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע על-ידי הטיית הלוח והסרה המאגר שטיפת בלי לגעת בתאים.
  6. הכן הפתרון עובד של צבע הכדאיות ניתן לתיקון על ידי דילול 1:1000 לצבוע את הכדאיות ב- PBS חינם חלבון/סרום. להכין µL 50 של הכתם מדולל לכל טוב.
    הערה: הכדאיות צבעים זמינים במגוון צבעים מתאים לשימוש עם לייזרים כחול, אדום וסגול. להכין פתרון מניות של צבע הכדאיות שניתן לתקן על-ידי resuspending בקבוקון אחד של לצבוע lyophilized (רכיב A) עם 50 μL נטול מים דימתיל סולפוקסיד (רכיב B). חנות ב-20 ° C בשימוש אחד aliquot (1 μL כל), מוגן מפני האור.
  7. להוסיף 50 μL של צבע מדולל הכדאיות כל טוב ומערבבים את התאים על-ידי pipetting למעלה ולמטה עם רב-ערוצי.
  8. . הכתם למשך 10-15 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני האור...
  9. לשטוף 1 - 2 פעמים עם 150 μL שטיפת מאגר (PBS עם EDTA אלבומין ו- 2 מ מ פרה 1%).
  10. צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  11. לתקן את התאים μL 100 פורמלין 1% שזה עתה הוכנו במאגר שטיפת למשך 10-15 דקות ב 4 ° C בחושך.
    התראה: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד. להכין 1% פתרון פורמלדהיד ברדס fume כדי למנוע שאיפת בעת לבישת כפפות ומשקפיים בטיחות להגנה.
  12. לשטוף את התאים 1 - 2 פעמים עם 100 μL שטיפת מאגר.
  13. צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
  14. Resuspend בגדר תא ב- 70 μL שטיפת המאגר.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה. תאים קבוע עשויה להיות מאוחסנת ב 4 ° C בחושך לניתוח למחרת על cytometer הזרימה.

4. EGFP ומדידות DsRed על ידי Cytometry זרימה וניתוח נתונים

הערה: לנתח HIV שעתוק (% EGFP) ו- splicing (% DsRed) על cytometer זרימה. לסנן את הדגימה לפני ההפעלה עם תא-מסננת 70 μm או 100 μm רשת ניילון כדי להימנע שחוסמים את הזרבובית.

  1. להתחיל את cytometer ואת המחשב לפחות 10 דקות לפני השימוש, כדי להבטיח לייזרים להתחמם.
  2. לפני הפעלת דגימות, מתחיל קירור והקפאה, למלא את מיכל הנרתיק עם תמיסת 0.9%, לוודא לוח נתרן תת-כלורי מתווספת למיכל פסולת.
  3. בדוק את התא זרימה בועות אוויר.
  4. ודא גלאי ומסננים המתאימים לניסוי.
    הערה: EGFP, לשימוש של לייזר כחול (488 ננומטר), 530/30 bandpass, בעוד DsRed אקספרס מזוהה בצורה אופטימלית באמצעות לייזר צהוב (561 ננומטר) ו bandpass 610/20. לייזר כחול (488 ננומטר) 610/20 bandpass יכול לשמש גם כדי לזהות ביטוי DsRed.
  5. בדוק את הביצועים cytometer ואת רגישות על פני גלאי על-ידי הפעלת כיול חרוזים.
  6. התאם פארווערטס (FSC-A) ואת הצד המתחים פיזור (האס-A) עם מוכתם. דוגמה כך האוכלוסייה העיקרית היא על המסך, ניכרת בבירור.
    הערה: FSC (אור מפוזר-קדימה) הוא מידה של אור עקיפה ב זווית שטוחה, אשר תלויה הנפח של התא (תא שטח או גודל), בעוד האס (צד-מפוזרים אור) היא מדידה של שבירת אור ב זווית ישרה, אשר הוא יחסי תא צפיפות והמורכבות פנימי.
  7. לבצע פיצוי הידנית או האוטומטית באמצעות דגימות שהוכתמו יחיד הבטחת והתאמת מינימלי מאוכלוסיית EGFP + גלאי DsRed או להיפך.
    התראה: למטרות פיצויים, להשתמש במדגם של תאים המבטאים כל אחד חלבון פלואורסצנטי צבע אחד, כמו גם תאים ביחידים מוכתם לצבוע הכדאיות ניתן לתיקון. אל תשתמש FITC ו- PE חרוזים פיצוי עבור EGFP ו- DsRed חלבונים פלורסנט פיצויים בשל מאפיינים ספקטרלי שונים. פקדים הפיצוי צריך להיות מספיק פיקח כדי לפתור האוכלוסייה חיוביים ושליליים.
  8. יצירת מגרשים ולהגדיר את השערים בעזרת קרינה פלואורסצנטית מינוס אחד פקדים (FMO).
  9. לרכוש ולהקליט למינימום של 10,000 אירועים תא קיימא עבור דגימה. דוגמאות לרוץ במהירות בינונית או נמוכה כדי להימנע doublets עובר דרך נקודת החיתוך בלייזר. השתמש הדופק הגיאומטריה gating כגון האס-A מול האס-H כדי לחסל את doublets. לבדוק את היציבות המרוץ ידי הזמן נגד האס-A כדי לראות כיצד גם זרימת היא במהלך הריצה.
  10. בסוף המרוץ, לנקות את פלואידיקה cytometry זרימה עם חומרי ניקוי מרוכז ואז מים במשך 5 דקות.
  11. לכבות את המערכת, להשליך את הפסולת ולמלא מחדש את מיכל הנרתיק לאחר הרכישה.
  12. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח נתונים cytometry זרימה. לא לכלול שאריות תאים, סבך (doublets) המבוסס על פיזור קדימה ואת הצד, ואז לחסל את התאים המתים בעזרת כתם צבע הכדאיות (שלילית האוכלוסייה = תאים חיים). לזהות את התאים לבטא EGFP ו- DsRed (איור 4), כמו גם האחוזים של המוצר משולבים DsRed /(DsRed + EGFP) (איור 5).
  13. לקבוע את ההשפעה של אתה בטוח על HIV שעתוק ו שחבור על-ידי השוואת לא מטופל תאים והתאים נחשף הפרט או שילוב של LRAs (איור 5).

תוצאות

נציג התוצאות מוצגות באיור 5 עבור הביטוי של HIV-1 unspliced (EGFP), משולבים המוצרים (DsRed) בעקבות טיפול עם מעכבי bromodomain JQ1. הן JQ1(+) והן בלשכת המידע לתיירים הגדילה משמעותית את אחוז התאים לבטא EGFP (FC 2.18 ו 4.13 מעל דימתיל סולפוקסיד בהתאמה; n = 3) מעידה על תעתיקים unspliced. יתר על כן, JQ1(+...

Discussion

לאור הקושי במדידת הפעלה מחדש וירוס ex-vivo, מגוון רחב של במבחנה מודלים שפותחו במהלך הזמן ללימוד השהיה HIV כולל לחשוף נגוע תא T-קווים (J-השרירים, ACH2, U1), מודלים העיקרי של דלקת סמויה של נח ( מודלים O'Doherty, לוין, גרין, Spina) או תאי CD4 + T מופעל מראש (Sahu, מריני, Planelles, Siliciano, מודלים Karn) עם יחיד עגול או שכפול כתב מוכ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט גרנט APP1129320, תוכנית מענק APP1052979 NHMRC של אוסטרליה. אנו מודים ד ר אדם וויטלי, ד ר מרינה אלכסנדר, ד ר ג'ני ל' אנדרסון ולי י' מישל על מתן בונה חיוני וייעוץ סיומו המוצלח של עבודה זו. אנו מודים גם הצוות DMI זרימה מתקן עבור שלהם ייעוץ וסיוע נדיב בשמירה על cytometer זרימה השתמשו במחקר זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells)ATCCCRL-3216Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serumGibco10099-141Origin Australia
Penicillin-StreptomycinSigmaP4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumGibco14190-136
Trypan blue Stain, 0.4%Gibco15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum mediumGibco31985-070Serum free medium
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
pEGFP-N1 plasmidClontech (TaKaRa)6085-1Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-)Cayman Chemical11232Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA)RemelHA15/R30852701Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN)TRCP180500Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow cytometry reagents
LSR FortessaBD BiosciencesFlow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR IIBD BiosciencesFlow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum AlbuminSigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks)BD Biosciences5591233.0 - 3.4 mm
Sheath solutionChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L water
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/AConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution)LabcoSODHYPO-5LConcentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7xMPBioIM76670Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented)Corning430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid)Costar3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)Costar3896
Centrifuge tubes (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterileCorningCLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterileCorningCLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterileCorningCLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterileCorningCLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer capCorning35223512 x 75 mm style, 70 mm
Nylon MeshSEFAR03-100/32100 mm
Titertube Micro test tubes, bulkBIO-RAD2239391microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without capCorning35200812x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test TubesCorning352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser)Grale ScientificHCS202620 x 26 mm
MicroscopeNikon TMS310528
Centrifuge 5810R refrigeratedEppendorf5811000487with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate readerBMG LabtechN/APlate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
NameCompanyCatalog NumberComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesFlow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data AnalysisBMG LabtechMARSFLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011version 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7version 7.0c

References

  1. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  2. Khoury, G., et al. Ch. 8. HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine. 1075, (2018).
  3. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  4. Archin, N. M., et al. HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat. Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).
  5. Elliott, J. H., et al. Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy. PLoS Pathogens. 10, (2014).
  6. Leth, S., et al. Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial. The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).
  7. Rasmussen, T. A., et al. Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial. The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).
  8. Søgaard, O. S., et al. The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo. PLoS Pathogens. 11, (2015).
  9. Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein. Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).
  10. Boehm, D., et al. BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism. Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).
  11. Contreras, X., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells. Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).
  12. Rasmussen, T. A., et al. Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).
  13. Wei, D. G., et al. Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071 (2014).
  14. Blazkova, J., et al. Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy. Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).
  15. Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo. Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).
  16. Yukl, S. A., et al. HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing. Science Translational Medicine. 10, (2018).
  17. Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells. PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).
  18. Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor. Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).
  19. Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs. Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).
  20. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).
  21. Khoury, G., et al. HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications. Retrovirology. 15 (1), 36 (2018).
  22. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  23. Dahabieh, M. S., et al. Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB. Retrovirology. 11, 17 (2014).
  24. Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification. Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).
  25. Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells. PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955 (2015).
  26. Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements. Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).
  27. Reeves, M., Sinclair, J. Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).
  28. Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation. EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).
  29. Kula, A., et al. Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function. Retrovirology. 8, 60 (2011).
  30. Kula, A., Marcello, A. Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression. Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).
  31. Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression. RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).
  32. Zolotukhin, A. S., et al. PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).
  33. Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay. Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).
  34. Cary, D. C., Peterlin, B. M. Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure. F1000Res. 5, (2016).
  35. Han, Y., et al. Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes. Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).
  36. Laird, G. M., et al. Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations. Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).
  37. Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143HIVEGFP DsRed

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved